光聲成像聯合光熱治療在肝癌診治中的應用進展

莊填宇，焦嘉澎，連韻鈺，方馳華，黃振駒，曾 寧

1南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510282；2南方醫科大學珠江醫院肝膽一區//廣東省數字醫學臨床工程技術研究中心，廣東 廣州510282

肝癌在世界范圍內發病率排名第6位，是癌癥相關死亡的第2大因素［1］。在歐洲和美國，肝癌的5年生存率為18%，其死亡率僅次于胰腺癌［2］。中國肝癌患者的總體5年存活率僅為12%。雖然已經采取了各種診斷和治療策略，包括級聯篩查和免疫治療，但肝癌的總體發病率和死亡率仍較高［3］。開發針對肝癌診治的新型技術對于提高患者生存率及預防肝癌復發具有重要意義。光聲成像結合了光學成像和超聲成像的優點，能夠有效地了解肝癌內部構造和代謝；基于靶向納米探針的光熱治療有著精確和高效的優點，這兩項技術的聯合為肝癌的診治提供一種有效的方法，且使用一種高效光聲材料就能同時實現對早期肝癌的診斷和治療［4］。本文主要對光聲成像技術、光熱治療的基本概況進行介紹，綜述了光聲成像技術聯合光熱治療所需的納米診療劑分別在成像與治療的作用，闡述了聯合技術在早期肝癌診治中的可行性和優勢。

1 概述

1.1 光聲成像與光熱治療

光聲成像原理是用激光照射到生物組織上，引起組織局部溫度的迅速上升進而引起熱彈性膨脹，向外輻射出超聲波，稱為光聲信號，計算機利用信息處理技術將接收到的信息重建為可視化的二維或三維圖像。傳統的超聲成像通過分辨不同組織反射的回波和時間的關系來進行成像，其本質是利用生物組織之間的超聲性質差異，雖然能提供更大的成像深度，但對比度和分辨率往往不盡人意；且腫瘤與正常組織的超聲性質十分相似，需要借助超聲成像劑實現高分辨率成像進行分辨［5］。光聲成像技術解決了光學成像低深度和超聲成像低分辨率的問題，且因其高兼容性得以與其他的醫學影像技術相結合，組成多模態光聲分子成像技術，進而開展更加精確的診斷與治療，有著廣闊的醫學前景。

光熱治療以光熱轉導劑作為治療媒介，利用各種靶向性識別技術主動或被動地使其在腫瘤組織富集，外部再加以組織穿透力較強的近紅外光源照射，光熱轉導劑能將光線中的能量轉化為熱量從而使周圍環境的溫度升高。腫瘤血管發育不完善，無法像正常血管遇熱擴張，讓血流帶走熱量，所以腫瘤組織內溫度更容易蓄積，使得溫度高于正常組織，因此能夠利用高溫殺滅癌組織中的細胞［6］。除了直接殺滅癌細胞外，光熱治療還能抑制腫瘤的多藥耐藥性，降低癌癥復發的可能性，提高化療成功率，是一種高等特異性、精確時空選擇性的高效非侵入性新型腫瘤治療方式［7］。

1.2 診療一體化

診療一體化是將檢測診斷、治療以及監測治療效果相結合的一種新型生物醫學技術［4］。于腫瘤治療而言，如果缺少成像技術對腫瘤的定位和對藥物的引導，則難以實現治療的精確性，且無法做到對療效的監測。同時實現成像和治療的納米材料能夠實現早期肝癌診療一體化平臺，在精確定位腫瘤、清晰勾勒腫瘤輪廓后，在納米材料在腫瘤中達到最佳聚集效果時通過近紅外光照射使局部溫度升高，誘導蛋白質變性和細胞膜破裂，并保持周圍組織的正常［6,8］，同時還需要通過監控納米材料和局部腫瘤微環境來判斷療效［5］。光聲成像材料和光熱治療劑是有交叉的，當納米材料在紅外波段有強吸收和一定的光熱轉換效率，同時實現光聲成像和光熱治療，該納米材料就能應用于光聲成像引導光熱治療的診療一體化中（表1）。特別是用于第二近紅外區（NIR-Ⅱ）光聲成像的納米材料，相比第一近紅外區有著更高的空間分辨率和信噪比，成像質量得到改善［8］。

表1 納米材料在光聲成像和光熱治療中的應用Tab.1 Application of nanomaterials in photoacoustic imaging and photothermal therapy

