JWH133對右旋糖酐鐵過載小鼠脾臟鐵代謝影響

劉曼 鄧晗 馬澤剛

［摘要］ 目的 探討激活大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）對右旋糖酐鐵處理的鐵過載模型小鼠脾臟鐵代謝的影響。

方法 將18只9周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、右旋糖酐鐵組、JWH133（CB2受體激動劑）+右旋糖酐鐵組。應用鐵檢測試劑盒（比色法）檢測各組小鼠脾臟鐵水平，采用Western blot法檢測脾臟轉鐵蛋白受體1（TFR1）和鐵轉運蛋白1（FPN1）的表達。

結果 與對照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟總鐵含量和Fe3+含量明顯升高（F=12.710、8.352，q=6.980、5.698，P＜0.01），Fe2+含量有增高趨勢，但差異無統計學意義；JWH133預處理抑制右旋糖酐鐵造成的總鐵含量和Fe3+含量的升高（q=4.747、3.687，P＜0.05）。與對照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟TFR1表達顯著升高（F=12.090，q=6.859，P＜0.01）；JWH133預處理抑制右旋糖酐鐵引起的TFR1蛋白表達上調（q=4.419，P＜0.05）。3組小鼠脾臟FPN1表達比較差異無顯著性（F=1.152，P＞0.05）。

結論 激活CB2受體可以抑制右旋糖酐鐵引起的小鼠脾臟鐵水平增高以及TFR1蛋白表達上調，CB2受體可能通過調節TFR1蛋白表達介導小鼠脾臟鐵的聚集。

［關鍵詞］ 受體，大麻酚，CB2；鐵右旋糖酐復合物；脾；受體，轉鐵蛋白；小鼠

［中圖分類號］ R338.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0199－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.033

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

大麻素的生物學效應主要由G蛋白偶聯受體家族的兩個成員大麻素Ⅰ型受體（CB1受體）和大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）介導。CB1受體在中樞神經系統中高度表達，參與各種腦功能的調節，包括執行力和記憶處理等，被稱為“中樞型”大麻素受體。而CB2受體則被認為是“外周型”大麻素受體，主要分布在外周組織中，如脾臟邊緣區、扁桃體、胸腺等。近年來的研究表明，CB2受體在中樞神經系統也廣泛表達，并參與多巴胺相關的行為調節，包括抑郁癥、焦慮和精神分裂癥等。有研究表明，內源性大麻素系統參與了機體鐵代謝相關疾病的發生。在HEK293T細胞中，CB2受體通過抑制二價金屬離子轉運體磷酸化來介導鐵轉運。本課題組的前期研究也證實，JWH133（CB2受體激動劑）激活CB2受體能夠抑制1－甲基－4－苯基吡啶離子（MPP+）誘導的星形膠質細胞鐵攝取。但大麻素系統對全身鐵代謝的影響尚未見報道。本實驗應用右旋糖酐鐵建立鐵過載小鼠模型，用JWH133進行預處理，觀察小鼠脾臟鐵水平以及鐵代謝相關蛋白轉鐵蛋白受體1（TFR1）、鐵轉運蛋白1（FPN1）的表達，探討JWH133激活CB2受體是否影響小鼠脾臟鐵的聚集及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級9周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物公司。飼養條件：溫度（21±1）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜循環光照，自由飲水進食。實驗前適應實驗室環境1周。

1.1.2 主要試劑 右旋糖酐鐵購自美國Sigma－Aldrich公司；CB2受體激動劑JWH133購自美國APE×BIO公司；鐵檢測試劑盒購自英國Abcam公司；TFR1抗體購自中國正能生物公司；FPN1抗體購自以色列Alomone Labs公司；β－actin抗體購自美國Proteintech公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自中國愛必信公司；ECL化學發光液購于中國雅酶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 將18只小鼠隨機分為對照組（A組）、右旋糖酐鐵組（B組）和JWH133＋右旋糖酐鐵組（C組），每組6只。右旋糖酐鐵組小鼠每天給予右旋糖酐鐵100 mg/kg腹腔注射，構建鐵過載小鼠模型；JWH133+右旋糖酐鐵組小鼠每天先腹腔注射1 mg/kg的JWH133，4 h后再腹腔注射100 mg/kg的右旋糖酐鐵；對照組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。持續腹腔注射15 d后處死小鼠，取脾臟進行后續實驗。

1.2.2 脾臟鐵含量檢測 使用鐵檢測試劑盒（比色法）測定小鼠脾臟鐵含量。首先將脾臟用預冷的PBS洗滌，在鐵檢測緩沖液中勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中，將收集的上清液和鐵還原劑混勻后加入96孔板中，37 ℃孵育30 min。最后，每孔分別加入鐵探針，37 ℃孵育1 h，在比色酶標儀上測定吸光度（波長為593 nm）。

1.2.3 Western blot法檢測脾臟TFR1和FPN1的表達 脾臟組織按每4 mg 100 μL加入裂解液，充分研磨后冰上裂解30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，提取上清。用 BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。按1∶4比例加入Loading buffer，金屬浴100 ℃煮5 min。蛋白經SDS－PAGE電泳（電壓80～120 V）后濕轉至PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h后，將PVDF膜分別放入TFR1（1∶1 000）、FPN1（1∶1 000） 和β－actin（1∶10 000）一抗溶液中，4 ℃搖床過夜孵育。加HRP偶聯的二抗（用TBST稀釋至1∶10 000），室溫孵育1 h。用UVP Bio Doc－It成像系統（美國Upland）和ECL高靈敏化學發光液顯影，采用Image J分析軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學處理

