外源脯氨酸對大葉樟幼苗堿脅迫的緩解效應研究

張麗華 韓浩章 李素華 趙 榮 王 芳 王曉立

（宿遷學院建筑工程學院，江蘇 宿遷 223800）

大葉樟(Cinnamomum septentrionale)又稱銀木，為樟科（Lauraceae）、樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，主產于我國南方地區，是我國重要的造林綠化樹種和經濟樹種，生長迅速，樹形美觀，適應性強[1]。前人的研究主要集中于引種栽培[2]、繁殖技術[3]、光合生理[4]和遺傳多樣性[5]等方面，金晶等[6]、李曉儲等[2]、趙昌恒等[4]的研究認為，大葉樟比香樟（C. camphora）有更強的抗低溫和耐鹽堿能力，可在華東地區進行產業化生產和推廣應用。王夢軍等[7]于2018 年將大葉樟作為綠化樹種引種到西安地區進行栽培，認為大葉樟在-10 ℃條件下可以正常生長，大葉樟在我國北方地區引種栽培成為可能，而我國北方部分地區城區綠地土壤的pH 值為8.4～9.0，堿化程度高于南方地區，營養元素缺乏，有機質含量普遍較低[8]，影響大葉樟的生產栽培，經常會出現葉片黃化現象。相對于鹽脅迫，堿脅迫對植物的傷害程度更高，往往會導致植物光合能力明顯下降，植物抗氧化酶系統明顯受損，植物體內礦質元素的平衡被打破，根系生長受抑制，養分吸收困難[9]。植物對堿脅迫響應機制亦十分復雜，通常包括滲透調節、抗氧化系統、呼吸系統、代謝途徑改變、細胞膜穩定性等方面，最近有報道氨基酸和有機酸等次生代謝物質參與植物適應逆境脅迫[10-11]。相同堿處理下，耐堿性強的蕓豆（Peppermint extract）品種根系分泌物中含有更多的總氨基酸和有機酸[12]，脯氨酸和甜菜堿含量在高濃度堿脅迫下的增幅大于鹽脅迫[13]。前期研究表明，堿脅迫下猴樟（C. bodinieri）體內的脯氨酸明顯高于普通香樟，脯氨酸與樟屬植物耐堿脅迫過程有關[14]。對櫸樹（Zelkova schneideriana）[15]、銀杏（Ginkgo biloba）[16]、白花泡桐（Paulownia fortunei）[17]的研究結果也表明，堿脅迫條件下植物體內的脯氨酸含量會顯著提高，抗性強的樹種中含有更高的脯氨酸。外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力[18-19]，還能通過誘導華北紫丁香（Syringa oblata）抗氧化酶活性提高抗逆境脅迫能力[20]。目前關于外源脯氨酸對樟屬植物耐堿脅迫的緩解作用及其調控機理研究較少，基于此，本研究以大葉樟幼苗為材料，初步研究外源脯氨酸離子對大葉樟幼苗堿脅迫的緩解效應，以期為大葉樟耐堿脅迫機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為樟屬植物資源圃1 年生盆栽大葉樟幼苗，共90 盆，每盆3 株，共分6 個處理，每處理15 盆，苗高 (25 ± 2) cm。于2019 年10 月2 日選擇生長健康的大葉樟母樹采種，經低溫沙藏處理后，2020 年2 月6 日播種，120 d 后移栽于盆中，栽培基質為基地田園土，土壤pH 7.51，土壤電導率810 μs/cm，土壤有機質含量12.55 g/kg。盆栽苗在玻璃溫室中進行培養，正常管理。

1.2 處理方法

在前期研究基礎上[9]，選擇150 mmol/L 的Na2CO3溶液作為堿脅迫處理濃度（超過150 mmol/L 的Na2CO3溶液處理時，種苗表現生長不良現象），于2021 年3 月12 日 上 午9：00，按800 mL/盆標準進行澆灌處理，當日下午3：00 外源噴施濃度分別為0（CK）、50、100、150、200 mmol/L的脯氨酸溶液200 mL，至葉面滴水為止，剩余溶液澆施于盆內土壤中，之后正常管理。培養14 d后，各處理的土壤pH分別為8.51、8.62、8.47、8.40、8.65，同時檢測大葉樟幼苗葉片葉綠素含量、葉綠素熒光參數、相對電導率、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和總抗氧化能力，3 次重復，取平均值進行統計分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉片葉綠素含量及其熒光參數測定

