NaN3 誘變草莓突變體的表型篩選與SRAP 分子鑒定

彭安妹，徐夢琴，毛敏，何克勤，胡能兵，蘭偉，崔廣榮

（安徽科技學院農學院，安徽 鳳陽 233100）

紅花草莓開紅花、結紅果，具有三小葉，色彩鮮明［1］，其植株可用于盆栽觀賞和園林綠化［2］。我國對紅花草莓進行育種的時間不長、育成品種不多、果實品質欠佳、花色單一（主要為粉色）［3-4］，紅花草莓育種一直停留在傳統的雜交育種階段［5-7］，這使得紅花草莓的應用得到了限制。而化學誘變育種技術憑借其操作簡易，特異性較強并且誘變后代遺傳比較穩定的特點，已經在許多作物上得到了廣泛運用［8］?；瘜W誘變劑疊氮化鈉（NaN3）可透過細胞膜進入細胞內，通過堿基替換方式使DNA的正常合成受到影響，引起點突變的產生［9］。崔廣榮等［10］采用NaN3對文心蘭原球莖進行誘變處理，成功獲得了突變體植株；王霞等［11］采用NaN3對鳳尾雞冠花葉片進行處理，成功篩選出耐鹽突變體；何克勤等［12］采用NaN3對甜葉菊試管苗進行誘變處理，得到突變體植株。有關紅花草莓的NaN3離體化學誘變研究尚未見報道。

形態學標記因其具有簡易、快速，不需要高昂儀器設備等特點［13］，在育種鑒定中常見報道［10-17］，但是形態學鑒定容易受到環境因素和人為因素的影響，只能作為初步鑒定。而分子標記技術不易受到環境等因素的影響，可以從遺傳物質DNA水平來研究植物基因的變化，具有操作更簡單，結果更精確的特點［18］。SRAP分子標記是一種基于PCR的新型分子標記［19］，其具有操作簡單、易重復性和高共顯性等優點。本研究采用NaN3誘變紅花草莓植株，在形態學初篩的基礎上，進一步采用SRAP 分子標記技術進行多態性檢測，通過聚類分析鑒定了紅花草莓與其23 株突變單株的遺傳背景和親緣關系，以期篩出突變體，為紅花草莓新品種培育提供參考和奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

由安徽科技學院分子育種實驗室提供的純系紅花草莓品種。

1.2 試劑

SRAP 引物的合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；10×DNA buffer 、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、Marker等均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 誘變材料獲取 2021 年8 月在預備試驗基礎上，用1 mmol/L NaN3對草莓試管苗誘變處理1 d后移入增殖培養基中培養28 d，繼代兩次后轉入生根培養基中，25 d后轉入穴盤煉苗，30 d后移栽至安徽科技學院溫室大棚中，共得到M1代誘變單株500 株。

1.3.2 表型性狀調查 2022 年春對500 株誘變單株進行田間表型鑒定，觀察記錄株高、冠幅、莖粗、葉面積、葉型、葉色、花色、花型、果形。 突變體篩選標準采用Wei等［20］的方法，入選標準為：入選株性狀＞對照平均值±3倍標準差。

1.3.3 SRAP 分子鑒定 2022 年4 月采用CTAB法對發生表型突變的草莓植株幼嫩葉片進行DNA提取，參考胡能兵［21］的方法。采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA 進行質量檢測。挑選主條帶清楚并且干擾條帶少的8 對引物（表1）來檢測表型性狀突變體的多態性。采用胡能兵等［22］的SRAP反應體系進行擴增。采用 Sanguinetti等［23］的銀染方法進行染色。

表1 選用SRAP引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of SRAP primers selected

1.4 數據統計與分析

通過EXCEL 2007 軟件進行數據轉換，分別計算紅花草莓表型突變植株的株高、冠幅、莖粗、葉面積的均值（X） 和標準差（SD）。采用 NTsys 2.10軟件進行統計和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 表型突變植株篩選

由表2可得，表型突變主要為株型、莖葉、花和果實4 種突變類型，在整個生育期共發現23 份表型突變株，突變率為4.6%，其中部分突變株存在多類型突變。

表2 紅花草莓突變類型的表型統計Table 2 Phenotypic statistics of mutant types in pink flowered strawberry

2.1.1 株型突變 由表2 和圖1 可知，株型突變主要包括株型緊湊、株高變矮2 種類型。共有4 份，突變率為0.8%。其中，株型緊湊的有2 株，突變率為0.4%。與對照冠幅（25～46.5 cm）相比，主要表現為冠幅變?。ü诜鶞p少13.54～21.29 cm）。植株矮化的有2 株，突變率為0.4%，與對照株高（20～35 cm）相比，主要表現為莖長度縮短（株高減少13.54～15.54 cm）。

圖1 草莓部分誘變植株株型突變田間表型Figure 1 Field phenotype of stem mutation in some mutagenic strawberry plants

2.1.2 莖葉突變 由表2 和圖2 可知，莖葉突變主要包括莖纖細、小葉、葉片皺縮卷曲和花葉4種類型。共有8份，突變率為1.6%。其中，莖纖細的突變株有1株，突變率為0.2%，與對照莖粗（1.99～3.01 cm）相比，表現為莖變細（減少1.08 cm）。葉面積變小的有4株，突變率為0.8%。葉片皺縮卷曲的植株有2株，突變率為0.4%?；ㄈ~突變體1 株，突變率為0.2%，表現為葉片顏色黃綠相間。

