甘露特納膠囊改善阿爾茲海默病認知障礙并降低神經炎癥的機制研究

王玲玲,楊 娟,王 濤,李錦師,隋海晶,趙曉暉

(上海市浦東新區人民醫院神經內科,上海 201200)

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種損害記憶和認知功能的進行性神經退行性疾病,可能導致生命晚期的癡呆［1］。AD的主要病理結果是老年斑塊、神經纖維纏結、突觸結構穩定性的破壞和神經元死亡。甘露特納膠囊(sodium oligomannate capsules,GV-971)是一種源自海藻的口服寡糖,由上海綠谷制藥公司開發,用于治療AD。甘露聚糖酸鈉于2019年11月在中國首次獲得批準,用于治療輕中度AD,以改善認知功能［2］。GV-971是一種聚合度為2～10的低聚糖混合物［3］,可以直接與β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的多個亞區結合,抑制Aβ纖維的形成,并將預先形成的纖維穩定為無毒的單體［4］?？诜?大多數攝入的GV-971保留在腸道中,可以重建腸道微生物群,減少細菌代謝物驅動的免疫細胞向大腦的外周滲透,并抑制在動物模型中觀察到的大腦中的神經炎癥［4］。在一項為期36周的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的3期臨床試驗［4］中,GV-971顯示了對逆轉AD患者認知障礙的治療效果。本研究旨在探究GV-971改善認知功能及神經炎癥的機制,報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 AD淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)/早衰蛋白1(presenilin 1,PS-1)小鼠(雌性,9月齡)和WT-C57(野生型C57小鼠,雌性,9月齡)購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所［許可證號:SYXK(京)2021-0058,北京,中國］。所有小鼠均在我院動物實驗中心飼養。每組小鼠為6只,共計18只。動物分組如下:健康組(野生型C57小鼠)自由喂食及飲用水;對照組(APP/PS1小鼠)每天口服1次GV-971(100 mg/kg),其余時間自由進食及飲用水;治療組(GV971+APP/PS1小鼠)每天同一時段口服1次蒸餾水,其余時間自由進食及飲用水。持續3個月,在3個月結束時,對小鼠進行行為學測試評估其認知行為表現。

本研究中進行的所有小鼠飼養程序均經我院動物倫理委員會批準。

1.2Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗［5］用于評估小鼠的學習和記憶。小鼠被放置在1個裝滿水的圓形水池里(直徑1.2 m,24～26 ℃),視覺信號放置在水池周圍。水迷宮實驗包括1個可見測試(即刻)、隱藏站臺測試(第1～5天)和探針測試(第6天)。在可見測試和隱藏站臺測試期間,小鼠釋放到水池的頻率是4次/d,記錄逃避潛伏期(尋找隱藏站臺的時間)和游泳速度。如果小鼠未在60 s內找到平臺,則將其抓出并在站臺上放置15 s。在探針測試期間,釋放小鼠,并允許其在無平臺的水池內自由游泳60 s。記錄在每個象限中花費的時間百分比。

1.3Y型迷宮實驗 Y型迷宮試驗包括自發交替試驗和新臂探索試驗。Y型迷宮由3個對稱的手臂組成,呈120 °,不同顏色的圖案被貼在每個手臂上以便區分［6］。在自發交替試驗中,允許小鼠在Y型迷宮中自由移動8 min。小鼠在重疊的三聯組上連續進入3個手臂的行為被定義為自發交替。記錄小鼠的總進入次數和自發交替的次數。交替的百分比用以下公式計算:［自發交替的數量/(總的手臂條目數-2)］×100%［7］。在新的手臂探索測試中,1個手臂被擋板擋住,并被定義為新的手臂,允許小鼠探索其他2個手臂(家的手臂和熟悉的手臂),持續5 min。間隔2 h后,移除擋板,允許小鼠自由探索所有3個手臂5 min。用攝像機記錄小鼠進入新臂的次數、行走的距離以及小鼠在新臂上花費的時間,Y迷宮的準確性是正確交替和總交替之間的比率。每次試驗后用75%的乙醇清洗Y型迷宮。

