胡楊超氧化物歧化酶基因家族耐逆境的分子機理研究

魯松松 白麗霞 姚耀源 張曉瑋

（甘肅農業大學林學院，甘肅 蘭州 730070）

逆境脅迫條件下，植物體主要依賴抗氧化系統的協同調節來清除體內產生的過量活性氧（ROS）自由基，使細胞和組織免受氧化損傷[1-4]。植物體內含有廣泛的酶和非酶的抗氧化系統，它們具有特殊的能力來避免ROS 的潛在負面影響，同時也能抑制其在多種情況下的信號轉導作用[5]。目前，模式植物抗氧化系統的組成及其功能的研究已有大量報道，該系統的干擾或改變成為研究植物耐脅迫中ROS 信號通路的熱點之一。

超氧化物歧化酶（SOD）作為生物體抗氧化系統的第一道防線，在維持細胞穩態和植物抗氧化反應中起著重要的作用。SOD 催化超氧自由基（O2-）生成氧氣（O2）和H2O2。SOD 屬金屬酶家族，根據其活性部位金屬類型的不同可將植物SOD 分為Cu, Zn-SOD（CSD）、Mn-SOD（MSD）、Fe-SOD（FSD）3 個亞家族[6]。植物體內超氧自由基主要來源于質膜NADPH 氧化酶，以及葉綠體、線粒體和過氧化物酶體中的氧化和電子傳遞反應[7-8]。亞細胞定位研究結果表明，SOD 主要在上述產生超氧自由基的細胞器中表達[9]。SOD 在產生超氧化物的細胞器中特異性表達和其被誘導表達的能力對植物抵抗非生物脅迫引起的氧化應激和細胞信號傳導過程至關重要[10-11]。大量研究結果表明，非生物脅迫處理后植物耐逆性的升高均與SOD 活性的升高有關[10-11]。在NaCl脅迫條件下，與NaCl 敏感品種相比，豌豆（Pisum sativum）和番茄（Lycopersicon pennellii）NaCl 耐受品種的線粒體中MSD 活性均顯著升高[12-13]。此外長時間NaCl 脅迫條件下，NaCl 耐受品種葉綠體中CSD 和FSD 活性顯著升高[14]。分子實驗結果表明，NaCl 脅迫條件下，NaCl 耐受品種線粒體MSD，葉綠體CSD和FSD等抗氧化酶基因表達均顯著升高，而NaCl 敏感品種無顯著改變。

胡 楊（Populus euphratica） 隸 屬 于 柳 科（Salicaceae）楊屬，主要分布于我國西北干旱鹽堿的荒漠和戈壁地帶，是這些地區森林生態系統中的主要高大喬木樹種[15]。經過長期的自然選擇，胡楊具有較其他楊屬樹種更高的抗逆能力（抗鹽堿、抗高溫和抗干旱等），是研究植物耐逆性分子機制極好的天然材料[16]。關于SOD 酶活性對鹽脅迫的反應已有大量報道[6,17-22]，但截至目前，研究內容大多僅涉及鹽脅迫條件下SOD 酶活性的改變，隨著測序技術的發展和應用，尤其是在基因組及其轉錄物組學尺度的應用為植物抗逆分子機理的研究提供了極大便利。本研究選擇已有基因組測序數據的胡楊（P. euphratica）為對象，毛果楊（P. trichocarpa）、灰楊（P. pruinosa）、銀白楊（P. alba）、小葉楊（P. simonii）、美洲黑楊（P. deltoides）和紅皮柳（Salix purpurea）6 個楊柳科樹種為對照物種，結合基因組、轉錄物組、蛋白質物理化學性質及同源建模等方法的比較分析，探索了胡楊SOD基因家族及蛋白質對鹽脅迫條件響應的分子生物學特征，以期為植物耐逆境的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 SOD基因鑒定和DNA 序列獲取

