秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 對白血病細胞K562/ADR多藥耐藥性的逆轉作用

白宇，馮文雯，孫延慶，2

（1. 甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅省人民醫院血液內科，甘肅 蘭州 730030）

慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種起源于造血干細胞惡性增殖性腫瘤。CML 全球年發病率為1.6/10萬～2.0/10萬，發病中位年齡為67歲［2］。目前，化療是CML治療的重要手段之一，而腫瘤多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）的產生，使其治療效果仍不理想。多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1） 的過度激活和產物P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp）表達升高是多藥耐藥性產生的主要原因之一［3］。MDR1是ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族成員之一，編碼的P-gp 蛋白具有藥物外排泵功能，已被證明與耐藥復發有關［4］。此外，信號通路的調節和改變，在白血病耐藥產生過程中也扮演了重要角色，包括經典的NF-κB［5］，BMP［6］，Wnt/β-catenin［7］，MAPK［8］等通路。胃癌細胞KATO III/VCR 中，過表達的抗凋亡蛋白Siva-1可激活NF-κB信號通路，引起MDR1 和MRP1 蛋白表達增加，促使胃癌細胞對 VCR、5-氟尿嘧啶和阿霉素的敏感性顯著升高［9］。其他耐藥相關機制還包括，凋亡通路阻斷［10］，藥物靶點改變［11］，表觀遺傳因素影響［11］，微小RNA 調控［12］及耐藥細胞微環境［13］等?？梢?，探尋能夠從多靶點、多機制逆轉腫瘤多藥耐藥性的藥物或方案具有重要意義。

近年來中藥提取物已被廣泛用于腫瘤耐藥的治療和研究當中，取得了一定療效［14］。食用菌秦巴硒菇（Agaricus blazei）中多種提取物，被證實具有提高免疫力［15］，調節血脂血糖［16］，抑制腫瘤細胞增殖［17］，抗病毒［18］等功效。有研究發現，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 能增加3'-疊氮-3'-脫氧胸腺核苷（Zidovudine，AZT）對胃癌細胞的抑制率［19］，這提示FA-2b-β 可能與化療藥物的增敏有關，但具體作用方式和詳細機制尚不明確。因此，本研究選取秦巴硒菇提取物FA-2-b-β，測定其對耐藥細胞K562/ADR的增敏效果及凋亡作用，并對耐藥基因MDR1及編碼的P-gp蛋白，和NF-κB通路中關鍵分子p65進行檢測，以期闡明FA-2b-β潛在作用機制，為CML 的臨床治療和用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組

慢性髓系白血病K562 細胞由蘭州大學第二附屬醫院實驗室饋贈，K562/ADR 細胞購自于寧波明舟生物科技有限公司，在含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養中加入1 μg/mL 阿霉素（Adriamycin，ADR）維持K562/ADR耐藥性，并置于37 ℃、含5%的CO2的條件下培養。試驗分為空白組（2種細胞不加任何干預做對照）、秦巴硒菇FA-2-bβ干預組（對兩種細胞施加FA-2b-β，濃度依次為1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）、阿霉素干預組（對2種細胞施加阿霉素，分別測定其對阿霉素的反應，濃度依次為5、10、15、20 μmol/L），以及聯合用藥組（對耐藥株K562/ADR 細胞施加低毒性秦巴硒菇FA-2-b-β干預，再聯合阿霉素進行檢測）。對于各藥物濃度選取，參照本課題組前期研究以及相關文章確定。

