下調lncRNA-ATB抑制骨肉瘤發生發展分子機制研究

邱明憲

(河北省衡水市第四人民醫院骨科,河北 衡水 053000)

骨肉瘤是一種常發于兒童或青少年的惡性腫瘤之一［1］,近年來雖然對骨肉瘤的治療方法已有一定改進,但現階段骨肉瘤的治療效果和預后仍不夠理想［2］,其具體發病分子機制也未得到充分的探討。因此尋找新的特異性靶向因子顯得尤為重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度>200的內源性非編碼RNA［3］,已證實lncRNAs參與調控多種生物學進程［4］,且可能在惡性癌癥早篩以及治療中具有巨大潛能［5］。如?；撬嵘险{基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在骨肉瘤組織中的表達升高,過表達/敲除TUG1分別增加/減少骨肉瘤細胞的活力、遷移以及侵襲［6］;另外一項研究顯示lncRNA CBR3-AS1在骨肉瘤組織和細胞系中高表達,并與Enneking分期、遠處轉移和組織學分級相關［7］。LncRNA-ATB是一種主要由轉化生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)激活的長鏈非編碼RNA,多項報道［8-9］顯示其參與了人類疾病的特定生理和病理過程,可作為癌基因在多項惡性腫瘤中異常高表達,有作為癌癥的生物標志物潛力,Huang等［10］研究顯示LncRNA-ATB在喉癌組織樣本中異常高表達,與T分級和臨床分期有關,并且lncRNA-ATB高表達患者的總生存率明顯低于低表達組;Tang等［11］研究顯示在膠質瘤中,lncRNA-ATB可通過核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和P38/MAPK通路促進TGF-β誘導的膠質瘤細胞侵襲。然而迄今為止lncRNA-ATB在骨肉瘤中的工作機制暫未闡明,本研究旨在通過體內、體外兩方面深入探究lncRNA-ATB在骨肉瘤中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究中所有組織樣本取自2020年1月—2021年1月衡水市第四人民醫院經病理確診的28例患者手術切除的腫瘤標本及癌旁組織標本,其中男性19例、女性9例,平均年齡(17±5)歲,病理分析采用第8版骨肉瘤TNM分期標準,其中早期(Ⅰ～Ⅱ)20例,晚期(Ⅲ)8例。病例納入標準:①經病理組織學確診為骨肉瘤;②術前未接受化療、放療、分子靶向治療及生物治療;③患者未有感染性或系統性重大疾病者。

本研究經醫院倫理委員會批準［(2020)倫審第(53)號］,并已取得了患者的知情同意。

1.2主要試劑 人骨肉瘤細胞HOS、Saos-2和U2OS細胞株及正常人成骨細胞株NHOst購自美國ATCC,DMEM培養基;lncRNA-ATB過表達質粒以及其陰性對照、lncRNA-ATB表達抑制質粒以及其陰性對照質粒、實時定量-聚合酶鏈式反應(real time quantity polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒、TRIzol試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,Transwell小室購自美國密理博公司,一抗與辣根過氧化物酶標記的二抗均購自Abcam公司。Tunel凋亡檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養和轉染 人骨肉瘤細胞HOS、Saos-2和U2OS細胞株及正常人成骨細胞株NHOst使用含10%胎牛血清,100 mg/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640做為細胞培養液,培養條件為37 ℃含95%空氣和5% CO2。轉染前24 h將生長狀態良好的Saos-2細胞按5×105個/孔接種于6孔板,按照轉染試劑LipofectamineTM 2000 試劑說明書對細胞進行轉染,將Saos-2細胞分為ATB組、NC組、siATB組以及siNC組,分別轉染ATB過表達質粒以及其陰性對照;ATB表達抑制質粒以及其陰性對照質粒。

1.3.2qRT-PCR檢測骨肉瘤組織和細胞株lncRNA-ATB表達 使用Trizol從細胞系或組織中提取總RNA,紫外分光光度法測定RNA的含量,瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應,qRT-PCR結果以2-△△CT值形式得到,每個樣本重復3次。引物序列如下:lncRNA ATB-F:5′-CTTCACCAGCACCCA-GAGA-3′,lncRNA ATB-R:5′-AAGACAGAAAA-ACAGTTCCGAGTC-3′;GAPDH-F:5′-GGTGAA-GGTCGGAGTCAACG-3′,GAPDH-R:5′-CAAA-GTTGTCATGGATGHACC-3′。

