小麥耐低磷基因型的鑒定和篩選

魏亞宵，汪軍成，姚立蓉，司二靜，楊軻，孟亞雄，李葆春，王化俊，尚勛武，馬小樂

（1. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070）

磷素是生命體中核酸、蛋白質等有機物的重要組分，且參與了植物諸如光合作用、呼吸作用、能量轉化和酶促反應等多種物質和能量代謝，是植物生長發育的必要元素。我國耕地土壤60%以上嚴重缺磷，為了保證產量只能額外補施磷肥［1］。土壤中的磷酸鹽很不穩定，容易被氫氧化物、鐵鋁氧化物還有鈣離子吸附從而形成難溶性化合物［2］，能夠被作物吸收和利用的磷素十分有限。磷礦資源具有不可再生性，而我國磷礦資源也并不豐富，農田磷肥主要依賴于進口［3］。如何減緩磷礦的耗竭和減少磷肥施入，篩選和培育耐低磷作物品種具有重要意義，是解決土壤中有效磷匱乏而保持產量相對穩定、保護農業生態環境的重要解決措施之一。

大量研究表明，同一種植物的不同品種對土壤中磷的活化，吸收以及利用會因其遺傳背景的不同而具有明顯的差異，同類作物在受到低磷脅迫時，不同品種的適應性和磷素的利用效率也存在顯著差異［4-6］。研究同一植物不同品種間對磷素耐性的差異，篩選耐低磷和磷高效的品種，減少磷肥的施用量，可以在一定程度上緩解土壤磷資源危機問題。目前關于耐低磷種質資源的篩選與評價主要是在小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）等作物中已有研究［7-9］。耐低磷品種通常是采用苗期生物學性狀、成株期株高、千粒質量等性狀進行篩選評價。小麥是最重要的、種植面積最廣的糧食作物之一，在我國農業生產中有著舉足輕重的地位［10］。孫慧敏［11］等研究表明，在磷素供應充足時，會促進小麥快速發育和植株體內碳氮的正常代謝，保證干物質對磷素的要求，有利于干物質的積累，提早成熟；而在嚴重缺磷的情況下，小麥次生根僅少量發生或幾乎沒有。在小麥耐低磷種質的篩選中，通常采用苗期篩選體系，因苗期是小麥生長發育的初期階段，其磷素的供應情況會對幼苗質量以及生育期壯苗影響較大，因此苗期對逆境脅迫處理相對較敏感，且在苗期篩選成本較低，此階段是進行小麥耐低磷種質篩選的較好時期。

本試驗通過研究不同施磷水平對供試材料苗期生長的影響，測定各小麥品種性狀并運用隸屬函數法對其進行綜合評價分析并排序，為篩選耐低磷小麥品種，為節約磷肥資源以及保護農業生態環境提供了基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用9份小麥品種為材料，分別為西旱2號、隴春9786、甘春26號、西旱3號、隴春23號、中麥175、寧春4號、隴春27號、新春17號。所選材料為甘肅省干旱生境作物學重點實驗室麥類種質創新課題組在80份材料中進行初步低磷篩選而定的。

1.2 試驗設計

每份材料挑選籽粒飽滿大小一致的種子，先用5% NaClO溶液消毒5 min，之后用蒸餾水沖洗3次，將種子均勻間隔移入裝有蛭石的花盆中，每盆15株，出苗后選取長勢一致的幼苗留苗10株，將盆栽置于人工氣候室中，溫度為22 ℃，濕度為45%，16 h/8 h光照黑暗交替處生長。每天澆定量水，當小麥苗長長到4～5 cm 時，開始澆營養液，配比參照劉露露的方案［12］。 設置正常磷（0.5 mmol/L）和低磷（0.05 mmol/L）2個處理。KH2PO4做為磷源，同時在低磷脅迫的營養液中加入相應濃度的KCl溶液以補充K 元素，其余營養液的成分均相同。將最開始澆營養液的時間記為0 d，每5 d 澆1 次，每個處理3 次重復，處理至第20天時取樣測定其苗期性狀。

1.3 測定指標

1.3.1 葉綠素含量的測定 參照蘇娜的方法用葉綠素儀（ SPAD-502Plus）進行葉綠素含量的測定［13］。

1.3.2 苗長測定 測量從莖基部到頂葉葉尖的長度。

1.3.3 生物量的測定 將樣本洗凈，置于105 ℃洗烘箱殺青15 min，然后以80 ℃后烘至恒質量，烘干后用電子天平稱量，記為干質量。

1.3.4 根系性狀的測定 用清水沖洗幼苗的完整根系。采用根系掃描儀（Epson，Long Beach，CA，USA）和WinRHIZO 軟件（Quebec，QC，CAN）計算總根長、總根面積和總根體積等根系性狀數據［14］。