從NCBI、Phytozome 和GigaScience 等數據庫下載胡楊（PopEup_1.0，NCBI）、毛果楊（Pop_tri_v3，NCBI）、灰楊（01.Ppr_genome，GigaScience）、銀白楊（ASM523922v1，NCBI）、小葉楊（Populus_simonii_2.0，NCBI）、美洲黑楊（Pde_NFU_2_2，NCBI）和紅皮柳（v1.0，Phytozome）全基因組組裝和注解文件，并構建本地Blast 索引[23]。直接下載已注解基因組（胡楊、毛果楊、銀白楊和紅皮柳）中SOD基因DNA 序列及其預測的編碼區序列（CDS）和蛋白質序列。利用NCBI 在線服務（Blastn 和Blastp）將CDS 和蛋白質序列分別比對到非冗余核酸（NT）和蛋白質庫（NR）以評估注解文件中對SOD基因注解的準確性，Blast 參數evalue 設置為10-5。對于尚未注解基因組（小葉楊、美洲黑楊和灰楊），使用Blast 軟件將上述準確注解的CDS 序列分別比對到基因組序列以確定各樹種包含SOD基因的基因組片段，提取基因片段然后使用GENSCAN 在線服務（http://hollywood.mit.edu/GEN SCAN.html）進行基因預測（設置擬南芥基因為參數文件）和注解[24]。當比對文件中CDS 序列對齊的基因區域內出現提前終止密碼子時，認定該基因為假基因。本研究還選用擬南芥（Arabidopsis thaliana）SOD基因作為進化分析的外類群。

1.2 轉錄物組數據獲取和基因表達量分析

為了分析SOD基因在耐鹽和非耐鹽楊屬樹種組織中的表達及對鹽脅迫響應的差別，本研究從NCBI 數據庫中下載了胡楊（耐鹽樹種，根組織：SRR5984052、SRR5984065 和SRR5984066；葉組織：SRR5983971、SRR5983972 和SRR5983973；愈傷組織：0 h SRR952753、6 h SRR952754、12 h SRR952725、24 h SRR952700～SRR952709 和48 h SRR952726）和對照樹種毛果楊（非耐鹽樹種，根組織：ERR1864412、ERR1864413 和ERR1864439；葉組織：ERR1864440、ERX1925298 和ERX1925 325；愈傷組織200 mmol/L NaCl 處理：0 h SRR 2029745、6 h SRR2029746、12 h SRR2029776、24 h SRR2029777 和48 h SRR2029778）轉錄物組測序原始數據。使用自編Perl 語言腳本對原始數據中測序質量值不高的Reads 進行剔除，條件如下：未知堿基（N）超過總讀長5%；低質量堿基（＜7）超過總讀長65%。

過濾后的數據使用Tophat 軟件（2.1.1 版本）比對到基因組序列，并用Samtools 軟件（1.10 版本）對輸出結果進行排序，參數默認設置[25-26]。使用Cufflinks 軟件（2.2.1 版本）分別組裝各樣本的轉錄本后，用Cuffmerge 套件將各樣品的轉錄本融合為單一轉錄組。最后使用Cuffdiff 套件計算每個基因的表達量并分析不同組織/處理組間基因表達量的差異[27]?；虮磉_量表示為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的fragments（FPKM）。在根和葉組織的比較分析中，本研究使用FDR 方法矯正后的P值作為評估差異顯著的依據，但由于愈傷組織鹽脅迫處理樣品沒有生物學重復，因此本研究所使用軟件是基于泊松分布簡單模型給出的原始P值作為評估差異顯著的依據，當P＜0.05 且樣本間FPKM 差異倍數大于2 時，認為差異顯著。此外，FPKM ＜1 時，則認為是不表達基因。

1.3 SOD基因系統發生關系重建和結構分析

SOD基因的系統發生關系構建選用CDS 序列，序列對齊使用Mega 軟件（7.0）完成[28]，其中因CDS 區出現提前終止密碼子導致的假基因，使用與其他樹種CDS 序列對齊的基因區域。系統發生關系推斷使用MrBayes 軟件（3.2.7a）完成[29]；基因結構繪制使用GSDS2.0 在線服務完成（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/），其 中Output（Phylogenetic Tree/Order）選項中選擇Tree 文件為上述貝葉斯法構建的基因樹。

