土壤利用類型和海拔對油茶根圍土壤細菌和真菌多樣性的影響

曾維軍 劉燕 羅文敏 秦維

摘要：為揭示不同土壤利用類型和不同海拔的油茶林根圍土壤細菌和真菌的結構與組成，為油茶林的地力調控、精準施肥提供基礎數據和指導，以貴州喀斯特地區不同土壤利用類型、不同海拔的油茶林根圍土壤為材料，利用IlluminaMiSeq測序平臺進行高通量測序，分析貴州喀斯特地區不同土壤利用類型和不同海拔的油茶根圍土壤細菌和真菌物種多樣性及其構成，并解析土壤養分對不同土壤利用類型和不同海拔的油茶根圍土壤細菌、真菌群落組成及其多樣性的影響。結果表明，油茶原生土壤和農業耕作土壤真菌、細菌香農指數差異不顯著（P>0.05），但不同海拔梯度下差異顯著；低海拔的從江（300m）與高海拔的威寧（2180m）土壤真菌和細菌群落較為豐富；門分類水平下，優勢真菌為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門，細菌為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門；屬分類水平下，農業土壤中的慢生根瘤菌、酸桿菌等細菌屬的豐度顯著較??；海拔升高，野生油茶根圍土壤中的被孢霉屬真菌相對豐度升高且土壤養分對真菌和細菌的群落分布相對影響作用呈先增后降規律；土壤中31.62%真菌和41.51%細菌暫無分類地位。說明貴州喀斯特地區油茶根圍土壤中細菌、真菌資源豐富，不同海拔分布存在顯著差異，土壤養分與細菌、真菌群落組成互相作用，未知微生物資源豐富，挖掘潛力較大。油茶的人工栽培存在破壞土壤中有益真菌和細菌生存環境和群落結構的可能性，從而降低土壤的分解及營養調節轉化能力。

關鍵詞：土壤利用類型；海拔；油茶；根圍土壤；細菌；真菌；多樣性

中圖分類號：S794.401；S714.3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0227-09

油茶（Camelliaspp.）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（CamelliaL.）常綠小喬木或灌木，是重要的木本食用油料植物，以油茶籽為原料壓榨的茶油，其不飽和脂肪酸含量高達90%，具有軟化血管、降血脂和血壓的功效［1］。油茶主要分布于我國南方亞熱帶地區的高山及丘陵地帶，年油茶籽產量約為267.9萬t，但仍無法滿足我國的糧油自供需求，所以增加油茶茶果產量、提升茶油品質、提高資源利用率等問題亟待解決［2-4］。

土壤中微生物種類包含細菌、真菌、放線菌、藻、原生動物和病毒，其含量小于土壤質量的0.5%，但在土壤特性和演變過程中卻發揮著重要作用，如參與土壤氧化、硝化等生物化學過程，促進土壤有機質分解和養分轉化，是生化循環首要驅動者，它們積極影響著土壤肥力的形成和植物營養的轉化［5-8］。多數油茶樹表現出抗逆性強的生理特性與其土壤微生物群落特征明顯相關［9］。同時季節更替、農業耕作的管理方式以及區域環境差異都對土壤微生物多樣性有顯著影響［10-12］?？λ固氐貐^的土壤貧瘠、保水能力差等因素制約油茶實現優質高產，因此探究喀斯特地區油茶土壤微生物群落特征，對實現油茶速生、豐產、優質、高抗具有重要意義。

本研究在貴州喀斯特地區不同海拔地區采集油茶原生土壤和農業耕作土壤樣品，使用IlluminaMiseq平臺對土樣中提取的微生物DNA進行高通量測序，并進行微生物多樣性分析，以期探究貴州喀斯特地區油茶林根圍原生土壤和農業耕作土壤細菌和真菌的物種多樣性和差異，以及不同海拔梯度土壤中細菌、真菌多樣性與土壤養分的關系，為油茶的人工栽培科學施肥和提質增效提供理論支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1儀器

EppendorfN13462C型移液器、Eppendorf5430R型小型離心機、Eppendorf5424R型高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）；NanoDrop2000型超微量分光光度計（ThermoFisherScientific，美國）；BioTekELx800型酶標儀（Biotek，美國）；QL-901型旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司，中國）；TL-48R型粉碎研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司，中國）；FastPrep-245G型MP研磨儀（MP，美國）；iCETM3500AAS原子吸收光譜儀（ThermoFisherScientific，美國）；Kjeltec8400型全自動凱氏定氮儀（FOSS，丹麥）；QuantusTMFluorometer型微型熒光計（Promega，美國）；ABIGeneAmp9700型PCR儀（ABI，美國）；Miseq測序儀（Illumina，美國）。