1.4 數據分析

使用IBM SPSS Statistics 23分析供試材料各性狀間的相關性和主成分，并依據隸屬函數對供試品種進行聚類分析和綜合評價。

式中：μ（Xi）為第i個綜合指標的隸屬函數值，Xi為第i個綜合指標值，Xmax為第i個綜合指標的最大值，Xmin為第i個綜合指標的最小值。

各綜合指標權重的計算：

式中：Wi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度及權重；Pi為各品種第i個綜合指標的貢獻率。

綜合評價D值的計算：

式中：D值表示不同小麥品種在KH2PO4的濃度在0.05 mmol/L和0.5 mmol/L時的綜合評價值。通過計算加權隸屬函數值所得D值。

2 結果與分析

2.1 各性狀間耐低磷系數及相關性分析

通過同一指標的低磷測量值與正常磷測量值計算出耐低磷系數可以在一定程度上消除品種間的固有差異，可以較為準確的反映供試小麥品種對低磷環境的耐性。通過分析供試品種苗期各性狀的耐低磷系數（表1），結果表明，地上干質量耐低磷系數的范圍為0.74～0.97，其中地上干質量耐低磷系數最大的3 個品種依次為新春17 號、西旱2 號和中麥175，值為0.97、0.94和0.93，而地上干質量耐低磷系數較小的為隴春23 號和寧春4 號，為0.74 和0.76。地下干質量耐低磷系數的范圍為0.60～1.17，其中地下干質量耐低磷系數較高的品種由大到小依次為西旱2號、新春17 號和中麥18，分別為1.17、1.156 和1.01。而地下干質量耐低磷系數較小的品種為寧春4號和隴春23號，為0.60和0.69。

表1 苗期性狀的耐低磷系數Table 1 Low phosphorus tolerance coefficient of seedling traits

通過對各個小麥品種所測定性狀的耐低磷系數進行相關性分析（表2），結果表明，地上干質量與地下干質量的耐低磷系數呈極顯著正相關關系，相關系數為0.93；葉綠素含量與根體積為極顯著正相關關系，相關系數為0.80；苗長與根投影面積的耐低磷系數呈顯著性正相關，相關系數為0.72。

表2 苗期性狀耐低磷系數的相關性Table 2 Correlation of low phosphorus tolerance coefficient of seedling traits

綜上所述，通過對耐低磷系數和對其進行相關性分析后表明，在低磷環境中，不同小麥品種苗期地上部與地下部的生長是呈正相關性關系，根的生長對植株地上部分的生長起著至關重要的作用，小麥不同品種根系部的生長在一定程度上決定了該基因型對低磷環境的適應程度。

2.2 各性狀間耐低磷系數的主成分分析

對供試小麥材料苗期各性狀的耐低磷系數進行主成分分析（表3），結果顯示，前3 個主成分貢獻率分別為33.65%，30.46%和22.90%，累計貢獻率為87.01%。選擇這3個主成分作為小麥苗期各性狀耐低磷評價的主要因子。主因子與各個性狀之間的相關程度由載荷量的高低來反映（表4），而且一般認為大于0.3 的載荷是顯著的［15］。第1 主成分的特征值為2.70，與苗長、根表面積、地上干質量、總根長、根投影面積和地下干質量的相關性最大。第2主成分的特征值為2.44，載荷較高的是葉綠素含量，根體積和根表面積。第3主成分的特征值為1.83，載荷較高的是地上干質量，地下干質量和根體積。通過對耐低磷系數進行主成分分析后表明，根系性狀是評價小麥品種對低磷脅迫耐性的重要指標。

表3 特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalue and contribution rate

表4 苗期性狀耐低磷系數的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of low phosphorus tolerance coefficient for seedling traits

綜上，前3個綜合指標的累計貢獻率為87.01%，說明前3個綜合指標可以代表苗期所測指標的大多數信息，因此將原數據中所測的指標轉化為3個綜合指標，之后將用這3個綜合指標對供試材料進行綜合性分析。

2.3 各性狀間耐低磷系數的聚類分析和耐低磷種質篩選

根據對耐磷響應系數的主成分分析分別得到3個相互獨立的綜合指標，計算不同品種各綜合指標的隸屬函數值μ（Xi）。從表5可以看出，在同一綜合指標C1中，新春17號的值最大，為1.946。表明新春17號低磷響應最弱，較耐低磷。根據各綜合指標貢獻率，計算其權重Wi，計算得到與耐磷性相關的3個綜合指標權重分別為 0.39，0.35，0.26。進一步計算綜合評價值D，并根據D值進行綜合性狀分析，進而得知：新春17號相對耐低磷，其次為中麥175、甘春26號、隴春27號、西旱3號、隴春23號、隴春9786、寧春4號和西旱2號相對為磷敏感的小麥材料。

表5 供試品種的綜合性狀指標、權重、μ（X）及綜合評價值（D）Table 5 Comprehensive trait indicators，weights，μ（X） and comprehensive evaluation values （D） of varieties