1.2 試劑與儀器

秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 由北京同仁堂成都有限公司提供，青霉素-鏈霉素混合液購自德國Hyclone 公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries，總RNA 提取試劑盒試劑、Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR 反轉錄試劑盒、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 擴增試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司，Annexin VFITC/PI雙染凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，CCK-8 細胞計數試劑盒購自于奧默生物技術（上海）有限公司、BCA 試劑盒、ECL 化學發光顯色試劑盒均購自中國上海碧云天生物公司，P-gp Mouse mAb、IκBα Rabbit mAb、p65 Mouse mAb、p53 Mouse mAb、BAX Rabbit mAb、BCL-2 Mouse mAb、HRP-山羊抗小鼠、HRP-山羊抗兔均購自于中國，Servicebio公司公司。熒光顯微鏡IX51購自日本奧林巴斯公司，酶標儀FC購自美國賽默飛公司，熒光定量PCR儀、凝膠成像分析儀購自美國伯樂Bio-Rad 公司，流式細胞儀FACSVia 購自美國BD公司。

1.3 CCK-8 法檢測細胞存活率

依照5×104/mL 密度接種細胞于96孔板中，并用不同濃度FA-2-b-β以及阿霉素分別處理24、48、72 h后加入10 μL CCK 8 溶液，繼續孵育2 h。酶標儀測量每孔450 nm 處光密度（D）值，計算抑制率及耐藥倍數。

抑制率（%）=［1-（試驗組D-空白組D）/（對照組D-空白組D）］×100%

選取FA-2-b-β對K562/ADR細胞的低毒濃度（IC90），并聯合阿霉素再次干預K562/ADR 細胞，計算逆轉倍數。

1.4 RT-PCR 檢測細胞中相關基因mRNA 的表達

各濃度FA-2-b-β處理每組細胞48 h后，收集并提取總RNA，進行目的基因逆轉錄及擴增。反應體系為 20 μL，反應條件：95 ℃ DNA 聚合酶激活20 s，95 ℃變性 3 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環。rt-PCR 試驗數據結果采用2-△△Ct進行分析，試驗重復3次。

1.5 Western-blot 檢測細胞中相關蛋白的表達

各濃度FA-2-b-β 處理細胞48 h 后，采用BCA法測定蛋白濃度，制膠并電泳，再將蛋白轉至PVDF膜封閉2 h。洗去封閉液，一抗（1∶1 000）孵育4 ℃過夜。再加入對應二抗（1∶5 000），孵育2 h，TBST 洗膜3 次，最后加入ECL 發光液，反應2 min 后上機曝光。試驗重復3 次。Image J 軟件分析結果條帶灰度值。

1.6 免疫熒光檢測P-gp蛋白表達

將細胞以2×104個/孔接種于爬片上，經各濃度FA-2-b-β處理48 h后，待固定、封閉結束，加入一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，后加入熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1.5 h，使用DAPI 染核 3 min，滴加熒光防淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.7 流式細胞術檢測胞內藥物蓄積情況

不同濃度FA-2-b-β（0、1、2、3 mg/mL）處理細胞48 h，吸棄培養基并清洗各孔，加入含10 μmol/L ADR 的新培養基，避光孵育2 h。加入300 μL 的預冷PBS重懸，尼龍網過濾后上機檢測。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集不同濃度各組處理后的細胞，PBS 清洗3次。依次加入Annexin V-FITC 結合液300 μL、Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL 重懸細胞，4 ℃避光孵育15 min，尼龍網過濾后上機檢測。

將細胞以2×104個/孔接種于爬片上，經各濃度FA-2-b-β處理48 h后，固定并加入DAPI染色劑染色5 min，PBS 清洗細胞于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 流式細胞術檢測細胞周期

收集六孔板中處于對數生長期各組細胞，加入不同濃度FA-2-b-β 處理48 h 后棄上清，清洗1 次，無水乙醇于-20 ℃固定過夜。再次重懸細胞，加入100 μL 的RNase A，37 ℃ 孵育15 min，加入400 μL PI 染色，4 ℃避光孵育30 min，過濾并上機檢測。Modfit軟件分析結果。

1.10 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。計量資料用xˉ±s表示，多組比較采用方差分析（ANOVA），兩兩比較使用配對t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 秦巴硒菇FA-2-b-β和阿霉素對K562、K562/ADR細胞增殖抑制作用