1.1.2試劑

FastDNASpinKitforSoilDNA抽提試劑盒（MPBiomedicals，美國）；Agarose瓊脂糖（biowest，西班牙）；FastPfuPolymeraseDNA聚合酶（TransGen，中國）；AxyPrepDNAGelExtractionKit試劑盒（Axygen，美國）；NEXTflexRapidDNA-SeqKit建庫試劑盒（BiooScientific，美國）；MiSeqReagentKitv3測序試劑盒（Illumina，美國）。土壤基本營養指標檢測的相關試劑（分析純）均購置于成都金山化學試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣品采集

于2021年8月在貴州喀斯特地區主要的油茶種質資源分布縣（冊亨、威寧、從江、玉屏），以30～40年野生油茶林地為基礎設置20m×20m規格樣方，樣方內“Z”形7點采集油茶根圍原生土壤，混勻為一個原生土樣；以5年引種移栽油茶林地為基礎設置20m×20m規格樣方，樣方內“Z”形7點采集油茶根圍農業耕作土壤，混勻為一個農業耕作土樣。具體土壤采集步驟參照《土壤微生物研究原理與方法》中土壤的采集與預處理［13］。各樣方概況詳見表1。

1.2.2DNA提取和PCR擴增

1.2.3IlluminaMiseq測序

將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit試劑盒進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer型微型熒光儀對回收產物進行檢測定量。使用NEXTflexTMRapidDNA-SeqKit試劑盒進行建庫：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。

1.2.4土壤基礎營養指標測定

土壤全氮含量、全磷含量、全鉀含量、有效磷含量、速效鉀含量、pH值分別按照NY/T53—1987《土壤全氮測定法半微量開氏法》、GB/T9837—1988《土壤全磷測定法》、NY/T87—1988《土壤全鉀測定法》、NY/T1121.7—2014《土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定》、NY/T1849—2010《酸性土壤銨態氮、有效磷、速效鉀的測定聯合浸提—比色法》、LY/T1241—1999《森林土壤水解性總酸度的測定》測定；土壤堿解氮按照堿解擴散法［14］測定。

1.3數據處理

使用UsearchV.7.0.1090進行OTU分析和Pan分析，聚類方式采用USEARCH7-uparse算法，OTU序列相似度為0.97，物種分類數據庫為unite8.0/its_fungi，分類置信度為0.7。使用mothurv.1.30.2計算Shannon指數，并對組間Shannon指數差異進行t檢驗。使用R語言（version3.3.1）進行物種Venn圖分析和制作群落柱形圖。使用Qiime計算beta多樣性距離矩陣，R語言（version3.3.1）vegan軟件包進行非度量多維尺度（NMDS）分析和作圖。多組比較采用ruskal-Wallis秩和檢驗，2組比較采用t檢驗。

2結果與分析

2.1不同分組油茶根圍土壤真菌物種多樣性分析

對土樣中真菌進行DNA抽取，高通量分析后，得到優化總序列數967228條，各樣本序列數范圍為34129～47562條，序列平均長度為227bp。由圖1可知，采集土樣按照海拔和土壤利用類型分組，2個分組對應的OTU總數隨著觀測樣本數的增加而漸漸趨于平緩，說明測序樣本量足夠，滿足后續分析需求。由圖2可知，油茶根圍原生土壤和農業耕作土壤真菌的香農指數差異不顯著（P>0.05），但喀斯特地貌不同海拔油茶種植區根圍土壤的香農指數差異極顯著（P≤0.01）。隨著海拔升高（300～2180m），香農指數先降后升，t檢驗為極顯著，其中最高點威寧（海拔2180m）和最低點從江（海拔300m）的油茶根圍土壤真菌香農指數分別為3.26、3.41，兩者差異不顯著。