2 提高納米材料在腫瘤的富集度的應用研究

光熱治療的療效很大程度取決于納米診療劑在腫瘤組織中的富集濃度，只有當腫瘤中納米診療劑水平最高時激活光照治療才能達到最好的腫瘤殺傷效果，而為了防止光熱治療過程中正常組織的損傷，應盡可能使納米診療劑聚集在腫瘤組織中，降低循環中的納米診療劑濃度［21］。光聲成像能夠把診斷腫瘤與實時監測納米診療劑在體內聚集效果結合到一起，一些研究中指出，光聲信號的強度和納米診療劑的濃度呈正比，能夠很好地描繪腫瘤的輪廓與范圍［5,8］。納米診療劑在體內代謝是動態的過程，注入體內后先會在循環中被單核吞噬細胞系統（MPS）消耗，未被消耗的部分再通過靶向作用在腫瘤組織富集，達到高峰后逐漸被代謝，通過腎臟、肝臟等方式被清除［22］。因此，提高光熱治療療效重點在于實現納米診療劑在體內長循環、靶向腫瘤部位和腫瘤內長保留［23］。

2.1 納米材料的主動靶向

有研究指出，納米診療劑在腫瘤中的富集依賴主動靶向和被動靶向兩種方式[24]。后者的機制是納米材料在腫瘤組織中的高滲透長保留效應（EPR），在后文將著重講述。前者依靠的是結合在納米藥物上的官能團被腫瘤組織的靶點配體所吸引，進而達到主動靶向的目的。在腫瘤組織中，蛋白質、多肽、腫瘤微環境物質等都能成為主動靶向的標志物［24］。有學者研究合成PLACPDI NPs，通過特異性識別ASGPR受體進入人肝癌細胞株HepG2細胞［5］。通過PLAC-PDI NPs與HepG2細胞共培養并檢測信號，發現光聲信號強度提升了13.7倍。AFP是HepG-2的標志物，高振等［25］合成金納米籠-量子點-Anti-AFP復合探針，通過抗原抗體反應使探針與肝癌細胞特異性結合，發揮靶向光熱治療殺傷作用。因此，開發肝癌細胞特異性標志物對研究納米診療劑有很大意義。

2.2 納米材料的被動靶向

肝癌腫瘤組織的EPR效應是針對納米粒子而言的，適當大小的納米粒子在腫瘤組織中有相比于正常組織更高的富集量和更長的滯留時間，其本質是腫瘤血管網和正常血管的差異。腫瘤細胞的增殖周邊促進了新的、不規則的血管的快速發展，這些血管呈現不連續的上皮，毛細血管窗口大小200～2000 nm，甚至缺乏正常血管結構的基底膜［26-27］。而正常毛細血管窗口一般小于2 nm，因此尺寸在20～2000 nm的納米診療劑更易富集在腫瘤血管網中［28］。腫瘤的EPR效應還能讓材料被動靶向富集到腫瘤中，但一些研究表示單靠EPR效應進入腫瘤的小尺寸納米診療劑，并不能使其在腫瘤中達到一個理想的治療濃度［29］，因為小尺寸的納米材料盡管有著更高的腫瘤滲透力，但清除速度較快，難以達到一個有效的治療濃度，而大尺寸的納米材料雖然能夠在腫瘤中保留更長時間，但在循環中易被MPS系統清除。因此需要納米材料在循環中有著小尺寸，進入腫瘤后則維持大尺寸，對于如此矛盾的問題，學者們利用小尺寸納米探針聚集的方法來解決。有學者設計出了一款光敏金納米粒子，可在激光照射下，金納米顆粒之間發生強烈的耦合反應，通過光聲成像和808 nm的激光照射，驗證了交聯型的金納米顆粒聚集體相比于非交聯的顆粒有著更強的光聲信號和更高的光熱轉換效率［30］。此外，還有學者會利用特殊的腫瘤微環境使小尺寸的納米診療劑在腫瘤中組合，實現納米探針尺寸的智能調控［31］。

2.3 減少納米組織在腫瘤外部位的消耗

全身給藥的納米粒子在到達目標并參與光熱治療之前往往會遇到許多生物屏障。這些屏障包括單核吞噬細胞系統的清除、穿透血管進入腫瘤、抵抗腫瘤中的腫瘤壞死因子擴散以及由于腫瘤內壓力升高將腫瘤壞死因子排出腫瘤等。納米診療劑最主要的清除原因是單核吞噬細胞系統，導致血液循環時間短，目前的解決辦法多為納米診療劑的表面修飾［6］。納米診療劑的表面電荷是影響循環時間和腫瘤吸收的因素之一，但矛盾的是兩性離子雖然增加了腫瘤的攝取作用，也使其更易被MPS系統識別吞噬，納米粒子的電中性表面增加其在循環系統的穩定型，但也會阻礙腫瘤細胞的吸收［32］。有研究通過層層自組裝技術，使Pt-Cu表面均勻覆蓋帶正電荷的聚賴氨酸和帶負電荷的透明質酸，其電中性可以保護納米診療劑不被MPS識別吞噬［8］，腫瘤組織中的透明質酸酶降解負電透明質酸層，使其電荷變成聚賴氨酸的正電，進入腫瘤細胞過程中易出現溶酶體逃逸現象，增加腫瘤細胞對納米診療劑的攝取。聚乙二醇（PEG）化能夠提高納米診療劑在循環中的穩定性，但會降低腫瘤細胞的攝取量，被稱為PEG窘境，且多次注射PEG修飾的納米診療劑會增加血液中的抗PEG抗體，出現加速血液清除現象［33-34］。

