卵巢子宮內膜異位癥惡變AXIN和β-catenin表達及意義

宋冰冰 趙飛 王黎明

［摘要］ 目的 探討軸蛋白（AXIN）與β－連環蛋白（β－catenin）在卵巢子宮內膜異位癥（OE）惡變過程中的表達及臨床意義。

方法 采用定量酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及免疫組化方法，檢測30例OE組織、17例非典型子宮內膜異位癥（aEM）組織及30例子宮內膜異位癥相關性卵巢癌（EAOC）組織中AXIN與β－catenin的表達情況，并分析β－catenin及AXIN與EAOC病人的年齡、FIGO分期、病理組織類型、腫瘤側別等臨床特征的關系。

結果 免疫組化檢測顯示，AXIN在OE組、aEM組、EAOC組的陽性表達率分別為76.7%（23/30）、41.2%（7/17）、30.0%（9/30），差異有統計學意義（χ2=13.852，P<0.05）；β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組的陽性表達率分別為13.3%（4/30）、29.4%（5/17）、63.3%（19/30），差異有統計學意義（χ2=16.661，P<0.05）。ELISA檢測顯示，AXIN在OE組、aEM組、EAOC組的表達水平逐漸降低，差異有統計學意義（F=1 986.939，P<0.001）；β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組的表達水平逐漸升高，差異有統計學意義（F=7 361.889，P<0.001）。EAOC病變組織中AXIN與β－catenin的表達呈負相關（r=－0.86，P<0.05）；AXIN及β－catenin的表達與腫瘤FIGO分期、組織學分級有顯著相關性（P=0.000～0.013）。

結論 AXIN低表達與β－catenin高表達可能參與了OE的惡變過程，且可能促進了EAOC的浸潤轉移。

［關鍵詞］ β－連環蛋白；軸蛋白質；卵巢疾??；子宮內膜異位癥；卵巢腫瘤

［中圖分類號］ R588.6;R737.31

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0282－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.044

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

科惡性腫瘤死亡率的首位，嚴重威脅著全球女性的健康。因此，探索卵巢癌可能的發病機制并探求其有效的臨床治療方法尤為重要。目前，卵巢子宮內膜異位癥（OE）發生惡變的機制尚不明確，可能與某些信號轉導通路因子的異常表達有關。軸蛋白（AXIN）與β－連環蛋白（β－catenin）分別為Wnt經典信號轉導通路中重要的抑癌因子與致癌因子，二者在胃癌、肺癌、肝癌等多種人體癌癥的發生、發展及轉歸中起重要作用，但二者在OE惡變過程中的作用尚不清楚。本研究檢測AXIN、β－catenin在OE、卵巢非典型子宮內膜異位癥（aEM）和子宮內膜異位癥（EM）相關性卵巢癌（EAOC）組織的表達情況，旨在探討二者在OE惡變過程中發揮的作用。

1 材料和方法

1.1 標本及其來源

收集2014年4月1日—2017年4月1日青島大學附屬醫院診治的EAOC病人的術后標本共30例，其中22例為卵巢子宮內膜樣腺癌、8例為卵巢透明細胞癌，病人年齡為30～68歲，平均（50.53±7.78）歲；aEM病人術后組織17例，病人年齡30～54歲，平均（47.06±6.52）歲；OE病人術后組織30例，病人年齡為30～62歲，平均（48.03±7.29）歲。所有病人術前均未接受化療、激素類藥物治療、放療、中醫治療，所有組織標本均經病理檢查確診。新鮮標本獲取后，一部分立刻應用40 g/L甲醛固定24 h，濃度梯度乙醇脫水后行完整石蠟包埋，連續切片（厚度為4 μm）；另一部分組織用已預冷的1×PBS溶液充分沖洗，去除其中殘留血液，稱質量后剪碎，放入燒杯中，加入含蛋白酶抑制劑的PBS溶液（體積比1∶9），充分混勻，在冰上充分研磨，應用超聲波細胞破碎儀進一步處理。將得到的勻漿以7 254 r/mim離心10 min后，用無菌EP管分裝，放置－80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人AXIN多克隆抗體、兔抗人β－catenin多克隆抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司，根據使用說明配制試劑，抗體稀釋度為1∶100；DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液等均購于北京中杉金橋生物有限公司；人AXIN酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定試劑盒、人β－catenin ELISA測定試劑盒均購于上海茁彩生物科技有限公司；離心機（北京白洋器械有限公司）；多功能酶標儀（美國 BIO－RAD公司產品）；包埋機（德國 Leica EG1150H）；電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，FA1004）等。