不同濃度FA-2-b-β 和阿霉素處理K562、K562/ADR 細胞后，存活率隨濃度及時間增加而下降（圖1）。秦巴硒菇FA-2-b-β對2種細胞的IC50分別為1.05、3.42 mg/mL；ADR對2種細胞的IC50分別為0.452，18.2 μmol/L，耐藥系數為40.2。

圖1 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β對CML細胞增殖的影響Figure 1 Effect of FA-2-b-β on CML cell proliferation

選取低毒濃度FA-2-b-β（IC90=1.08 mg/mL）干預后的K562/ADR細胞，發現此時ADR對K562/ADR 細胞的IC50為10.99 mg/mL，逆轉耐藥倍數為1.65倍（表1）。與對照組比較，經秦巴硒菇FA-2-bβ分別處理后的2種細胞抑制率均顯著升高，且FA-2-b-β 聯用阿霉素組細胞增殖抑制率較單用阿霉素組升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β對K562/ADR細胞的耐藥逆轉作用Table 1 Anti-drug reversal effect of FA-2-b-β on K562/ADR cells

倒置顯微鏡觀察完全培養基中K562/ADR 細胞形態，Control 組（0 mg/mL）FA-2-b-β 中細胞胞質透亮均勻，核仁區域形態正常，細胞生長較好。試驗組干預48 h 后各組細胞胞質染色加深，透光性減弱，凋亡細胞胞膜破裂，內容物大量釋出并附著于膜上（圖2）。提示FA-2-b-β 對K562/ADR 細胞生長具有明顯抑制作用。

圖2 秦巴硒菇提取物 FA-2-b-β對K562/ADR細胞干預48 h后形態學的影響Figure 2 Effect of FA-2-b-β on the morphology of K562/ADR cell intervention after 48 h

2.2 FA-2-b-β 對 K562/ADR 中耐藥和凋亡相關基因mRNA表達水平的影響

RT-qPCR結果顯示，經FA-2-b-β干預，K562/ADR細胞 Bax、TP53 mRNA表達上調，K562/ADR細胞 MDR1 及p65 mRNA 表達下調，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干預CML細胞48 h后相關基因mRNA表達水平的影響Figure 3 Effect of FA-2-b-β on mRNA expression levels after 48h in CML cells

2.3 FA-2-b-β 對FA-2-b-β 細胞耐藥、凋亡及FA-2-b-β通路相關蛋白表達水平的影響

不同濃度FA-2b-β 處理K562/ADR 細胞48 h后，Western-blot結果顯示，3 mg/mL組中P-gp、P65蛋白表達降低（圖4-A），P53、Bax、IKB-α 蛋白表達升高（圖4-B），與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。免疫熒光結果顯示，各組細胞膜上P-gp蛋白熒光強度隨藥物濃度增加逐漸減弱（圖5）。這與印跡結果大致一致。

圖4 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β作用于CML細胞48 h后相關蛋白表達水平的影響Figure 4 Effect of FA-2-b-β on the expression level of the associated protein after 48h in CML cells

圖5 免疫熒光染色觀察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干預K562/ADR細胞48 h后耐藥蛋白P-gp表達水平Figure 5 Immunofluorescence staining to observe FA-2-b-β intervention in K562/ADR cells after 48 h of drugresistant proteins P-gp expression level

圖6 胞內熒光染色觀察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β干預K562/ADR細胞48 h后胞內藥物的蓄積量Figure 6 Intracellular fluorescence staining to observe the accumulation of intracellular drugs after 48 h of FA-2-b-β intervention in K562/ADR cells.