1.4組織樣本采集 小鼠行為試驗結束后,腹腔注射戊巴比妥鈉 (800 mg/kg)麻醉小鼠,然后立即用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)(含4%多聚甲醛)進行心臟灌流。灌注后,冰上移出大腦,快速分為左右半腦并取出每個半腦的皮層和海馬組織。一部分分裝入提前標記好的EP管,液氮速凍,后放入-80 ℃保存,等待后一步實驗。另一部分4 ℃固定過夜,4 ℃、30%蔗糖孵育至平衡。用低溫恒溫器(CM1850,Leica,Wetzlar,German)制備冠狀切片,4 ℃保存。

1.5硫黃素S染色 自由漂浮切片(30 μm)在溶于50%乙醇的1%硫黃素S(北京索萊寶公司,北京,中國)中孵育10 min,用50%乙醇洗滌2次,每次5 min,然后再用蒸餾水洗滌1次,5 min;然后使用Vectashield熒光安裝介質(H-1000,上海桑戈生物科技有限公司,上海,中國)安裝切片。在熒光顯微鏡下(Olympus,Tokyo,Japan)老年斑顯示為綠色斑點狀,使用Image J(vision 1.48,National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)進行統計分析。

1.6酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 在每只小鼠中,大腦皮層或海馬體的左半部分在含有50 mmol/L Tris和5 mol/L鹽酸胍(pH 8.0)的緩沖液中均質化。將勻漿在室溫下混合4 h,并在含有5%牛血清白蛋白、0.03%吐溫20和蛋白酶抑制劑混合物的PBS中稀釋［8］。采用ELISA試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司,上海,中國)分析小鼠腦組織炎性細胞因子(interleukin-1β,IL-1β)、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的蛋白水平,通過比較樣品與標準品的相對吸光度來測定各因子的濃度。

1.7實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 收集小鼠腦組織,總采用Trizol(Invitrogen)提取總RNA。RNA濃度用Nanodrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)測量。RNA純度根據A260/A280(1.8～2.0)比值進行判斷。cDNA合成采用Takara cDNA Synthesis Kit (Otsu,Japan),miRNAs和mRNAs的real-time PCR檢測使用SYBR Green試劑(Bio Fact,Daejeon,South Korea)。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作內參,用2-△△Ct計算定量表達。實驗重復3次。引物如下表1所示,由生工生物工程(上海)股份有限公司)合成。

表1 水迷宮實驗檢測小鼠逃避潛伏期Table 1 Morriswater maze test to detect the escape latency of mice

表1 水迷宮實驗檢測小鼠逃避潛伏期Table 1 Morriswater maze test to detect the escape latency of mice

組別逃避潛伏期第1天第2天第3天第4天第5天健康組51.45±1.4538.67±4.5623.45±3.4519.21±4.5217.89±4.00對照組50.67±4.5648.99±4.6640.98±1.5652.74±2.7444.04±4.04治療組50.79±2.7940.12±4.1234.25±3.5636.54±4.1133.23±3.23組間F值=70.943 P值<0.001時點間F值=84.024 P值<0.001組間·時點間F值=15.259 P值<0.001

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

表2 水迷宮實驗檢測小鼠處于不同象限的時間Table 2 Morris water maze test to detect the time of mice spent in different target quadrants

表2 水迷宮實驗檢測小鼠處于不同象限的時間Table 2 Morris water maze test to detect the time of mice spent in different target quadrants

組別處于目標象限時間的百分比健康組53.32±3.32 對照組23.45±3.34*治療組41.23±1.23# F值171.507P值<0.001

*P值<0.05與健康組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

表3 Y迷宮檢測空間工作記憶的準確性Table 3 Accuracy of the Y-maze in detecting spatial working memory

表3 Y迷宮檢測空間工作記憶的準確性Table 3 Accuracy of the Y-maze in detecting spatial working memory

組別通過Y型迷宮的準確率健康組72.02±5.01 對照組51.50±5.20*治療組66.45±5.50#F值24.600P值<0.001

*P值<0.05與健康組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

1.8蛋白質印跡法(Western blot) 述各組小鼠腦組織或細胞裂解液置于冰預冷的RIPA裂解緩沖液中(碧云天生物技術有限公司,上海,中國)30 min,然后4 ℃,12 000×g離心10 min。上清液用于分析。用BCA法(碧云天生物技術有限公司)檢測蛋白濃度。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(碧云天生物技術有限公司)分離的蛋白轉移到硝基纖維素膜(Whatman,Piscataway,New Jersey)上,室溫下用封閉液(cat.no.P0023B,碧云天生物技術有限公司)封閉1 h,再用相應的一抗和膜一起孵育,并4 ℃過夜。洗膜并加入二抗室溫孵育2 h,ECL工作液(Merck Millipore,Billerica,MA,USA)顯影。最后用Image J軟件(vision 1.48,National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)進行數據分析,β-actin作為內參(一抗:BACE1,ab183612,1∶1 000;β-actin,ab8227,1∶1 000;二抗:山羊抗兔IgG H&L (HRP),ab205718,1∶5 000,Abcam,Cambridge,UK)。