3 光聲成像技術聯合光熱治療在肝癌治療中的作用

3.1 調節腫瘤微環境

腫瘤周圍和內部新血管的形成是腫瘤生長的關鍵步驟。血管生成增加了腫瘤的血液和營養供應，因此加速了腫瘤的生長，增殖和擴散。在正常的血管生成過程中，促血管生成信號和抗血管生成信號的平衡受到嚴格調節，因此新血管迅速成熟和穩定。然而，在腫瘤血管生成過程中，這種平衡沒有得到維持，新的血管不斷形成?；谶@些差異，腫瘤血管生成是腫瘤診斷的重要標志［35］。而光聲成像能夠對新生血管形成和對微血管構筑進行成像，從而建立了一種研究腫瘤血管生成的方法。有團隊通過將環精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽與GNS結合，連續激光照射驗證了RGD-GNS對荷瘤小鼠的治療能力。在RGD-GNS組中，腫瘤的分子印跡圖像顯示出顯著增強的信號和更好的圖像對比度。光熱治療后，RGD-GNS治療組出現對比度降低和血管抑制的現象，而在對照組中，沒有明顯的變化［36-37］。

當腫瘤生長超出血液供應時，腫瘤的中心區域過度消耗氧氣，且由于腫瘤血管網絡的高度不規則性，無法向所有區域輸送足夠氧氣［38］，從而導致缺氧的微環境。但腫瘤細胞能夠激活新型通路，從而激活因子HIF-1α，使其不斷適應所處的缺氧環境，并且促進腫瘤細胞的增殖，侵襲和轉移，使得治療效果不理想。此外，腫瘤組織處缺氧導致其能量代謝方式主要以無氧酵解為主，產生的乳酸因為腫瘤血管網絡的不均勻導致蓄積，引起pH值下降［39］。惡性腫瘤細胞往往能夠進行補償過程并且驅動后期惡性程度更高的疾病的發生［40］。除了缺氧和低pH值外，腫瘤微環境中還原性谷胱甘肽和過氧化氫含量均比正常組織要高，因此有些研究人員會利用這樣的特性來開發刺激響應型的納米診療劑，從而實現納米診療劑的“智能化”精確識別相應［41-42］。有學者新構建出的MONs@PDA-ICG納米診療劑，可以在腫瘤微環境中釋放氧氣和Mn2+離子，產生的氧能緩解腫瘤缺氧，有效增強光動力療法的治療效果［23］。Zhou等［43］利用多孔中空普魯士藍納米顆粒(PHPBN)作為葡萄糖氧化酶的納米載體開發了一種腫瘤靶向多功能納米平臺，用于腫瘤饑餓和光熱治療聯合治療，PHPBN不僅在近紅外區有較強的光吸收和良好的光熱轉換效率，且有過氧化氫酶的特性，改善腫瘤缺氧微環境，并放大Gox消耗氧氣耗盡腫瘤組織中的葡萄糖引起的腫瘤饑餓效應，該效應抑制了光熱處理后熱休克蛋白的表達，降低腫瘤組織對光熱治療的抵抗力。另外一項研究合成了BM-PEG NSs，其能夠通過消耗谷胱甘肽和通過Fe3+的高氧化性生成O2來調節腫瘤微環境，降低腫瘤的抗氧化能力，有利于活性氧介導的治療。值得注意的是，BM-PEG NSs通過熒光成像、光聲成像結合光熱治療對腫瘤的殺傷能力已經在體內和體外得到證實，是診治腫瘤的有效手段［44］。