2.4 秦巴硒菇FA-2-b-β 對 K562/ADR 細胞內藥物蓄積量的影響

FA-2-b-β（1、2、3 mg/mL）干預各組細胞48 h后結果顯示，與對照組相比（0 mg/mL），K562/ADR細胞內阿霉素蓄積量隨濃度增加而增加（P＜0.001）。

2.5 秦巴硒菇FA-2-b-β 對K562、K562/ADR 細胞凋亡的影響

細胞凋亡結果顯示，與對照組比較，隨著FA-2-b-β 濃度的增加，K562 細胞凋亡率依次為9.62%，36.68%，63.93%；K562/ADR凋亡率依次為21.7%，54.44%，64.37%。DAPI 染色顯示，處理后K562/ADR 組細胞核區熒光強度逐漸升高，細胞凋亡增多（圖7）。

圖7 流式細胞術觀察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β對CML細胞作用48 h后凋亡的影響Figure 7 Flow cytometry to observe the effect of FA-2-b-β on apoptosis of CML cells after 48 h

圖8 DAPI染色觀察秦巴硒菇提取物FA-2-b-β對K562/ADR細胞作用48 h后凋亡的影響Figure 8 DAPI staining observed the effect of FA-2-b-β on apoptosis of K562/ADR cells after 48 h

2.6 秦巴硒菇FA-2-b-β 對K562、K562/ADR 細胞周期的影響

K562、K562/ADR 細胞與不同濃度（1、2、3 mg/mL）FA-2-b-β共同孵育48 h，結果顯示，與對照組相比，K562 細胞G0/G1百分比增加，依次為26.03%，43.77%，54.49%；K562/ADR 細胞G2/M百分比增加，依次為21.7%，30.64%，35.1%，37.75%（圖9）。

圖9 秦巴硒菇提取物FA-2-b-β對CML細胞作用48 h后周期調控的影響Figure 9 Effect of FA-2-b-β on cell cycle regulation after 48 h of CML

3 討論

化療耐藥是白血病治療失敗的主要原因之一。隨著化療藥物和方案不斷更新完善，白血病的治療手段也有了更多選擇。與此同時，腫瘤細胞所產生多藥耐藥問題也凸顯出來。目前，調節耐藥相關蛋白P-gp 表達及功能，是減少胞內化療藥物外排，提高化療敏感性，是逆轉腫瘤復發耐藥的一個重要方向。例如，使用PI3K/mTOR 通路抑制劑Voxtalisib后，HL60/ADR和K562/A02中P-gp和MRP1基因的表達下調，并對阿霉素表現出一定的敏感性［20］。LncRNA FENDRR 還 能 夠 通 過 miR-184/FENDRR/HuR/MDR1 信號通路來降低慢性粒細胞白血病中MDR1 蛋白的表達，以達到降低細胞對阿霉素耐藥性的目的［21］。本研究通過對耐藥株K562/ADR 使用秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 干預，證實了FA-2-b-β 具有減少耐藥蛋白P-gp 表達、增加胞內藥物蓄積、阻滯細胞周期，并促進細胞凋亡的作用。同時也觀察到，經典的NF-KB信號通路中關鍵蛋白表達也在藥物干預后出現了變化。

經典NF-κB 信號通路中，RELA（p65）及NFKB1（p50）通過與IκB 的相互作用使其保持在非活性狀態［22］。大量刺激物驅動（如炎癥細胞因子、細菌脂多糖、病毒RNA，甚至神經遞質等［23］）后，導致IκB中的IKK依賴性磷酸化和蛋白酶體降解，二聚體p65/p50解除抑制并分離，并由此激活和參與了體內多種基因表達和蛋白的調節。其中包括對多藥耐藥蛋白1（MDR1/P-gp） 的表達水平的調節。研究表明，在抑制PI3K/AKT/NF-κB 通路后，人乳腺癌細胞MCF-7/ADR 中P-糖蛋白（P-gp）的表達也隨之降低，MCF-7/ADR 對阿霉素表現出較低的耐藥性［24］。本研究發現，高濃度的FA-2b-β能夠上調通路中抑制性蛋白IκB-α的表達，同時減少二聚體蛋白p65 的表達，對NF-κB 信號通路活性表現出了明顯的抑制作用。這與結果中耐藥蛋白MDR1的表達降低相一致?？梢?，提取物FA能夠通過抑制經典NFκB信號通路，降低K562/ADR細胞中P-糖蛋白的表達，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