葉綠素含量測定采用乙醇法[21]；葉綠素熒光參數采用Yaxin-1161G 葉綠素熒光儀（北京雅欣理儀科技有限公司，北京）選擇種苗中部成熟葉片進行測定，整株植物暗適應30 min 后，測定初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm）；光適應下測定最大熒光（Fm'），穩態熒光（Fs）穩定后，打開遠紅光測定光適應下的最小熒光（Fo'）；參照尹勇剛等[22]的方法，分別計算PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、光化學猝滅系數（qP）和非光化學猝滅系數（qN）。

1.3.2 葉片滲透調節物質含量及抗氧化能力測定

葉片可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[21]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[21]；脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法[21]；有機酸含量采用酸堿滴定法，其中蘋果酸的換算系數為0.067[21]；相對電導率采用抽氣法[21]，MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[21]，POD 活性采用愈創木酚法，以每分鐘減少0.01 個OD 值為1 個活力單位[21]；SOD 活性采用氮藍四唑（NBT）法，以NBT 光化還原抑制率為50%時所用的酶量為1 個活力單位[21]；CAT 活性采用高錳酸鉀滴定法，以每克鮮質量樣品1 min 內分解H2O2的毫克數為酶活力[21]；PAL 活性采用紫外分光光度法，以每小時在290 nm 處OD 值增加0.01 所需酶量為1 個活力單位[21]；總抗氧化能力采用FRAP 法，以達到同樣吸光度值所需的FeSO4標準溶液的毫摩爾數定義為FRAP 值[21]。

1.4 數據統計

將 所 測 定 的 數 據 輸 入Microsoft Excel 2010，采用SPSS 22.0 進行數據統計，不同處理間的顯著差異分析采用最小顯著差數法（LSD）。采用隸屬函數法對外源脯氨酸緩解大葉樟幼苗堿脅迫的效果進行綜合評價，計算各處理的抗堿綜合評價值（Dj），Dj表示j處理的抗堿性綜合評價值[14]。其中與大葉樟盆栽幼苗耐堿性成正相關的葉綠素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、SOD活性、POD 活性、CAT 活性和總抗氧化能力采用公式（1）計算隸屬函數值（U）；對與盆栽幼苗抗堿性成負相關的MDA 含量、相對電導率和PAL 活性采用公式（2）計算隸屬函數值（U）。

式中：i表示某個指標，j表示某個處理，Uij表示i指標j處理的抗堿性綜合評價隸屬函數值，Xij表示i指標j處理的實際測定值，Xjmin表示該指標所有測定值中的最小值，Xjmax表示該指標所有測定值中的最大值。

2 結果與分析

2.1 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗葉綠素含量及其熒光參數的影響

由表1 可知，外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的葉綠素含量呈先上升后下降趨勢，在100 mmol/L 的脯氨酸處理條件下，葉綠素含量達最高點，高于CK 26.53%，200 mmol/L脯氨酸處理時，葉綠素含量與CK 差異不顯著；外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP呈先上升后下降趨勢，在100 mmol/L 的脯氨酸處理條件下，qN、qP達最高點，分別高于CK 1 057.14%和60%，在150 mmol/L 的脯氨酸處理條件下，Fo、Fm、Fv/Fm達最高點，分別高于CK 103.65%、184.21%和77.78%，200 mmol/L 脯氨酸處理時，qP與CK 差異不顯著，Fo、Fm、qN顯著高于CK（P＜0.05），而Fv/Fm顯著低于CK（P＜0.05）。

表 1 脯氨酸和Na2CO3混合處理條件下大葉樟幼苗的葉綠素含量及其熒光參數Table 1 Chlorophyll content and fluorescence parameters of C. septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.2 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗滲透調節能力的影響

由表2 可知，外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫條件下大葉樟幼苗的滲透調節能力。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的MDA 含量和相對電導率基本呈下降趨勢，在超過150 mmol/L 脯氨酸處理后達最低值，分別低于CK 30.52%和33.70%，200 mmol/L 脯氨酸處理時仍明顯低于CK（P＜0.05）；外源脯氨酸處理下大葉樟幼苗的可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和蘋果酸含量均呈先上升后下降的趨勢，可溶性糖含量呈逐步上升趨勢；150 mmol/L 的脯氨酸處理時大葉樟幼苗的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量達最高值，分別高于CK 7.17%和49.85%，在100 mmol/L 的脯氨酸處理時蘋果酸含量達最高值，高于CK 187.88%；200 mmol/L 脯氨酸處理時可溶性糖含量達最高值，高于CK 16.16%，而此時葉片中的脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、蘋果酸含量與CK 差異不顯著。