1.4 SOD 蛋白質物理化學性質和結構分析

蛋白質序列物理化學性質使用Expasy 在線服務（https://www.expasy.org）完成，主要包括分子質量（MW）、等電點（pI）、總平均親水性（GRAVY）、氨 基酸 親水性（Hphob. / Kyte &Doolittle）和 極 性（Polarity / Grantham）。MSD蛋白質序列結構預測使用ESPript3.0 在線服務完成（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）。MSD 蛋白質同源建模使用Modeller 軟件（9.24 版本）完成，模板選擇擬南芥MSD1 的X 射線晶體衍射結構（Protein Data Bank 數據庫：4C7U）。設置a. ending model = 100，對每個蛋白質構建100個同源模型，采用GA341 和DOPE 方法對同源模型進行評估并選擇最優模型。蛋白質同源模型結構比較分析和可視化使用VMD 軟件（1.9.4a43版本）完成[30]。

2 結果與分析

2.1 楊柳科樹種SOD基因家族成員基因結構及系統發生關系

基因鑒定結果表明（表1），楊柳科樹種SOD家族包含CSD、MSD和FSD3 個亞家族，但在不同譜系中各亞家族成員經歷不同的基因復制、刪除和假基因化事件。擬南芥基因組中包含9 個SOD基因，包括3 個CSD、4 個FSD和2 個MSD基因，分布于1～5 號染色體的不同區域。楊柳科7 個樹種基因組中至少包含12 個SOD基因，其中胡楊、毛果楊、灰楊、銀白楊和紅皮柳基因組中均包含12 個SOD基因，小葉楊和美洲黑楊基因組中均包含15 個SOD基因。為了便于描述，本研究將3 個亞家族成員用阿拉伯數字和大寫英文字母進行了依次編號。

表 1 8 種植物的SOD 基因信息Table 1 Sources of SODgenes from 8 plant species

系統發生關系重建結果如圖1 所示，CSD、FSD和MSD3 個亞家族成員分別聚為基因樹的3 個主要分支，Bootstrap 支持率分別為1.00、0.84 和0.99。在CSD基因分支中，楊柳科樹種CSD1/2、CSD3/6/7和CSD4/5基因分別與擬南芥CSD1、CSD2和CSD3基因聚為一支，表明在擬南芥和楊柳科樹種共同祖先中至少存在3 種類型的原CSD基因。楊屬樹種CSD3/4/5/6/7分支中均只包含單拷貝基因分支，為1∶1 的直系同源基因。楊柳科樹種CSD1和CSD22 個分支，在特定譜系中均出現較高頻率的旁系同源分支，說明這2 個基因在楊柳科樹種中較高頻率地發生過譜系特異性基因復制事件。在FSD基因分支中，楊柳科樹種FSD1/3和FSD2基因分別與擬南芥FSD1/3/3A和FSD2基 因 聚 為2 個 主 要 分 支（Bootstrap 值分別為0.92 和0.99），為1∶1 直系同源關系。楊柳科樹種FSD1基因分支中，小葉楊雙拷貝的FSD1基因（FSD1和FSD1A）聚為一支后，與其他科樹種的單拷貝FSD1基因呈現出姊妹分支關系，說明小葉楊2 個旁系同源FSD1基因是一次近期基因復制事件的產物。楊屬FSD3分支呈現出1∶1 直系同源關系，但紅皮柳FSD3基因分支丟失，丟失可能源于一次譜系特異性基因刪除事件，因為楊屬樹種FSD3基因分支起源早于紅皮柳FSD1基因?；诨蚪M注解文件結果，楊柳科樹種FSD3基因產生后在后代譜系中迅速被無功能化，甚至被徹底刪除，這符合復制基因的假基因化進化命運假說[31]。在MSD基因分支中，楊柳科樹種明顯聚為MSD1和MSD2基因2 個分支，但Bootstrap 值都較低分別為0.47 和0.40。其中，楊柳科樹種MSD1基因分支中各基因為1∶1 直系同源關系，該分支與擬南芥MSD1/2形成姊妹分支關系。在楊柳科樹種MSD2基因分支中，除小葉楊MSD2基因出現雙拷貝外，其他楊柳科樹種的MSD2基因均為1∶1 直系同源關系。