腫瘤抑制因子p53 參與DNA 修復、代謝、細胞周期停滯、細胞凋亡和衰老的眾多基因的轉錄［25］。一方面能誘導轉化細胞的凋亡［26］，并在轉錄層面上上調凋亡相關蛋白（如Puma、Noxa、Bid 和Bax）表達，另一方面還可與Bcl-2 和Bcl-xL 的抗凋亡活性相互作用，共同調節細胞的凋亡過程［27］。p53的雙重作用使得其發生的突變（主要是錯義突變），能夠抑制細胞凋亡，并導致治療耐藥性［28］。與p53突變相關的耐藥包括順鉑，抗代謝物（吉西他濱），蒽環類藥物（多柔比星），烷化劑（替莫唑胺）和具有特定靶標的藥物，如EGFR抑制劑（西妥昔單抗）和抗雌激素（他莫昔芬）?？梢?，對于p53蛋白活性調節與腫瘤細胞耐藥以及凋亡密切相關。本試驗結果提示，經FA-2b-β 處理后，K562/ADR 細胞內p53 基因及蛋白產物的表達逐漸升高，同時促凋亡蛋白BAX表達也出現上升趨勢。不難看出，FA-2b-β對K562/ADR 細胞所表現出的誘導凋亡作用，是通過調節p53蛋白及凋亡蛋白BAX 來實現的。BAX/Bcl-2 作為重要的凋亡相關蛋白，已被證實參與了多種腫瘤耐藥的形成。據報道［29］，Bcl-2相關轉錄因子1 （BCLAF1）的過度表達是非小細胞肺癌A549/DDP細胞產生耐藥性重要機制之一。而促凋亡蛋白Bax的表達下降也與腫瘤細胞多藥耐藥性的產生相關聯［30］。上文已述，FA-2-b-β 能夠上調Bax 表達，同時又表現出對NF-κB信號通路的抑制作用。這兩種效應之間的關聯，可能與Bax/BCl-2 結合該通路中抑制性蛋白IκB-α 并且促進其降解，從而增強NF-κB 通路的活性有關［31］，類似的，在其他白血病耐藥相關研究中也發現了這一現象［32］。另外，流式細胞術也反映了FA-2-b-β 對K562 及K562/ADR 細胞的凋亡作用，并能夠分別將2種細胞阻滯于G0/G1期和G2/M。此結果與本課題組前期研究相類似［33］。針對敏感株與耐藥株所產生的不同阻滯效應，這可能和藥物作用時所涉及到多個信號通路激活有關。在姜黃素誘導宮頸癌細胞凋亡的研究中，存在Wnt/β-catenin 和NF-κB 信號通路被藥物共同抑制的現象，并將腫瘤細胞阻滯于G2/M 期［34］。本課題前期已證明，FA-2-b-β對K562細胞周期的阻滯及誘導凋亡作用均有wnt/β-catenin通路的參與［33］，在本研究中FA-2-b-β同樣表現出了對經典的NF-κB 信號通路的顯著抑制性，并能夠誘導細胞發生凋亡和周期阻滯。由此，我們可以推論，FA-2-b-β在體內發揮逆轉耐藥及誘導腫瘤細胞凋亡的過程是多通路，多蛋白，多靶點共同參與完成的，對于該過程中所涉及到的具體信號通路及其明確的作用方式，有待后續更為深入研究來闡明。

4 結論

綜上，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β 一方面抑制K562/ADR細胞中NF-κB信號通路活性，減少耐藥基因及相關蛋白表達，并抑制轉運蛋白功能。另一方面，FA-2-b-β上調促凋亡基因Bax和p53及相關蛋白，對K562/ADR 細胞生長發揮抑制和促凋亡作用。但對于更為具體作用機制和作用方式的探究，需結合后續體內試驗做進一步論證?？傊?，秦巴硒菇提取物FA-2-b-β具有多靶點，多機制逆轉K562/ADR細胞耐藥性的潛在效力。