銀杏葉提取物改善高脂血癥大鼠肝損傷的機制

王 昱,何九軍

(1.隴南師范高等?？茖W校,甘肅 成縣 742500;2.隴南特色農業生物資源研究開發中心,甘肅 成縣 742500)

現代醫學認為,高脂血癥指人體脂質代謝異常,血漿里的脂質濃度異常升高,并超過正常參考值范圍的疾?。?］,該病對身體的損害是隱匿而進行性和全身性的,是引發脂肪肝以及動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的元兇［2］,因此,調節脂質代謝對預防和治療高脂血癥尤為重要.研究表明,甘油三酯水解酶(ATGL)和激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)是水解脂肪的關鍵酶［3］,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是調節脂肪細胞分化和能量代謝的關鍵性轉錄因子［4］,蛋白磷酸酶1(PP1)、DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)和上游刺激因子1(USF1)脂肪酸合成的重要調控因子［5-6］,而固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)是調控脂肪合成和葡萄糖代謝相關酶基因表達的決定因子,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)則是調控SREBP-1c的上游因子之一［7］.這幾類因子可能共同調控著機體內脂類代謝途徑的穩態.目前,臨床上常用的一線降脂藥物為他汀類和貝特類,但此類藥物會引起惡心、腹瀉、肝毒性等嚴重不良反應［8-9］,而傳統中藥或天然產物中含有大量具有降血脂作用的活性成分,這種活性因具有多靶點、多層次、副作用少的特點用來預防高脂血癥及相關疾病而成為了現代生物研究的熱點［10］.

銀杏葉提取物(GBE)的主要有效成分為黃酮類和萜內酯類［11］,它具有抗炎、抑制神經細胞凋亡和興奮性氨基酸的釋放、抗氧化和氧自由基損傷等多種生物效應［12］.近年來研究發現,GBE對高脂血癥大鼠的血脂水平有顯著改善［13-15］,但對它確切的分子機制仍未知.本研究擬利用生物顯微技術、酶聯免疫吸附、定量PCR及Western blot等,探討GBE是否對高脂血癥模型大鼠肝損傷具有干預作用的可能機制,旨在為臨床高脂血癥提供新治療靶點及銀杏葉的開發利用提供依據.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

銀杏葉提取物為棕褐色粉末(總黃酮醇苷25.57%、萜類內酯6.62%、銀杏總酸1.24×10-6),購自陜西斯諾特生物技術有限公司;高糖高脂飼料(20%蔗糖、0.2%膽酸鈉、0.8%膽固醇、15%豬油、適量的磷酸氫鈣、酪蛋白、石粉等,購自北京博泰宏達生物技術有限公司;脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)酶聯免疫試劑盒,均購自上?？祈樕锟萍加邢薰?鼠抗PPARγ、SREBP-1、PP1、DNA-PK、AMPK、USF1抗體,均購自武漢艾美捷科技有限公司;0.45 μm硝酸纖維膜,購自Solarbio公司;β-actin抗體、二抗羊抗兔IgG,購自上海碧云天生物技術研究所;熒光定量PCR試劑,購自TakaRa公司.

1.2 主要儀器

BS-300型全自動生化分析儀(深圳邁瑞),TGL-16M高速臺式冷凍離心機(美國Beckman-coulter公司),DYCPZ型電泳槽、DYY-IB型電泳儀(北京市六一儀器廠),FX-35WA Nikon顯微鏡(日本Nikon公司),7900 HT定量PCR儀(美國ABI公司),核酸蛋白分析儀(美國貝克曼庫爾特公司).

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠,雄性、6～8周齡、體重(220±5)g,購自蘭州獸醫研究所實驗動物中心(生產許可證號:SCXK(甘)2015-0001).

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計

將50只SD大鼠隨機分為5組,分別為對照組、模型組、GBE低劑量組、GBE中劑量組、GBE高劑量組,每組10只.參照文獻[16],對照組給予普通飼料,模型組與GBE劑量組給予不同濃度梯度的酒精和高糖高脂飼料,自由飲食酒精,通過大鼠毛色、食欲、糞便、對外界刺激的反應情況及血脂水平等指標來判定建模是否成功.造模同時,參考文獻[12,15]并結合GBE半數致死劑量,GBE低、中、高劑量組分別按25,50,100 mg/kg(以體質量計)灌胃GBE,每日1次,連續給藥24周后,記錄所有動物的體質量.常規麻醉,眼球采血,離心(3 000 r/min)10 min,全自動生化分析儀測定血清中TG、ALT、AST及FFA水平.處死大鼠后,取肝組織稱重,計算肝指數.肝指數=肝質量(g)/體質量(g)×100%.