1.3.3CCK8實驗檢測Saos-2細胞增殖能力 Saos-2細胞按接種于96孔板,每孔200 μL細胞懸液,使用CCK-8試劑盒,用酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4流式細胞法檢測Saos-2細胞細胞周期 將對數生長期的Saos-2細胞收集于5 mL離心管中,用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通離心機100×g離心5 min后棄上清,再用預冷的PBS洗滌1次,100×g離心5 min后棄上清,收集細胞于同一5 mL流式離心管中,然后用4 ℃預冷的70%乙醇固定細胞1 h。去除乙醇后用PBS洗滌1次,用細胞染色液重懸細胞,并調整細胞密度為1×106個/mL,最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.5Transwell侵襲實驗檢測Saos-2細胞遷移能力 骨肉瘤Saos-2細胞接種用Matrigel凝膠包被的上腔進行侵襲實驗,將不含血清的培養基和含10%FBS的培養基分別添加到上孔和下孔中,繼續培養24 h。然后,小心地去除非侵襲性細胞。濾光片用90%乙醇固定,結晶紫染色。用倒置顯微鏡觀察下層細胞,每個實驗重復3次。

1.3.6Tunel實驗檢測Saos-2細胞凋亡 Saos-2細胞用4%多聚甲醛固定30～60 min,用原位細胞凋亡檢測試劑盒檢測TUNEL染色,并根據制造商的指示用DAPI染色10 min,熒光顯微鏡下觀察Tunel陽性細胞數。

1.3.7免疫組織化學檢測骨肉瘤腫瘤組織lncRNA-ATB表達 骨肉瘤腫瘤組織用4%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片厚3 μm。石蠟切片梯度脫蠟、水化后,加入3%H2O2溶液室溫孵育15 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。將切片置于檸檬酸鹽抗原修復液中,進行抗原修復。加入5%的正常羊血清封閉15 min。隨后加入1∶100比例稀釋的Ki67抗體。加入辣根過氧化物酶標記的兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。采用3,3-二氨基聯苯胺顯色后,蘇木精室溫復染2 min,而后進行脫水和中性樹脂封片,采用正置顯微鏡觀察切片。

1.3.8構建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型檢測lncRNA-ATB對體內增殖和腫瘤生長情況 選取BALB/c裸鼠32只,5～9周,體重14～21 g,所有裸鼠隨機分為ATB組,siATB組及各自對照組,每組8只。Saos-2細胞轉染后,每只裸鼠接種細胞數為1×106個/只。21 d將裸鼠置于無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級動物實驗室正常飼養。裸鼠接種細胞21 d后腹腔注射水合氯醛麻醉(0.01 mL/g)并引頸脫臼處死裸鼠,從皮下去除其腫瘤組織并稱重,測量體積及甲醛固定。

1.4統計學方法 應用SPSS Statistics 22.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1骨肉瘤組織和細胞株中lncRNA-ATB的表達水平 采用GeneCards生信軟件(https://www.genecards.org/),找到lncRNA-ATB在染色體上的位置,qRT-PCR結果顯示,28例患者組織中,骨肉瘤組織中的lncRNA-ATB表達水平(2.31±0.37)高于癌旁正常組織(1.00±0.09),差異有統計學意義(t=8.427,P<0.001),見圖1。與NHOst組相比,lncRNA-ATB在HOS,Saos-2和U2OS中均升高,其中Saos-2中表達最高,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。因此選擇Saos-2細胞株用于后續實驗。

表1 骨肉瘤細胞株中ATB相對表達Table 1 Relative expression of ATB in osteosarcoma cell lines

組別ATB相對表達NHOst組1.00±0.09HOS組2.24±0.18*U2OS組3.11±0.28*Saos-2組3.47±0.32*#△ F值39.634 P值<0.001

*P值<0.05與NHOst組比較 #P值<0.05與HOS組比較 △P值<0.05與U2OS組比較(SNK-q檢驗)

圖1 lncRNA-ATB在染色體上的位置

2.2lncRNA-ATB對 Saos-2細胞增殖、周期、遷移和凋亡的調控作用 ATB組Saos-2細胞的OD值高于NC組,ATB組Saos-2周期S期長于NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。siATB組Saos-2細胞OD值低于siNC組;siATB組Saos-2周期S期短于siNC組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2,3。ATB組能抑制Saos-2細胞凋亡率,而siATB組后則相反增加Saos-2細胞的凋亡率,ATB組的細胞穿孔數多于NC組,siATB組少于siNC組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

表2 NC組和ATB組Saos-2細胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

表2 NC組和ATB組Saos-2細胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

組別OD值S期細胞比例(%)NC組 1.41±0.1212.37±1.25ATB組2.61±0.1817.14±1.67t值13.5874.427P值<0.0010.010

表3 siNC組和siATB組Saos-2細胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

表3 siNC組和siATB組Saos-2細胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

組別OD值S期細胞比例(%)siNC組 1.52±0.1413.85±1.31siATB組0.49±0.054.02±0.27t值16.97118.002P值<0.001<0.001