1.9統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗和重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1GV-971改善小鼠認知障礙 對阿爾茲海默癥模型小鼠進行為期3個月的GV-971口服治療后,水迷宮實驗結果顯示,健康組和對照組的逃避潛伏期隨時間的推移均呈縮短趨勢,健康組比對照組趨勢更為明顯,治療組的逃避潛伏期隨時間的推移呈現先縮短后延長后縮短的趨勢,3組組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05),治療組在目標象限停留的時間百分比少于健康組和對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。治療組通過Y迷宮的準確率少于健康組和對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～3。

2.2GV-971降低AD小鼠神經炎癥 硫黃素S對腦組織染色結果顯示,與健康組相比,對照組大腦皮層和海馬區Aβ斑塊占比和斑塊面積顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,治療組小鼠大腦皮層和海馬區Aβ斑塊占比和Aβ斑塊面積均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。ELISA結果顯示,與健康組相比,對照組小鼠腦組織炎性細胞因子IL-1β和TNF-α水平顯著增高,而IL-10水平顯著降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與對照組相比,治療組IL-1β和TNF-α水平均顯著降低,而IL-10水平顯著上升,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖1、表4～5。

圖1 硫黃素S染色各組小鼠大腦皮層和海馬區的Aβ沉積

表4 硫黃素S染色各組小鼠大腦皮層和海馬區的Aβ沉積Table 4 Thioflavin S staining of Aβ deposition in the cerebral cortex and hippocampus of mice in each group

表4 硫黃素S染色各組小鼠大腦皮層和海馬區的Aβ沉積Table 4 Thioflavin S staining of Aβ deposition in the cerebral cortex and hippocampus of mice in each group

組別大腦皮層斑塊占比(%)斑塊面積(mm2)海馬體斑塊占比(%)斑塊面積(mm2)健康組0.99±0.22170.45±7.451.12±0.12100.31±4.41對照組1.92±0.23*234.34±4.34*2.45±0.45*171.32±5.34*治療組1.45±0.19#200.32±2.32#1.65±0.12#130.21±3.31#F值28.328230.73834.887388.314P值<0.001<0.001<0.001<0.001

*P值<0.05與健康組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

表5 ELISA檢測小鼠腦組織炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的含量Table 5 ELISA to detect the levels of inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α and IL-10 in brain tissues of mice

表5 ELISA檢測小鼠腦組織炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的含量Table 5 ELISA to detect the levels of inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α and IL-10 in brain tissues of mice

組別IL-1βTNF-αIL-10健康組11.24±0.31113.32±3.21165.25±11.23對照組56.42±0.89*230.45±3.45*69.58±4.56*治療組32.45±0.56#172.31±2.31#120.36±3.59#F值7 652.6652 241.558258.078P值<0.001<0.001<0.001

*P值<0.05與健康組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.3GV-971降低AD小鼠BACE水平 qRT-PCR和Western blot對各組小鼠腦組織BACE1的表達檢測結果顯示,與健康組相比,對照組小鼠腦組織中BACE1的mRNA和蛋白水平均升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,治療組小鼠大腦中BACE1的mRNA和蛋白表達下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表6、圖2。

圖2 Western blot檢測各組小鼠腦組織中BACE1的蛋白水平

表6 qRT-PCR及Western blot檢測各組小鼠腦組織中BACE1表達水平Table 6 qRT-PCR and Western blot to detect the expression level of BACE1 in the brain tissue of each group

表6 qRT-PCR及Western blot檢測各組小鼠腦組織中BACE1表達水平Table 6 qRT-PCR and Western blot to detect the expression level of BACE1 in the brain tissue of each group