圖2 草莓部分誘變植莖葉突變田間表型Figure 2 Field phenotypes of leaf mutations in some mutagenic plants of strawberry

2.1.3 花突變 由表2 和圖3 可得，花突變主要包括白色花、三色花、花瓣短縮花和球型花4種類型（圖3），共有8份，突變率為1.6%。其中，白色花4份，突變率為0.8%。三色花1 份，突變率為0.2%，表現為一朵花上同時出現深粉色、粉色、白色3種顏色的花瓣?；ò甓炭s花2份，突變率為0.4%，表現為一朵花上的2 個花瓣短縮，發育不良。球型花突變體1 份，突變率為0.2%，表現為花型由平面展開型變為圓球型，并且花蕊由圓形變為長橢圓形。

圖3 草莓部分誘變植株花突變田間表型Figure 3 Field phenotype of flower mutation in some mutagenic plants of strawberry

2.1.4 果實突變 由表2 和圖4 可知，果實突變為果形突變。共有3份，突變率為0.6%。其中，長圓錐形果1份，突變率為0.2%，表現為果實變細長，由圓錐形變為長圓錐形。球型果1份，突變率為0.2%，表現為果形變圓變小。矩形果1份，突變率為0.2%，表現為果實膨大，形狀接近矩形。

圖4 草莓部分誘變植株果實突變田間表型Figure 4 Field phenotype of fruit mutation in some mutagenic plants of strawberry

2.2 SRAP分子鑒定

2.2.1 SRAP 標記的擴增多態性分析 利用SRAP分子標記對23株草莓表型突變植株進行遺傳多態性進行分析（圖5）。8對SRAP引物擴增出的片段大小主要在100～1 000 bp，每1 對引物擴增出的總條帶數在4～15條不等。8對SRAP引物擴增出的總條帶數為72，多態性條帶數為47，多態性比例為65%，其中引物A18Z14擴增出的多態性條帶是最多的，擴增出10 條多態性條帶（圖5）。與CK 相比，部分表型突變植株的條帶出現了3種變化，具體表現為條帶新增，條帶缺失，條帶既新增又缺失。

圖5 部分引物的草莓突變體SRAP擴增圖譜Figure 5 SRAP amplification map of pink flowered strawberry mutant with partial primers

2.2.2 突變植株與對照的遺傳差異性比較 由圖6可以看出，與對照相比，除了突變植株N-15沒有出現遺傳上的變異以外（雖然株高矮化明顯），其他22株突變植株都出現了遺傳上的變異。其中與對照在遺傳距離上相差最遠的是N-5、N-8 和N-9，產生的變異最大，它們分別通過8對引物擴增出12、13和15態性條帶，說明通過NaN3處理引起了這些突變植株較多基因位點上的突變，與對照植株相比，這3株突變植株在形態上表現為花型與花色的變異，其中N-5表現為花型由平面展開型變為圓球型，并且花蕊由圓形變為長橢圓形。N-8和N-9花色均由粉色變為白色。

圖6 突變植株和對照的聚類樹狀圖Figure 6 Cluster dendrogram of variants plants and CK plants

3 討論

目前在草莓育種上化學誘變主要是用EMS 進行誘變，張經緯等［24］用EMS 來處理豐香草莓的種子，突變率為1%。田前進等［25］用EMS 對草莓組培苗和葉片外植體進行處理，突變率為4.38%。本研究采用NaN3對紅花草莓不定芽進行誘變處理，突變率為4.6%，與田前進和張經緯的結果不完全一致，本研究中出現的花色和花型突變性狀，在田前進和張經緯的研究中未出現。在這23株表型突變株中，部分突變體同時產生2種或3種復合性狀變異，如花葉突變體同時產生了白色花性狀，葉片皺縮卷曲突變體同時產生了白色花性狀，莖纖細突變體同時產生株高變矮和小葉性狀。這表明不同性狀的變異發生在同一單株上是可能的。孫加焱等［26］用60CoY 射線和EMS處理甘藍型油菜，復合變異性狀比例占總突變群體的36.60%。

本研究出現的大部分突變體為無益突變體，有益突變體如白色花、三色花和球型花突變體的突變率分別為0.8%、0.2%和0.2%。其中三色花和球型花突變體在以往紅花草莓育種中從未見報道過，極具觀賞價值。這些有益突變體可以作為育種材料使用。

SRAP分子標記在很多植物鑒定工作中得到廣泛應用［27-28］。本研究中SRAP 標記結果表明，紅花草莓M1代表型突變植株在 DNA 水平發生了基因突變，其中23 株突變株中有22個單株在 DNA水平發生了基因突變，而沒有發生DNA水平變化的1株為株高變矮突變株，其表型變化可能是由于植株營養不良或者環境影響造成的，本試驗結果獲得22株表型突變株既在表型上發生變化又在分子水平發生變化。但存在的問題是，這些表型上的變異能否遺傳給后代，是否為基因水平上可遺傳的變異，這需要進一步對M2代植株進行觀察。