應用Prism 7軟件進行統計學處理，實驗所得數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA檢驗），組間兩兩比較采用Turkey法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JWH133對右旋糖酐鐵處理小鼠脾臟鐵水平的影響

與對照組相比，右旋糖酐鐵組總鐵含量明顯升高，Fe3+含量升高也較為明顯，差異均有統計學意義（F=12.710、8.352，q=6.980、5.698，P＜0.01）；Fe2+含量有增高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與右旋糖酐鐵組相比，JWH133＋右旋糖酐鐵組總鐵含量和Fe3+含量明顯降低，差異有統計學意義（q=4.747、3.687，P＜0.05）。見表1。

2.2 JWH133對右旋糖酐鐵處理小鼠脾臟TFR1和FPN1蛋白表達的影響

與對照組相比，右旋糖酐鐵組小鼠脾臟TFR1蛋白的表達顯著升高（F=12.090，q=6.859，P＜0.01）；與右旋糖酐鐵組相比，JWH133＋右旋糖酐鐵組TFR1蛋白的表達顯著降低（q=4.419，P＜0.05）。3組小鼠脾臟FPN1蛋白表達比較差異無顯著性（F=1.152，P＞0.05）。見表1。

3 討論

內源性大麻素系統主要由內源性大麻素、大麻素受體以及負責生成、轉運和水解大麻素的各種調節因子組成。大麻素受體與G蛋白偶聯，通過抑制腺苷酸環化酶和電壓門控鈣通道（例如N型、P/Q型和L型鈣電流）介導信號轉導，激活絲裂原活化蛋白激酶和向內整流鉀離子通道。目前臨床上應用的大麻素受體激動劑如大麻醇、屈大麻酚、Δ9－四氫大麻酚和大麻二酚均為CB1受體/CB2受體的非選擇性激動劑。已有研究表明，這些非選擇性激動劑引起的不良反應大多來自CB1受體而不是CB2受體，因此CB2受體選擇性激動劑在臨床應用上會有許多優勢。CB2受體作為7次跨膜的G蛋白偶聯受體，主要存在于外周免疫器官和免疫組織中，如脾臟邊緣區。激活CB2受體在心血管、胃腸道、肝臟、腎臟、肺相關疾病中發揮組織保護作用。此外，CB2受體在神經退行性疾病的動物模型中發揮抗炎和保護作用。CB2受體激活還可以抑制小膠質細胞的活化并改善神經退行性疾病中的神經功能缺陷和延緩疾病的進展。在1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導損傷的模型小鼠中使用CB2受體激動劑AM1241，可以減輕MPTP對多巴胺能神經元的損傷作用。

鐵作為人體內必需的微量元素之一，參與氧輸送、線粒體呼吸以及DNA的合成，是神經遞質及髓鞘蛋白合成重要酶的輔基，對能量代謝、氧化還原平衡、氧氣運輸以及炎癥反應等基本生物學過程都具有重要的作用。生物體內存在許多生理過程來確保鐵穩態。有研究報道，大麻素可以通過激活CB2受體抑制HEK293T細胞對鐵的攝入，激活CB2受體也能夠抑制MPP+誘導的星形膠質細胞鐵攝取。本室前期研究表明，JWH133可以通過激活CB2受體來抑制MPP+誘導的SH－SY5Y細胞內的鐵水平升高。鐵穩態對維持人類機體正常代謝起著不可或缺的作用。本研究使用鐵染色試劑盒采用比色法檢測小鼠脾臟鐵含量，結果表明，右旋糖酐鐵引起脾臟總鐵含量和Fe3+含量明顯升高，使用JWH133預處理可明顯抑制右旋糖酐鐵引起的脾臟總鐵含量和Fe3+含量升高，提示JWH133激活脾臟CB2受體可以減少右旋糖酐鐵引起的脾臟鐵聚集。攝入鐵的膜蛋白TFR1是鐵代謝所必需的，它可以將Fe3+轉運至細胞核內體中，在核內體中Fe3+進一步被還原成為Fe2+。最終，在二價金屬離子轉運體的介導下，Fe2+從核內體釋放到胞質內不穩定鐵池中。一部分鐵可以通過FPN1輸出細胞，而多余的鐵則以鐵蛋白輕鏈和鐵蛋白重鏈1的形式儲存在細胞胞質中。這些鐵代謝相關蛋白的異常表達或功能失調將會使細胞內鐵離子濃度因代謝失衡而升高。本研究Western blot檢測結果顯示，使用CB2受體激動劑JWH133預處理激活CB2受體能夠抑制右旋糖酐鐵誘導的脾臟TFR1蛋白表達上調，提示TFR1參與脾臟的鐵沉積過程，但激活CB2受體調控脾臟TFR1蛋白表達的機制仍不清楚，需要進一步研究。

綜上所述，本研究用小鼠鐵過載模型初步探討了CB2受體在脾臟鐵代謝中的作用，結果提示，激活CB2受體參與了右旋糖酐鐵引起的小鼠脾臟鐵過載，其可能的機制是通過抑制鐵代謝相關蛋白TFR1的表達來減少鐵的攝入。本文研究結果為治療鐵代謝相關疾病提供了新的方向，但還需要進一步研究其所涉及的機制。

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（本文編輯 馬偉平）