組別BACE1 mRNABACE1 蛋白健康組1.00±0.04 0.29±0.04 對照組2.01±0.05*0.54±0.04*治療組1.45±0.05#0.41±0.01#F值698.27385.273P值<0.001<0.001

*P值<0.05與健康組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

AD是患者常見慢性神經退行性疾病之一,其特征是認知和記憶的進行性惡化［9-10］。AD的組織病理學標志是含有Aβ的細胞外斑塊和含有聚集的tau的細胞內纏結,以及選定腦區中的神經元和突觸損失。區域差異性淀粉樣β蛋白沉積已經在一些家族性AD導致APP和PS-1基因突變的轉基因小鼠品系或同時表達突變APP和PS-1的雙轉基因小鼠中捕獲［11］。

APP/PS1小鼠品系是廣泛用于模擬AD的動物模型,并且具有人類AD的許多特征,包括炎癥和突觸可塑性［12］。在本研究中,9個月大的APP/PS-1轉基因小鼠行為能力弱。APP可以進行非淀粉樣變或淀粉樣變加工,這取決于切割蛋白質的分泌酶［13］,在淀粉樣變形成過程中,APP被BACE-1酶切割,產生細胞外可溶性APP-β(sAPPβ)［14］。GV-971是一種被提出有新型作用機制的寡糖,在非臨床研究中,GV-971通過調節腸道微生物群和減少可能加重神經炎癥的外周炎癥,顯示了大腦神經炎癥的減少GV-971直接與Aβ結合,減少Aβ在大腦中的沉積［15-19］。在一項為期36周的臨床實驗中,GV-971在改善認知方面表現出顯著療效,并在所有觀察期內持續改善［20］。在本研究中APP/PS1小鼠經過GV-971治療后,空間記憶及行動能力部分恢復,另外本研究顯示GV-971能夠抑制AD小鼠腦組織BACE-1的表達。BACE-1是生成Aβ的關鍵酶。在轉基因AD動物模型中,腫脹和芽生軸突末梢,失營養性神經突起高表達BACE-1可能是導致局部Aβ生成增多和淀粉斑發展的關鍵因素［21］。因此推測GV-971可能具有降低sAPPβ水平的能力,由此能夠下調APP加工從而減少Aβ的產生。

現已知,炎癥在AD的病理學中起著重要作用［22］。神經炎癥既可能是AD的發病原因,也可能是AD病理或與其相關的風險因素的結果,并通過加劇Aβ的沉積和Tau蛋白病變而增加疾病的嚴重性。本研究通過檢測促炎因子TNF-α、IL-1β及抗炎因子IL-10的表達,探討GV-971對AD小鼠神經炎癥的影響。促炎細胞因子如TNF-α和IL-1β誘導空間記憶的損傷,根據淀粉樣蛋白級聯假說,Aβ沉積在老年斑塊中并引發促炎反應,導致氧化應激、神經元變性和神經炎癥［23］。TNF-α和IL-1β作為常見的促炎因子,是評價機體炎癥水平的常用指標。TNF-α是一種多功能炎癥細胞因子,能夠刺激IL-6、IL-8等因子的生成,從而使機體產生持續存在的炎癥反應。IL-10屬于內源性抗炎介質,已被證實可以減輕Aβ1-42所致AD動物學習記憶功能減退。本研究結果顯示,與野生型C57小鼠相比,APP/PS1小鼠促炎因子水平顯著上升,而抗炎癥因子水平顯著下降,證實AD中的神經炎癥反應。Mangalmurti等［24］研究表明,腦組織炎癥反應與AD癥狀的發生密切相關,抑制炎癥反應是治療AD的關鍵。本研究顯示,當APP-PS1小鼠經過GV-971治療后,GV-971炎癥水平下調,提示GV-971對AD小鼠神經炎癥的抑制作用。Tang等［25］研究顯示,LPS誘導的神經炎癥可以上調BACE-1、APP和Aβ在腦內的表達,且過表達BACE-1可能對AD的發生具有促進作用?；诩韧芯客茰y,GV-971可能通過降低BACE-1表達從而抑制神經炎癥。

綜上所述,初步推測GV-971介導BACE1對AD小鼠神經炎癥進行調控,但BACE1調控機制復雜,在今后的研究中,將進一步探究BACE1影響AD小鼠神經炎癥相關機制。