1.3 AXIN、β－catenin蛋白表達檢測

采用免疫組化方法檢測AXIN和β－catenin蛋白的表達，按照常規實驗流程進行操作，抗體嚴格按照試劑盒說明書進行稀釋。陰性對照采用PBS替代一抗，陽性對照采用已知食管癌陽性標本。采用ELISA方法檢測樣本組織中AXIN、β－catenin的濃度，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，用酶標儀檢測標本光密度（OD）值，按照所配置的標準品濃度以及所測得的標準品OD值繪制標準曲線，計算AXIN、β－catenin的濃度。

1.4 免疫組化結果判讀標準

AXIN蛋白陽性主要定位在細胞核和（或）細胞膜，陽性表達為出現褐黃色染色顆粒；β－catenin蛋白陽性主要定位在細胞漿和（或）細胞核，陽性表達為出現褐黃色染色。按照SHIMIZU等的方法，綜合所選視野中陽性細胞百分比以及陽性細胞染色強度確定樣本蛋白的表達水平。①染色強度評分：無（或不清楚）染色為0分，染色淡黃褐色為1分，染色棕黃色為2分，染色深褐色為3分。②陽性細胞百分比評分：陽性細胞數<10%為0分，陽性細胞數10%～25%為1分，陽性細胞數26%～50%為2分，陽性細胞數＞50%為3分。根據染色強度與陽性細胞百分比得分乘積判定結果：0～1分為陰性（－），≥2分為陽性（+）。所有樣本的染色結果均由兩名經驗豐富的病理科主任醫師采用雙盲法進行診斷。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，計量資料先用Shapiro－Wilk檢驗進行正態性分布分析，符合正態分布計量資料用±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，α（α/3）<0.016 7表示差異有統計學意義。多組計數資料比較采用R×C表卡方檢驗，兩個獨立樣本比較采用Pearson卡方、連續性校正卡方或Fisher檢驗。相關性分析采用Pearson相關或Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 不同組織中AXIN、β－catenin表達比較

免疫組化檢測結果顯示，AXIN表達于細胞核和（或）細胞膜，且所有檢測樣本組織中均有不同程度的表達（圖1），AXIN在OE組、aEM組、EAOC組中的陽性表達率逐漸下降，除aEM組與EAOC組比較差異無統計學意義外，余各組間差異均有統計學意義（χ2=13.852，P<0.05）；β－catenin表達于細胞核和（或）細胞漿，且在所有檢測樣本組織中均有不同程度的表達（圖2），β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組中的陽性表達率呈逐漸升高的趨勢，除aEM組與OE組比較差異無統計學意義外，其余各組間比較差異均有顯著意義（χ2=16.661，P<0.05）。見表1。

2.2 各組AXIN、β－catenin濃度比較

各組AXIN、β－catenin濃度差異有顯著性（F=1 986.939、7 361.889，P<0.01），OE組、aEM組、EAOC組AXIN的濃度逐漸降低，各組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.016 7）； OE組、aEM組、EAOC組中β－catenin濃度依次升高，各組間兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.016 7）。見表2。

2.3 AXIN、β－catenin表達與EAOC臨床病理特征的關系

EAOC組織中AXIN、β－catenin的表達與病人年齡、腫瘤側別及組織學類型無明顯相關性（P>0.05），但與臨床FIGO分期和組織學分級有顯著相關性（P=0.000～0.013）。見表3。

2.4 EAOC組織AXIN與β－catenin表達的相關性

EAOC組織AXIN與β－catenin表達呈負相關（r=－0.86，P<0.05）。見表4。

3 討論

EM為臨床最常見的婦科良性疾病之一，育齡期女性中其發病率可達10%～15%，全世界范圍內約有1.76億婦女受到影響，其臨床特點包括不孕、盆腔疼痛、多次手術以及對病人社會心理健康和生活質量產生嚴重的負面效應。EAOC病人的發病年齡較低，臨床分期較早，預后好，早發現、早治療尤為重要。

EM惡變率為0.7%～1.0%，其中80%發生于卵巢，為卵巢癌已知的高危因素之一。

早在1952年就有研究論述了EM與卵巢癌之間的關系，提出并制定了EAOC的診斷標準；隨后，有研究于1953年對其診斷標準給予了進一步補充，并一直沿用至今。OE的存在使卵巢癌發生的風險增加了4倍。目前，部分國外學者認為，組織病理學上的“aEM”是EM惡變的中間過渡階段，也是EM惡變的關鍵性證據之一。本研究通過對OE惡變過程中Wnt信號通路中相關生物因子變化的分析，為OE惡變的早期診治提供依據。