續表 1

圖 1 楊柳科植物SOD基因結構和系統發育關系Fig. 1 Gene structure and phylogenetic relationship reconstruction of SODgenes in Salicaceae trees

2.2 胡楊和毛果楊根和葉組織中SOD基因的表達量

從NCBI 數據庫下載并分析胡楊和毛果楊（SOD家族基因個數均為12 個，且為1∶1 直系同源基因）根和葉組織的轉錄物組原始數據，以驗證胡楊SOD基因的組織表達特征和推測的假基因化事件。表達量分析結果如表2 所示，SOD 家族各基因在胡楊和毛果楊根和葉組織中展現出不同的表達模式。在胡楊中，有7 個基因（CSD3、CSD4、CSD5、CSD6、CSD7、FSD1和FSD2）在根和葉組織中的表達差異顯著（log2leaf/root ＞ 1或 ＜-1 且P＜0.05），且與根組織相比，葉組織中的表達水平均被顯著下調。根和葉組織表達量處于前4 位的SOD 家族基因均為MSD2、MSD1、CSD7和CSD3（根組織中的FPKM 分別為178.94、105.67、29.87 和11.01；葉組織中的FPKM 分別為156.39、192.17、67.09 和51.33）。

表 2 SOD基因家族在胡楊和毛果楊根、葉組織的表達量差異分析Table 2 Expression level of SODgenes in root and leaf tissues of P. trichocarpaand P. euphratica

2.3 胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD基因對NaCl脅迫的響應

為探索NaCl 脅迫對耐逆和不耐逆境楊屬樹種SOD基因表達的影響，本研究使用實驗條件一致（愈傷組織，NaCl（200 mmol/L）處理48 h，采樣時間為0 、6 、12、24、48 h）的胡楊和毛果楊轉錄組基礎數據進行了基因表達量分析，結果見圖2。在0 h（對照組）時，與上述根和葉組織中的表達量分析結果相符，MSD1和MSD2基因仍是胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD家族的高表達基因（圖2c，毛果楊FPKM 分別為122.23 和77.28；圖2f，胡楊FPKM 分別為178.35 和51.35），而CSD和FSD兩個亞家族的主要表達基因與相應樹種的根和葉組織相比明顯不同，胡楊CSD1和CSD2基因、毛果楊CSD2和FSD1基因的表達量處于前4 位，FPKM 分別為130.11、85.56、24.37和17.91（圖2a、d）。與根和葉組織相似，FSD亞家族基因在毛果楊和胡楊愈傷組織中的表達水平均相對較低（僅毛果楊FSD1基因的FPKM 超過10，圖2b），該結果表明FSD亞家族在楊屬樹種抗氧化酶系統中的功能可能處于次要地位。另外，在胡楊和毛果楊的根和葉組織中FSD3甚至不表達（表2，FPKM 值極低，范圍為0.11～1.85），該結果進一步證實胡楊FSD3基因已被假基因化。

圖 2 毛果楊（a、b、c）和胡楊（d、e、f）愈傷組織中SOD基因表達對短期NaCl 脅迫的響應Fig. 2 The expression of SODgenes in response to short-term NaCl stress from callus ofP. trichocarpa(a, b, c) and P. euphratica(d, e, f)

胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD基因在短期鹽脅迫條件下的轉錄動力學差異較為明顯。在CSD亞家族中，毛果楊（圖2a）多數基因均展現出上調（0～6 h）、下調（6～12 h，12～24 h）和再上調（24～48 h）的模式，而胡楊（圖2d）多數基因則展現出較為單一的調節模式，經急性下調（0～6 h）后保持穩定（6～48 h）。種內各采樣時間點的兩兩比較結果顯示（表3），毛果楊各基因的表達差異均不顯著，胡楊CSD1（0 h vs. 6/24/48 h）、CSD2（0 h vs. 12 h）和CSD7（0 h vs. 12 h）3 個基因被顯著下調，P＜0.05 且 log2FC ＞1 或 ＜-1（FC 為 差 異 倍 數）。在MSD亞 家 族中，毛果楊（圖2c）MSD1基因與CSD亞家族基因的表達模式一致，展現出上調（0～6 h）、下調（6～12 h）和再上調（12～48 h）的模式（兩兩比較差異不顯著），而胡楊（圖2f）MSD1基因則表現出連續上調的模式（0 h vs. 48 h 差異顯著）。此外，2 個樹種MSD2基因對鹽脅迫條件響應的敏感度均明顯低于MSD1基因。在FSD亞家族中，毛果楊FSD1基因的表達被連續抑制，兩兩比較結果顯示，0 h vs. 12/24/48 h 時差異均顯著（圖2b 和表3）。

表 3 NaCl 脅迫處理不同時間下胡楊和毛果楊SOD基因表達的種內差異分析Table 3 Pairwise comparison analysis of SODgene expression levels in different periods of NaCl stress within species

2.4 MSD 蛋白質的結構和理化性質

截至目前，高等植物中僅擬南芥MSD 已有蛋白質X 射線晶體衍射結構（4C7U）。結構文件顯示，擬南芥MSD 蛋白質為同源四聚體結構，每條多肽鏈活性中心有一個Mn2+。序列比對結果顯示（圖3），基因預測多肽序列N 端的21～22個氨基酸殘基在結構文件中丟失。與其他類群MSD 蛋白質結構文件比較分析發現，人類（1N0J）和秀麗隱桿線蟲（3DC6）等也存在相似的現象，說明MSD 在體內組裝成成熟蛋白質的過程中存在加工修飾。楊屬樹種MSD2 與MSD1預測多肽序列的差異主要是N 端前12～15 4 個氨基酸殘基的缺失，因此2 種類型的MSD 蛋白質結構可能差別不大。如果2 種MSD 蛋白質在生物學功能上存在差異，那么功能的差異可能主要來自20 位以后氨基酸殘基的突變。

圖 3 楊屬6 種植物的MSD1 和MSD2 氨基酸序列分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment of MSD1 and MSD2 from 6 Populusspecies

胡楊和毛果楊MSD 蛋白質理化性質分析結果表明（表4），2 個樹種的2 種MSD（MSD1 和MSD2）均為穩定蛋白質，但穩定性較差（不穩定系數略小于40），其中胡楊2 種MSD（MSD1和MSD2 的不穩定系數分別為36.12 和38.98）蛋白質的穩定性均高于毛果楊（MSD1 和MSD2 的不穩定系數分別為37.86 和39.39）。與MSD2 相比，2 個樹種的MSD1 蛋白質理論pI 均明顯降低（胡楊MSD1 和MSD2 分別為5.97 和5.77；毛果楊MSD1 和MSD2 分別為6.17 和5.91），蛋白質堿性增強；GRAVY 數值均明顯降低（胡楊MSD1 和MSD2 分別為-0.465 和-0.514；毛果楊MSD1 和MSD2 分別為-0.476 和-0.519），蛋白質親水性增強。蛋白質氨基酸序列極性和親水性分析結果表明（圖4），2 個樹種MSD2 蛋白理論pI 和GRAVY 的降低與極性氨基酸（堿性）突變密切相關。

表 4 胡楊、毛果楊MSD1 和MSD2 的物理化學性質比較Table 4 The physicochemical properties of MSD1 and MSD2 in P. trichocarpaand P. euphratica