采用平方歐式距離法對供試小麥品種各性狀的D值進行聚類分析（圖1），歐式距離為 3時可將其劃分為3個等級，第Ⅰ類為新春17號、中麥175與甘春26號這3 份材料，D值分別為0.80、0.78 和0.73；第Ⅱ類為隴春27 號、西旱3 號和隴春23 號，D值分別為0.53、0.51和0.48；第Ⅲ類隴春9786、西旱2號和寧春4號這3份材料，D值分別為0.41、0.39和0.37。

圖1 小麥材料苗期的耐低磷性聚類圖Figure 1 Cluster diagram of low-phosphorus tolerance of wheat materials at seedling stage

綜上所述，通過結合聚類分析和各個材料的綜合評價值D值最終篩選出耐低磷基因型的材料新春17號和中麥175。

2.4 不同施磷水平下所篩小麥品種苗期性狀差異

對篩選的耐低磷小麥材料：新春17 號和中麥175，磷敏感材料：西旱2號和寧春4號的苗期生長性狀進行比較分析（圖2）。在低磷脅迫下，地上干質量和葉綠素含量均低于正常施磷水平，其中，在地上干質量中，寧春4號在不同施磷水平下差異顯著，低磷脅迫較對照降低23.62%，葉綠素含量中西旱2 號和寧春4 號差異均顯著，低磷處理較對照分別下降24.75%和13.01%。在苗長中，新春17 號和寧春4號在不同施磷水平差異均顯著，且低磷脅迫的苗長較正常施磷水平分別高20.00%和18.72%。新春17號，中麥175和西旱2號在低磷脅迫處理下的地下干質量高于正常施磷水平，分別高15.79%、1.25%和16.67%，寧春4 號脅迫處理下較正常磷低39.84%，達到顯著水平。在根體積中，中麥175在低磷脅迫下較正常施磷高37.64%，達到顯著水平，而新春17 號在兩處理間差異不大，在根表面積中，材料新春17號和中麥175在兩處理間差異不大。西旱2號和寧春4號在脅迫處理下根體積和根表面積均低于正常供磷水平，根體積降低52.77%和20.03%，根表面積降低33.78%和32.94%，均達到顯著水平。綜上所述，新春17號和中麥175的苗期各生長性狀在低磷脅迫下與正常供磷水平相比較，差異不大或高于正常供磷水平，而西旱2 號和寧春4 號的差異較大，且較多低于正常供磷水平，在根系部的生長性狀上體現較為突出。因此，新春17 號和中麥175 為耐低磷基因型材料，西旱2號和寧春4號為磷敏感型材料。

3 討論

采用綜合指標對作物的抗逆能力的評價在水稻［16］、苜蓿［17］、谷子［18］中等已被常用，苑乂川［18］在谷子苗期耐低磷種質的篩選中用隸屬函數法對所測定的160 份材料的苗期株高、根長、地上鮮質量、地下鮮質量、葉長、葉寬、莖粗、地上磷含量、地下磷含量、地上干質量和地下干質量等11個指標的耐低磷系數通過主成分分析得到4個相互獨立的綜合指標，前4個主成分的累計貢獻率為83.05%，代表原指標的極大部分的信息，利用4個相互獨立的綜合指標對不同谷子的耐低磷特性進行客觀的評價分析。在本研究中，通過對耐低磷系數的主成分分析，將小麥苗期所測定的地上干質量、葉綠素含量、苗長、地下干質量、根體積、總根長、根表面積和根投影面積這8個性狀指標分別轉化為3個綜合指標，前3個主成分的累計貢獻率為87.01%，使評價工作簡化且客觀準確，然后采用隸屬函數法對各小麥品種苗期的耐低磷特性進行評價，避免了單個指標描述耐低磷特性的局限性。

劉厚誠與劉富貴研究表明，低磷脅迫會嚴重影響植株地上部分的生長，葉面積的減少，株高下降，地上部分以及地下部分干物質重量的下降［19-20］。但是在本研究中，苗長的耐低磷系數除隴春49和甘春26 號小于1 外，其余小麥品種苗長的耐低磷系數均大于1，表明在低磷脅迫處理下苗長高于正常磷處理，這與前人的研究結果相悖，可能是由于在處理20 d 取樣測其性狀有關，小麥種子所含磷素可能會影響小麥苗長。前人研究表明，供磷水平過低會抑制植物的生長，主要表現為生物量減少等。良好的根系是植物適應低磷環境的重要條件，根系在抵抗低磷脅迫環境壓力時可以產生可塑性的變化［21-22］。本研究中，在低磷處理下小麥的地上部分的生長均受到脅迫影響，地下干質量耐低磷系數大的品種地上干質量的耐低磷系數值也較大，根系的生長狀況對地上部生長至關重要。因此，根系部的生長狀況對品種耐低磷的特性有很大的影響，這與前人的研究結果一致。本研究初步探究了供試小麥材料的耐低磷的能力，但若要將其用于農業生產上，還需要進一步進行大田試驗和全生育期特征特性的比較與驗證。