3.2 抑制腫瘤轉移

到目前為止，用于抑制腫瘤轉移的治療方法主要包括手術、放療和化療，但這些方法對于已經發生癌細胞轉移的患者，療效是有限的。腫瘤細胞一旦遠處轉移，則很難進行根治性治療，也很難做到完全治愈［45］。腫瘤為了自身生長和轉移，會高度表達許多種酶。在腫瘤相關的多種酶中，基質金屬蛋白酶（MMPs），特別是MMP-2和MMP-9，幾乎能降解細胞外基中的各種蛋白成分，改變細胞間黏附，使腫瘤細胞發生侵襲轉移。因此，設計對MMPs響應的納米材料對于腫瘤轉移的檢測和治療非常重要?；诖?，有學者設計開發出了納米探針Mel-AK-GC8和Mel-AZ-GC8。在腫瘤轉移組織中，Mel-AK-GC8和Mel-AZ-GC8會聚集形成聚集體，導致熱場重疊，使得光聲信號增強，能夠有效檢測腫瘤組織的存在。同時，利用聚集之后的納米探針的光熱效應能夠進行光熱治療，為中晚期肝癌的診斷和治療提供了強有力的方法［46］。還有研究表明，碳納米管不僅能殺傷腫瘤細胞，還可通過活化機體免疫系統從而抑制腫瘤轉移。另有團隊制備出的Au@Bi2S3-PVP/DOX納米復合材料在抑制HepG2細胞遷移方面也具有很高的活性，能夠減弱體內腫瘤遷移［47］。

3.3 聯合化療的納米診療一體化

單一的腫瘤治療手段并不能獲得很好的治療效果，不同的腫瘤治療手段共同聯用能夠產生理想的協同作用[48]，特別是相對于以納米診療劑作為基石的診療一體化而言，納米材料的多樣性和可塑性使其功能不僅限于光聲成像和光熱治療，還能作為化療藥物的載體［48］。納米診療劑和化療藥物相結合的新型納米遞送系統有以下優點：（1）通過納米診療劑的靶向作用增加化療藥物在腫瘤中的富集，阿霉素和甲氨蝶呤作為化療藥物廣泛用于肝癌，但由于缺乏特異性，在抗癌的同時易傷害正常組織［49］。有研究將阿霉素、透明質酸、甲氨蝶呤和吲哚菁綠相結合，利用甲氨蝶呤的葉酸受體靶向性和透明質酸的腫瘤靶向性使納米診療劑能夠靶向進入腫瘤，其吲哚菁綠成分則發揮光聲成像監測藥物富集情況和光熱治療增加藥物殺傷力的作用［50］；（2）通過納米診療劑的“智能”響應功能調節化療藥物釋放，Yang等［51］設計了對腫瘤特有的酸性微環境響應的胺取代苝二酰亞胺衍生物，酸性環境觸發化療藥物阿霉素的釋放，同時也通過納米材料的光聲信號監測阿霉素釋放的情況；（3）光熱治療能夠提高化療藥物的殺傷力，通過光熱治療使局部溫度上升到40.5～43.0℃時，化療藥物的細胞毒性作用能夠得到最大程度的增加［52］，常用的化療藥像順鉑、卡氮芥、環磷酰胺的細胞毒性隨著腫瘤局部溫度升高呈線性增強［53］。

腫瘤多藥耐藥性是造成化療失敗的主要原因之一，因為ATP結合盒轉運蛋白家族的P-糖蛋白過表達會顯著抑制細胞攝取化療藥物［54］，并通過外排泵泵出化療藥物［55］。研究者發現光熱治療克服并逆轉多藥耐藥性，通過高溫引發線粒體功能障礙來抑制ATP生成能夠克服多藥耐藥性，Tu等［56］建造線粒體靶向的石墨烯納米平臺，通過激光照射引起線粒體功能障礙，進而影響ATP產生，阻斷多藥耐藥性。能夠高效負載阿霉素和藥物外排抑制劑的介孔聚多巴胺納米顆粒能夠有效靶向腫瘤細胞并減少P-糖蛋白將藥物泵出［57］，且光熱治療本身的熱量也能殺死耐藥的腫瘤細胞［58］。

4 小結

到目前為止，納米診療劑的臨床轉化仍然有限，藥物的高級靶向和激活功能導致了制備的復雜性。超出腫瘤范圍的紅外光和在腫瘤附近組織中大量積累的光敏劑也可能會導致附加的損害。此外，對于大型和深層腫瘤而言，光熱治療的治療深度不足，不能殺傷腫瘤中心的癌細胞，是腫瘤復發的重要因素。

隨著生物醫學工程和材料工程的研究，越來越多性質更穩定、生物相容性更好、光熱轉換效率更高的材料會被開發出來，讓納米診療劑能夠實現臨床轉化。相信隨著納米診療劑的不斷研究和改進，光聲成像和光熱治療能夠有機結合形成的診療一體化擁有廣闊的發展前景，也將為臨床上肝癌的診斷和治療帶來更好的福音。