Wnt家族是一個與諸多細胞功能相關的蛋白家族，參與調控器官形成、干細胞自我更新、細胞增殖和凋亡等生物過程。目前研究表明，Wnt信號轉導通路在人類機體發育過程中起重要作用，可促進細胞的增殖、分化以及黏附等過程，Wnt/β－catenin經典信號通路具有促進卵巢上皮癌發展的作用。該途徑也可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，誘導腫瘤細胞抵抗治療藥物，并可能參與腫瘤組織的血管生成和免疫抑制。Wnt/β－catenin信號通路失調可能導致腫瘤的形成及腫瘤的復發。近年來有研究發現，Wnt信號通路的相關因子參與了OE的發生。但該通路是否參與OE的惡變過程尚不清楚。通過檢測Wnt信號通路的關鍵因子在OE惡變過程中的表達，進而了解該通路是否參與OE惡變的發生，并在臨床上結合OE病理切片圖像中aEM病變組織的出現，可以為EAOC的早期診治提供新思路。

β－catenin是經典Wnt通路的重要遞質，它能夠有效促進癌細胞的遷移、侵襲及增殖等，并能夠明顯阻斷癌細胞的凋亡。在缺乏Wnt配體的情況下，β－catenin可以被酪蛋白激酶1（CK1）、AXIN、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等組成的復合物所降解。

NGUYEN等研究發現，16%～54%的OE病人發生了β－catenin蛋白基因CTNNB1突變，進而導致β－catenin表達上調。而GOLDSBERRY等對DC小鼠生物模型的研究結果也顯示，因體內缺乏β－catenin，小鼠卵巢腫瘤的生長速度較慢。

本研究發現，β－catenin在OE惡變過程中的表達明顯增加，其濃度在OE組、aEM組、EAOC組依次升高。說明Wnt信號通路可能參與了OE惡變的過程，提示β－catenin可能為OE惡變潛在的生物指標之一。本研究對EAOC病人相關臨床病理特征分析發現，β－catenin蛋白高表達與病人的FIGO分期、組織學分級顯著相關，β－catenin高表達促進了EAOC的侵襲與轉移。因此，未來在EAOC的臨床診治過程中，可對β－catenin高表達者予以更為積極的手術及化療方案。

AXIN是一種支架蛋白，它與多種蛋白質（包括GSK3β、CK1等）具有相互作用的位點。AXIN在Wnt信號轉導通路中對β－cantenin的降解起到至關重要的作用。既往研究顯示，AXIN2基因沉默可通過調節線粒體相關凋亡信號通路從而減少細胞的凋亡，并通過調節細胞中Wnt/β－catenin信號通路的分子來增強細胞的增殖。本研究結果顯示，AXIN在OE惡變過程中的表達呈明顯降低的趨勢，提示Wnt信號通路可能參與了OE惡變的發生，并且與aEM發展為EAOC的過程有關，AXIN可作為監測OE惡變的潛在的參考指標。本文研究結果還顯示，AXIN表達與EAOC病人的FIGO分期、組織學分級顯著相關；EAOC組織中β－catenin、AXIN表達高度負相關，提示β－catenin、AXIN可能在EAOC的發生、侵襲、轉移過程中起互相拮抗的作用。

近年來，隨著對Wnt信號通路研究的深入，國內外學者也在其他惡性腫瘤中發現了AXIN與β－catenin的異常表達。YU等研究顯示，乳癌細胞中AXIN2低水平表達導致Wnt/β－catenin信號轉導通路異常，從而致乳癌的發生。YAMAMOTO等通過對174例直腸癌根治術后病人研究顯示，在Wnt信號通路中，AXIN可通過將β－catenin磷酸

化而下調其表達水平，抑制Wnt信號通路的激活，從而降低結直腸癌的發生發展。梁仁杰等研究表明，胃癌中AXIN可與突變型p53相互作用，降低β－catenin的表達，從而協同發揮腫瘤抑制因子的作用。本研究結果與上述研究結果相一致。

綜上所述，在OE、aEM、EAOC組織中β－catenin陽性表達率依次升高，而AXIN陽性表達率依次下降，提示Wnt信號通路可能參與了OE惡變的過程，且AXIN與β－catenin可能為OE癌變過程的重要因子，發揮著關鍵性的生物學作用。AXIN和β－catenin可能成為OE惡變早期診斷的潛在生物學指標，在臨床上結合病理組織學檢測結果，可以為EAOC病人的早期診療提供指導。

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（本文編輯 黃建鄉）