圖 4 胡楊、毛果楊MSD1 和MSD2 多肽氨基酸殘基的親水性和極性分析Fig. 4 The hydrophilicity and polarity of amino acid residues in MSD1 and MSD2 polypeptides ofP. trichocarpaand P. euphratica

與毛果楊相比，胡楊MSD1 和MSD2 氨基酸序列分別有5 個（37I-V、97S-N、118T-A、187K-T和202H-N）和2 個（5S-T 和97R-N）位點突變，其中MSD1 的118T-A 為親水氨基酸到疏水氨基酸的突變，MSD1 的187K-T 和202H-N 以及MSD2 的97R-N 為堿性氨基酸到中性氨基酸的突變。蛋白同源模型比較分析結果（圖5）顯示，上述所有突變均位于蛋白質亞基單體的表面，且遠離蛋白質活性中心（Mn2+附近區域），推測胡楊2 種MSD 蛋白質的氨基酸突變對酶活性的影響較小。值得注意的是，MSD1 靠近C 末端的187 和202 位以及MSD2 的97 位3 個突變位于四聚體的接觸面。其中MSD1（187K-T）和MSD2（97R-N）突變分別在AB/CD 和BD 亞基接觸面區域引入了1 個額外的氧原子，該氧原子可能通過與相鄰亞基區域形成額外的氫鍵穩固亞基間的相互作用，但對亞基間的距離影響不大（毛果楊MSD1 的AB、CD 亞基中187Lys:Cα 和30Gln:Cα 的距離分別為7.54 和7.26 ?，MSD2 的BD 亞基97Arg:Cα 和2Gln:Cα 的距離分別為7.28和6.29 ?；胡楊MSD1 的AB、CD 亞基187Thr:Cα和30Gln:Cα的距離分別為7.55 和7.30?，MSD2的BD 亞基97Asn:Cα 和2Gln:Cα 的距離分別為7.64 和6.31 ?）。MSD2 的202H-N 突變在BD 亞基接觸面引入了2 個額外的氧原子，額外的與氧原子可能在該區域至少形成2 個額外的氫鍵，使該區域內亞基相互作用增強。這種區域內相互作用的增強最終拉近了B 和D 亞基間的距離（毛果楊BD 亞基202位2 個His:Cα 的距離為6.30，胡楊BD 亞基202位2 個Asn:Cα 的距離為5.54）使得BD 亞基間的剛性增強。

圖 5 胡楊和毛果楊MSD1 和MSD2 同源模型比較分析Fig. 5 Comparative analysis of MSD1 and MSD2 homology modeling from P. trichocarpaand P. euphratica

3 結論與討論

Scioli 等[32]對豌豆SOD基因cDNA 的成功克隆和鑒定標志著植物SOD家族的研究進入到基因水平。隨著測序技術發展和應用，逐步加深了人們對SOD在分子水平的認識。在植物基因組中，盡管SOD基因家族均由CSD、FSD和MSD3 個基因亞家族組成，但各亞家族成員的數量存在較大差別，如番茄、高粱（Sorghum bicolor）、香蕉（Musa acuminata）和葡萄（Vitis vinifera）基因組中3 個亞家族成員組成模式分別為4-4-1、5-2-1、6-2-4和6-2-2[32-36]。與Molina-Rueda等[37]的研究結果相符，本研究在胡楊基因組中鑒定到12 個SOD基因家族成員，由7 個CSD、3 個FSD和2 個MSD基因組成，其中FSD3基因已假基因化。在另外5 種楊屬樹種中，毛果楊、灰楊和銀白楊3 個樹種基因組中SOD基因家族的數量與胡楊一致，灰楊和銀白楊（分別為CSD3和FSD3基因）中也有1 個基因被假基因化；小葉楊（CSD1和FSD1基因）和美洲黑楊（CSD1和CSD2基因）基因組中均有2 個基因發生過至少1 次基因復制事件。在基因樹中，楊柳科CSD1與CSD2、CSD3與CSD6/7、FSD1與FSD2、MSD1與MSD2分支互為旁系同源關系，這可能與楊柳科樹種在進化歷史上發生過1 次全基因組復制事件密切相關[38]?；蚪M復制事件后，絕大多數SOD基因的旁系同源基因在后代譜系中保留（除FSD2和CSD4/5分支外）。值得注意的是，擬南芥在進化歷史上發生過2 次全基因組復制事件（α 和β），理論上SOD基因家族應成4 拷貝形式出現，但現存物種基因組中多數基因卻僅保留1～2 個拷貝。楊屬樹種中SOD這種優先保留模式和通過單基因復制的擴張模式可能暗示了它們在多年生木本植物中對氧化脅迫響應的重要性。