2.2不同分組油茶根圍土壤真菌物種組成分析

由圖3可知，貴州喀斯特地區油茶根圍土壤真菌在門分類水平下按相對基因豐度從大到小依次為子囊菌門（40.39%）、擔子菌門（28.34%）、被孢霉門（6.07%），其中不能鑒別的真菌門占22.67%。屬分類水平下按相對基因豐度從大到小依次為沙蜥屬（12.81%）、被孢霉屬（5.96%）、綠僵菌屬（4.19%），其中不能鑒別的真菌屬占22.67%，相對基因豐度低于1%的屬均歸于其他，占28.31%。由圖4可知，非度量多維尺度（NMDS）分析的脅強系數均小于0.05，說明對分組土樣的NMDS分析具有很好的代表性，其中原生土壤和農業耕作土壤中的真菌有共同物種，B1、B2、D2這3個樣本點的物種組成相似。以喀斯特不同海拔地區分組的土樣中，海拔810m的冊亨與海拔300m的從江油茶根圍土壤真菌物種組成相似。由圖5-a可知，農業耕作土壤的Apiotrichum屬和未知分類地位真菌屬的相對基因豐度均顯著大于原生土壤，木耳科無分類學地位的屬（P<0.01）、Dokmaia（P<0.01）、鐮刀霉屬（P<0.05）的相對基因豐度均顯著或極顯著小于原生土壤。由圖5-b可知，海拔600m的玉屏油茶根圍土壤中無分類地位或未知的真菌屬基因相對豐富且顯著最大；海拔300m的從江和810m的冊亨土壤中真菌沙蜥屬、子囊菌中不能區分的屬、青霉菌屬的基因相對豐富且顯著較大；2180m的威寧土壤中真菌被孢霉屬基因相對豐富且顯著較大。

2.3不同海拔下油茶根圍土壤真菌物種與土壤養分的相關性分析

由圖6可知，貴州喀斯特地區油茶根圍土壤中的基本營養指標均與相對基因豐度排名前10的真菌屬顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關性，其中與全鉀含量顯著或極顯著正相關的真菌屬最多，有5個屬，分別為青霉屬、木霉屬、傘菌目中不能識別的屬、沙蜥屬、子囊菌中不能識別的屬，相關系數為0.6883～0.8579。土壤速效鉀含量和堿解氮含量同時與3個真菌屬顯著或極顯著正相關，分別是Apiotrichum、被孢霉屬、Solicoccozyma，相關系數為0.6153～0.9379。通過VIF方差膨脹因子分析，篩選出4個主要的土壤養分因子（表2）進行RDA分析。由圖7可知，在海拔2180m的威寧，油茶根圍土壤的全磷含量對真菌的群落分布相對影響最大，其中顯著影響著該土壤中的被孢霉數量。在海拔300m的從江和810m的冊亨，土壤的全鉀含量對真菌的群落分布相對影響最大，其中顯著影響著兩地土壤中的沙蜥屬真菌數量。

2.4不同分組油茶根圍土壤細菌物種多樣性分析

對土樣中細菌進行DNA抽取，高通量分析后，得到優化總序列數1331376條，各樣本序列數為40427～71865條，序列平均長度為412bp。由圖8可知，采集土樣不同分組下，OTU總數隨著觀測樣本數的增加而漸漸趨于平緩，說明測序樣本量足夠，滿足后續分析需求。由圖9可知，原生土壤和農業耕作土壤的油茶根圍土壤細菌香農指數差異不

顯著，海拔300m的從江和海拔2180m的威寧土壤細菌香農指數較高，極顯著高于海拔600m的玉屏和海拔810m的冊亨（P<0.001）。

2.5不同分組油茶根圍土壤細菌物種組成分析

由圖10可知，變形菌門（28.69%）、酸桿菌門（21.71%）、放線菌門（18.57%）為貴州喀斯特地區油茶根圍土壤的優勢菌門，三者相對基因豐度總和達68.97%；熱酸菌屬（7.27%）是優勢菌屬。由圖11可知，每個地區的樣本點能團聚在一起，彼此沒有交集，海拔300m的從江與海拔810m的冊亨物種組成相比于其他地區物種組成較為相近，且脅強系數小于0.1，該結果具有較強代表性。由圖12可知，在屬分類水平下，原生土壤中的慢生根瘤菌、酸桿菌、羅氏菌、分支桿菌相對基因豐度均顯著高于農業耕作土壤（P<0.05）；熱酸菌屬的相對基因豐度隨海拔的升高呈顯著的先增后降趨勢，海拔810m冊亨的豐度最高。