表 2 脯氨酸和Na2CO3混合處理條件下大葉樟幼苗的滲透調節能力Table 2 Osmotic regulation ability of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.3 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗抗氧化能力的影響

由表3 可知，外源脯氨酸處理明顯提高大葉樟幼苗在堿脅迫下的抗氧化能力。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗SOD、POD、CAT 活力和總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，其中POD、CAT 活力的最高值出現在100 mmol/L 的脯氨酸處理時，分別高于CK 64.49%和228.76%，SOD 活力和總抗氧化能力的最高值出現在150 mmol/L 的脯氨酸處理時，分別高于CK 59.66%和84.10%；PAL 活力呈先下降后上升趨勢，在150 mmol/L 的脯氨酸處理時達最低點，顯著低于CK 22.08%；200 mmol/L 的脯氨酸處理時，SOD 和POD 活力顯著高于CK（P＜0.05），而總抗氧化能力、CAT 和PAL 活力與CK 差異不顯著。

表 3 脯氨酸和Na2CO3混合處理條件下大葉樟幼苗的抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.4 外源脯氨酸處理緩解大葉樟幼苗堿脅迫綜合能力評價

綜合評價值（D）能量化反映植物對堿脅迫環境的綜合抵抗能力，D值在0 ~ 1 之間，D值越大則表示植物抗堿脅迫能力越強。由圖1 可知，隨著外源脯氨酸處理濃度的增加，大葉樟盆栽幼苗的耐堿脅迫能力綜合評價值呈先上升后下降的趨勢，在150 mmol/L 脯氨酸處理條件下達最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸處理時D值迅速下降至0.386，但仍高于CK，外源脯氨酸處理明顯提高了大葉樟的耐堿脅迫能力。

圖 1 外源脯氨酸處理后大葉樟幼苗耐堿脅迫能力綜合評價值Fig. 1 Comprehensive evaluation value of alkali stress tolerance ofC.septentrionaleseedlings treated with exogenous proline