圖2 lncRNA-ATB對 Saos-2細胞增殖,周期,遷移和凋亡的調控作用

2.3構建骨肉瘤裸鼠模型檢測lncRNA-ATB對體內腫瘤增殖和腫瘤生長情況 利用Saos-2細胞構建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,21 d后剝離瘤體稱重,結果顯示,ATB組(1.09±0.08)皮下腫瘤重量重于NC組(0.58±0.03),差異有統計學意義(t=10.339,P<0.001),siATB組(0.36±0.03)皮下腫瘤重量輕于siNC組(0.71±0.06),差異有統計學意義(t=9.037,P<0.001)。選取組織進行切片,Ki67實驗檢測皮,結果顯示ATB組下骨肉瘤細胞核中陽性染色細胞百分比多于NC組,siATB組下骨肉瘤細胞核中陽性染色細胞百分比少于siNC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3 。

圖3 構建骨肉瘤裸鼠模型檢測增殖和腫瘤生長情況

3 討 論

LncRNA作為細胞生物學領域的研究熱點,越來越多的證據［12-13］表明其可用來評估骨肉瘤的發展和轉移的風險。LncRNA-ATB 是近年來顯示的由TGF-β表達激活的一種長鏈非編碼RNA,已被證明可用于多種人類癌癥的預后標志物。TGF-β是促進骨肉瘤進展的重要細胞因子,有研究顯示通過抑制TGF-β1表達,進而對骨肉瘤細胞的遷移和侵襲產生抑制作用,因而lncRNA-ATB也可能是骨肉瘤相關的重要lncRNA。但目前關于lncRNA-ATB在骨肉瘤中作用機制的研究甚少?，F有研究已顯示lncRNA-ATB在包括肝細胞癌、肺癌、卵巢癌在內的多種癌癥中表達異常,Yuan等［14］學者研究顯示,lncRNA-ATB在卵巢癌中異常高表達,沉默LncRNA-ATB可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡;Li等［15］研究顯示lncRNA-ATB在肺癌組織中表達上調,并與腫瘤大小和轉移相關,另外一項研究［16］提示在乳腺癌中,lncRNA-ATB 表達同樣異常升高,敲低lnc-ATB顯著抑制乳腺癌細胞的上皮-間充質轉化等。本研究顯示,lncRNA-ATB在骨肉瘤組織以及HOS、Saos-2和U2OS細胞系中都呈現不同程度高表達,提示lncRNA-ATB的異常表達可能與骨肉瘤密切相關。為了進一步驗證lncRNA-ATB在骨肉瘤中的調控機制,構建骨肉瘤裸鼠模型,通過體內驗證lncRNA-ATB對骨肉瘤腫瘤生長的影響,顯示過表達lncRNA-ATB促進腫瘤的生長和體內細胞增殖,而抑制lncRNA-ATB則能產生抗腫瘤生長和抑制增殖的效應。通過造模體內實驗的驗證,更加確信lncRNA-ATB參與了骨肉瘤的病理進程,與其發生發展密切相關。

骨肉瘤是最具侵襲性的惡性腫瘤之一,具有較高的發病率和較低的治愈率,因此細胞實驗探究lncRNA對骨肉瘤細胞生物學功能顯得至關重要。近年來,研究［17］表明lncRNAs可促進/抑制腫瘤細胞增殖等生物學行為進而在癌癥中發揮重要作用,在骨肉瘤相關報道［18］中,通過細胞功能實驗顯示過表達lncRNA-TUSC7抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,同時促進體外細胞凋亡;Han等［19］研究顯示在骨肉瘤中,lncRNA-BCRT1表達增高可促進骨肉瘤細胞的生長和細胞周期;Chen等［20］顯示LOC100129620能促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移。本研究顯示lncRNA-ATB在HOS、Saos-2和U2OS多種骨肉瘤細胞系中均顯著升高,其中Saos-2中表達最高,因此選擇Saos-2細胞株用于后續實驗,探究lncRNA-ATB在骨肉瘤細胞惡性生物學行為中的影響。結果顯示,lncRNA-ATB可以促進Saos-2細胞增殖,周期S期的聚集,增加細胞遷移率及抑制細胞凋亡,而采用RNA干擾技術后顯示,干擾lncRNA-ATB可以產生抑制增殖、周期、遷移及促進凋亡的效果。

綜上所述,本研究充分地闡述了干擾lncRNA-ATB表達可以抑制人骨肉瘤Saos-2細胞增殖、周期、遷移及促進細胞凋亡,并且抑制體內腫瘤生長,但本研究也具有一定的局限性,基于lncRNA作用機制,在后續的相關研究中,將深入探究lncRNA-ATB做為ceRNA調控下游miRNA在骨肉瘤中的作用機制,為對抗骨肉瘤的調控機制作出全新的詮釋,為抗骨肉瘤早篩及治療提供新的潛在靶點。