2.6不同海拔梯度下油茶根圍土壤細菌物種與土壤養分的相關性分析

由圖13可知，相對基因豐度排名前10的細菌屬中與全鉀含量顯著相關的有4個，其中念珠菌固體桿菌屬與全鉀含量、速效磷含量、有機質含量極顯著正相關（P<0.01），相關系數分別為0.7544、0.8182、0.8181；苔蘚桿菌屬與全磷含量、全氮含量、速效鉀含量、堿解氮含量顯著或極顯著正相關（P<0.05或P<0.01），相關系數分別為0.6386、0.6993、0.7622、0.7063。由圖14可知，在海拔2180m的威寧，油茶根圍土壤的全磷含量對細菌的群落分布相對影響最大，其中細菌群落分布中占據優勢的為熱酸菌屬；在海拔810m的冊亨，土壤有機質和速效鉀的含量對細菌的群落分布相對影響最大；伴隨著海拔的升高，土壤中的基礎營養對細菌的群落分布相對影響作用先增后降。

3討論與結論

影響根際微生物組構建的重要因素包括土壤碳氮含量比值、營養元素含量、pH值、水分含量以及地理位置等［15-16］。唐煒等研究發現，湖南不同油茶種植區根際的土壤養分特征和細菌群落豐富度均存在顯著差異，無撫育手段干預的油茶林根際細菌和真菌的物種豐富度指數較高［17］。本研究發現，貴州喀斯特地區不同海拔的野生油茶根圍土壤中的真菌和細菌物種多樣性有顯著差異，最低和最高海拔的土壤具有較為豐富的真菌、細菌物種，說明貴州喀斯特高、低海拔地區油茶根圍土壤中的微生物資源豐富，具有較強的開發利用價值，但與前人研究結果不同的是人工引種栽培的油茶根圍土壤（農業土壤）真菌和細菌多樣性同野生油茶（原生土壤）相比，差異不顯著，其原因可能是土壤中存在一定數量的無分類地位的真菌和細菌，在屬分類水平下，其基因相對豐度分別占31.62%、41.51%，說明土壤中未知的微生物資源豐富，具有良好的挖掘前景。研究還發現，農業土壤的Apiotrichum真菌屬豐度顯著大于原生土壤，但其慢生根瘤菌、酸桿菌等細菌屬的豐度顯著較小，慢生根瘤菌具有固氮作用［18］，酸桿菌可以降解植物纖維素等大分子聚合物［19］，兩者均是增強土壤養分的功能性細菌屬，由此說明經過人為措施改良后的農業土壤不利于一些土壤功能性微生物的生存，土壤分解及營養調節轉化能力可能變差。張鵬研究發現，油茶土壤的優勢細菌門是綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門、放線菌門，優勢真菌門是子囊菌門、擔子菌門［20］。本研究對貴州省喀斯特野生油茶分布區的根圍土壤進行微生物物種組成分析，發現和前人研究結論的區別在于土壤中的優勢真菌增加了被孢霉門。吳澤龍研究發現，油茶林地土壤中，被抱霉屬真菌和熱酸菌屬細菌的相對豐度最高，分別為12.70%、4.63%［21］。本研究與前人研究存在的差異為貴州喀斯特油茶根圍土壤中的真菌以沙蜥屬相對豐度最高，為12.81%，沙蜥屬真菌和熱酸菌屬細菌目前暫無明確的生理生態功能性研究。

本研究還發現，在貴州喀斯特野生油茶林主要分布區，隨著海拔升高（300～2180m），土壤速效鉀和堿解氮含量同Apiotrichum、被孢霉、Solicoccozyma真菌屬的相對基因豐度顯著正相關，念珠菌固體桿菌屬、苔蘚桿菌屬細菌屬具有廣泛的土壤養分關聯性。其中，被孢霉的菌絲在有機降解過程中會影響其他微生物類群對養分的吸收，它的某些種類如高山被孢霉（Mortierellaalpina），會產生廣泛的多不飽和脂肪酸，這些脂肪酸含有豐富的碳源，能改變土壤微生物的生境［22-23］。由此說明，海拔升高，喀斯特野生油茶根圍土壤中的被孢霉屬真菌相對豐度越高，不僅改變了土壤微生態，同時還提升了土壤速效鉀和堿解氮的含量，分別在高海拔區威寧（海拔2180m）達到最大值。關于威寧的高山油茶根圍土壤中是否具有豐度較高的高山被孢霉，被孢霉屬真菌與土壤速效鉀和堿解氮的含量又存在怎樣的互作機制，有待進一步研究。