3 結論與討論

植物適應逆境脅迫的機制非常復雜，氨基酸和有機酸等次生代謝物質的含量增加是植物適應逆境脅迫過程的主要措施之一，除了滲透調節外，能促進細胞內離子平衡，穩定膜的結構與功能[10-11]，外源施用脯氨酸能誘導鹽脅迫下脯氨酸合成相關酶P5CS 基因表達量下降和脯氨酸脫氫酶PDH 基因表達量的提高，促進植物對脯氨酸的利用能力[23-24]，保障植物莖和根系的正常生長[25]。在本研究中，適宜濃度（100 ~ 150 mmol/L）的外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP，降低電導率和MDA 含量，提高可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、蘋果酸含量和脯氨酸含量，明顯提高SOD、POD、CAT 活性和總抗氧化能力，降低PAL 活性，提高了植物抗堿脅迫能力，與Wani 等[26]關于油菜（Brassica napus）、Hossain 等[27]關于綠豆（Vigna radiata）、Zheng 等[28]關于凹葉柃木（Eurya emarginata）的研究結果一致；逆境脅迫下，游離脯氨酸除了參與滲透調節外，還能穩定膜和蛋白質結構，清除活性氧，參與細胞信號轉導和基因表達[20]。葉綠素是植物主要的光合色素，以蛋白復合體的形式存在于葉綠體內的類囊體膜上，通過吸收和傳遞光能參與光合作用中的能量分配，其含量變化與植物光合功能相關[29]。逆境脅迫會導致植物的葉綠體結構被破壞，光系統功能受損，葉綠素降解，活性氧含量增加[30]。Fo是光系統Ⅱ（PSⅡ）反應中心處于關閉時的初始熒光產量[31]，光系統功能受損與葉綠素含量增加均會導致Fo升高[22]。外源脯氨酸處理提高大葉樟內源脯氨酸含量，提高對葉綠體結構和葉綠素復合結構的穩定性，提高葉綠素含量，從而一定程度提高了Fo，與尹勇剛等[22]對葡萄（Vitisvinifera）的研究結果一致。葉綠素熒光參數中，人們通常用Fm反映通過PSⅡ的電子傳遞情況，用Fv/Fm值體現PSⅡ反應中心內原初光能的轉換效率（最大轉換效率），用光化學反應猝滅系數（qP）反映光化學活性的高低。逆境脅迫下，植物葉片Fm、Fv/Fm、qP值通常會下降[30-31]，而外源脯氨酸處理能提高Fm、Fv/Fm、qP，提高了堿脅迫下大葉樟的光能利用能力。非光化學淬滅系數（qN）通常代表PSⅡ吸收的光能中以熱的形式耗散掉的部分，反映了光能耗散為熱的能力[31]，不同植物qN在逆境條件下的變化規律不盡相同，金星宇等[31]、包穎等[32]的研究認為qN隨鹽濃度提高和脅迫時間的延長而提高，光合結構受損，而賀立紅等[33]對銀杏（Ginkgo biloba）、王舒甜等[34]對香樟的研究結論認為，逆境脅迫下植物通過非光化學淬滅提高熱耗散來消耗更多的激發能以適應脅迫環境[34-35]。通常樟屬植物的光合速率較低，而qN和葉綠素含量較高的芳樟無性系在提高光能利用能力的同時，能將剩余的光能以熱的形式耗散，從而保護其光合機構[29]，與本研究結果一致，外源脯氨酸處理使大葉樟幼苗的qN遠高于對照，明顯提高植物抗堿脅迫環境的能力?？扇苄蕴?、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調節和抗氧化酶系統是植物適應逆境脅迫的重要措施[14-16]，適宜濃度外源脯氨酸可能作為信號激活了可溶性糖、可溶性蛋白、蘋果酸等物質的代謝途徑和SOD、POD 等抗氧化酶基因的表達[20]，提高植物在堿脅迫下的滲透調節能力和活性氧清除能力，其中蘋果酸含量在100 mmol/L 脯氨酸處理時顯著高于對照187.88%，說明以蘋果酸為代表的有機酸參與了外源脯氨酸對大葉樟堿脅迫的緩解作用，參與方式可能與呼吸代謝和緩解根際周圍的高pH 環境有關，與郭立泉等[10]關于星星草（Puccinellia tenuiflora）、柯梅等[36]關于冰草（Agropyron cristatum）、麻瑩等[11]關于鹽地堿蓬（Suaeda liaotungensis）的研究結果一致；PAL 活性隨脯氨酸處理濃度提高呈先下降后上升趨勢，在150 mmol/L 的脯氨酸處理時達最低點，PAL 活性與大葉樟耐堿性呈負相關，植物體內的PAL 是苯丙烷類生物合成途徑的關鍵酶，主要參與黃酮類和酚類物質代謝，與植物抗氧化能力相關[37-38]，PAL活性與大葉樟耐堿性的關系尚需進一步研究。外源脯氨酸處理具有濃度效應，低濃度（50 mmol/L）脯氨酸處理對大葉樟耐堿脅迫的緩解效果不顯著，100 ~ 150 mmol/L 的外源脯氨酸處理明顯提高大葉樟耐堿脅迫能力，高濃度（200 mmol/L）脯氨酸處理后，大葉樟幼苗相對電導率、MDA 含量和Fv/Fm明顯降低，Fo、Fm、qN、SOD 活性、POD活性和可溶性糖含量提高，而葉綠素含量、qP、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、CAT活性、總抗氧化能力、PAL 活性與對照差異不顯著，對大葉樟耐堿脅迫的緩解效果不明顯。隸屬函數法綜合評價值D的結果也表明，隨著脯氨酸處理濃度的增加，D值在150 mmol/L 脯氨酸處理條件下達最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸處理時明顯下降，高濃度脯氨酸處理提高大葉樟耐堿脅迫的效果不理想的原因可能是部分施入土壤中的高濃度脯氨酸對大葉樟幼苗產生了滲透脅迫，影響了植物根系的生長和功能。

綜上所述，適宜濃度的外源脯氨酸處理提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量、熒光參數、滲透調節能力和抗氧化能力，對大葉樟幼苗堿脅迫有明顯緩解作用，而高濃度的外源脯氨酸處理效果較差，有機酸參與外源脯氨酸緩解大葉樟堿脅迫的過程。結合隸屬函數法綜合評價值結果，150 mmol/L 的外源脯氨酸處理效果最好。