亞細胞定位研究結果顯示，擬南芥MSD主要在線粒體中表達，FSD主要在葉綠體中表達，CSD主要表達部位為細胞質（CSD1）和葉綠體（CSD2和CSD3）[39]。線粒體是機體有氧代謝的活性中心，為產生活性氧的主要細胞結構之一，MSD在線粒體中的高表達對維持線粒體內氧自由基平衡起到關鍵作用。與實時定量PCR 的研究結果相符[37]，MSD亞家族的2 個基因在胡楊根和葉組織中的表達均占優勢，說明MSD可能作為胡楊SOD家族的組成型表達基因在各組織線粒體中均起到抗氧化的主導作用。在CSD基因亞家族中，毛果楊CSD2和CSD6基因在根和葉組織中的表達量遠高于胡楊（40.59 倍和4.30 倍）。該結果與對豌豆[14]的研究結果相符，長期逆境脅迫引起CSD2酶活性的升高。毛果楊作為生長最迅速的楊屬樹種，在適宜條件下根、葉組織中的營養物質主動運輸和光合速率可能遠高于胡楊[40]，由此推測CSD2和CSD6可能在速生楊品種的主動運輸和合成代謝活躍的特定組織中長期發揮功能，這符合CSD基因功能的進化起源假說[41]。在FSD基因亞家族中，FSD1基因在胡楊葉組織中的表達量較高（FPKM 為22.64），約為毛果楊的3.14 倍；大量的研究結果證實，FSD高表達可以有效保護葉綠體免受逆境脅迫引起的氧化損傷[42]，說明胡楊FSD1基因的高表達是其適應逆境環境的特征之一。此外，在NaCl 短期脅迫條件下，胡楊愈傷組織中大部分基因呈現出波動或下調表達的趨勢，僅MSD1基因的表達被持續上調，說明在胡楊SOD基因家族中MSD1可能響應鹽脅迫最敏感，是胡楊具有較強耐鹽脅迫能力的主要因素之一。上述結果與對鹽敏感和耐受的番茄和豌豆品種的比較分析結果高度相符[12-14]，說明MSD 酶活性的升高可能是鹽耐受品種普遍的適應策略。

在胡楊和毛果楊中，MSD1 蛋白質的穩定性明顯高于MSD2，且胡楊的2 種MSD 蛋白質穩定性均高于毛果楊。2 種MSD 蛋白質穩定性升高具有相似的分子機制，均是通過發生在亞基間接觸位置的氨基酸突變引發的（不同的突變，相似的結果）。與毛果楊相比，胡楊MSD1（187K-T和202H-N）和MSD2（97R-N）3 個氨基酸突變均在亞基間接觸位置引入了額外的氧原子，這些額外的氧原子可能通過氫鍵相互作用使四聚體蛋白質變得更穩定。穩定的蛋白質結構有利于2 種MSD 在有氧代謝活躍的線粒體中積累到更高的濃度，從而增加其在逆境條件下清除過量自由基的能力。因此，本研究推測胡楊MSD1 對逆境環境的適應涉及基因表達的調節與蛋白質結構的共同進化，上述推測以及氨基酸突變對蛋白質功能的影響尚需實驗進一步驗證。