通過對貴州喀斯特地區不同土壤利用類型和不同海拔梯度的油茶根圍土壤養分、微生物（真菌、細菌）物種多樣性進行分析，結果表明，貴州喀斯特地區油茶林原生土壤和農業土壤在微生物多樣性上差異不顯著，但不同海拔梯度下差異顯著。在屬分類水平下，農業土壤中的慢生根瘤菌、酸桿菌等細菌屬的豐度顯著較??；隨著海拔升高，喀斯特野生油茶根圍土壤中的被孢霉屬真菌相對豐度越高；土壤養分對真菌和細菌的群落分布有顯著影響，隨著海拔升高，作用呈先增后降趨勢；另外，貴州喀斯特地區油茶根圍土壤中未知微生物資源豐富，具有分類地位的微生物，其大多數生理生態功能不能明確，需進一步開發挖掘。

參考文獻：

［1］單琴.油茶籽粕多糖的降血脂功效及其對腸道菌群的影響［D］.合肥：合肥工業大學，2021：10-15.

［2］王金鳳，譚新建，吳喜昌，等.我國油茶產業發展現狀與對策建議［J］.世界林業研究，2020，33（6）：80-85.

［3］陳素傳，季琳琳，姚小華，等.油茶品種果實主要經濟性狀和營養成分的差異分析［J］.經濟林研究，2022，40（2）：1-9.

［4］梅方煒，胡靜，歐天山，等.油茶深精加工研究進展［J］.糧食與油脂，2021，34（11）：6-8，40.

［5］羅達，史作民，李東勝.枯落物處理對格木林土壤碳氮轉化和微生物群落結構的短期影響［J］.應用生態學報，2018，29（7）：2259-2268.

［6］張青，王辰，孫宗湜，等.土壤微生物生物量及多樣性影響因素研究進展［J］.北方園藝，2022（8）：116-121.

［7］鄒獅，嚴君，陳旭，等.不同植被類型對不同土層黑土土壤微生物群落功能多樣性的影響［J］.土壤與作物，2022，11（1）：72-80.

［8］劉亞軍，王文靜，王紅剛，等.作物輪作對甘薯田土壤微生物群落的影響［J］.作物雜志，2021（6）：122-128.

［9］左繼林.油茶高產無性系對干旱脅迫及抗旱措施的響應［D］.南京：南京林業大學，2014：1-7.

［10］楊敏芳，朱利群，韓新忠，等.耕作措施與秸稈還田對稻麥兩熟制農田土壤養分、微生物生物量及酶活性的影響［J］.水土保持學報，2013，27（2）：272-275，281.

［11］馬忠明，呂曉東，劉莉莉.耕作方式對綠洲灌區農田土壤有機碳及其分布的影響［J］.應用生態學報，2015，26（1）：122-128.

［12］ShenGQ，AshworthDJ，GanJ，etal.Biocharamendmenttothesoilsurfacereducesfumigantemissionsandenhancessoilmicroorganismrecovery［J］.EnvironmentalScience&Technology，2016，50（3）：1182-1189.

［13］林先貴.土壤微生物研究原理與方法［M］.北京：高等教育出版社，2010.

［14］馬獻發.土壤學實驗［M］.1版.北京：中國林業出版社，2020.

［15］LebeisSL，RottM，DanglJL，etal.Culturingaplantmicrobiomecommunityatthecross-Rhodes［J］.NewPhytologist，2012，196（2）：341-344.

［16］PeifferJA，SporA，KorenO，etal.Diversityandheritabilityofthemaizerhizospheremicrobiomeunderfieldconditions［J］.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2013，110（16）：6548-6553.

［17］唐煒，陳隆升，陳永忠，等.湖南油茶根際微生物的群落結構特征［J］.經濟林研究，2021，39（4）：51-59.

［18］王婧儀，曹揚榮，朱輝.天冬氨酸轉氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用［J］.華中農業大學學報，2021，40（6）：68-74.

［19］王光華，劉俊杰，于鎮華，等.土壤酸桿菌門細菌生態學研究進展［J］.生物技術通報，2016，32（2）：14-20.

［20］張鵬.油茶林地土壤微生物群落特征［D］.廣州：華南農業大學，2019.

［21］吳澤龍.油茶林地土壤微生物多樣性研究［D］.長沙：中南林業科技大學，2016.

［22］代鵬，陳海琴，顧震南，等.高山被孢霉生產多不飽和脂肪酸發酵條件的研究進展［J］.食品工業科技，2014，35（5）：354-359.

［23］曹良元，蔣先軍，張磊，等.麥角固醇與不同粒級團聚體土壤的相關性［J］.土壤學報，2008，45（6）：1184-1188.