1.4.2 組織病理學檢查

取肝左葉同一部位組織,固定于15%中性福爾馬林緩沖液,經常規組織脫水、透明、包埋、切片,然后進行蘇木素-伊紅(H.E.)染色,顯微鏡下觀察同一部位肝組織并記錄病理變化.

1.4.3 ELISA檢測脂肪ATGL和HSL水平

取約0.5 g同一側腹腔脂肪組織,在冰浴中用高速分散均質機充分研碎,制備成10%脂肪勻漿,3 500 r/min離心10 min,吸取上清液用ELISA法檢測脂肪ATGL和HSL水平.

1.4.4 熒光定量PCR檢測肝組織PP1、DNA-PK、USF1、PPARγ、AMPK和SREBP-1c基因mRNA相對表達量

在2 mL的離心管中加入大鼠肝臟和Trizol后用勻漿器反復研磨,離心(15 000 r /min)10 min,用酚-氯仿抽提上清液中RNA,再進行逆轉錄反應、PCR擴增,以β-actin為內參.采用ABI 7500軟件分析反應結果,用2-ΔΔCt方法進行相對定量.引物由上海Invitrogen公司設計合成,引物序列見表1.

表1 熒光定量PCR引物

1.4.5 Western blot 檢測肝臟PP1、DNA-PK、USF1、PPARγ、AMPK和SREBP-1c蛋白的表達

在RIPA裂解液中加入肝臟組織,制成10%的組織勻漿,4 ℃離心(1 200 r/min)15 min,提取總蛋白,BCA法測定蛋白質濃度.凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜和封閉.按抗體說明書加入兔抗鼠一抗PP1、DNA-PK、USF1(均1∶1 000)、PPARγ(1∶1 500)、AMPK(1∶1 000)、SREBP-1c(1∶2 000),4 ℃過夜,充分洗滌,加偶聯辣根過氧化物酶(HRP)的二抗IgG(1∶2 000),ECL顯色,運用Image Lab4.1圖像分析,以PP1、DNA-PK、USF1、PPARγ、AMPK和SREBP-1c蛋白分別與β-actin條帶灰度比值表示相對表達水平.

1.5 統計分析

2 結果

2.1 GBE對高脂血癥大鼠肝指數的影響

與對照組相比,模型組大鼠肝指數顯著升高(P<0.01).與模型組相比,GBE低劑量組大鼠肝指數出現下降趨勢,但差異不顯著(P>0.05).GBE中、高劑量組大鼠肝指數顯著下降(P<0.05,P<0.01).GBE低、中、高劑量組大鼠肝指數顯著高于對照組(P<0.05,P<0.01),見圖1.

注:組間條形圖上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05),下同.

2.2 GBE對肝組織結構的影響

對照組大鼠肝組織呈現正常形態,肝小葉清晰可見,圍繞中央靜脈肝細胞索呈放射狀排列,肝細胞內無脂滴分布.模型組大鼠的肝小葉結構破壞、形態不清,細胞索排列紊亂,脂質空泡遍及整個肝組織,有炎性細胞浸潤,胞漿內有大小不等、數量不一的彌散性空泡狀脂滴.與模型組相比,GBE各劑量干預后,大鼠肝小葉清晰,肝細胞排列及結構趨于整齊,細胞內脂滴逐漸消失,見圖2.

注:A.對照組;B.模型組;C.低劑量組;D.中劑量組;E.高劑量組(標尺示100 μm).

2.3 GBE對高脂血癥大鼠血清TG、FFA含量的影響

模型組大鼠血清TG、FFA含量較對照組極顯著升高(P<0.01).GBE干預后,大鼠血清TG、FFA含量較模型組顯著降低(P<0.05,P<0.01).GBE低、中、高劑量組大鼠血清TG含量高于對照組(P<0.05,P<0.01),GBE低、中劑量組大鼠血清FFA含量高于對照組(P<0.05,P<0.01),但高劑量組血清FFA含量與對照組差異不顯著(P>0.05),見圖3.

圖3 GBE對高脂血癥大鼠血清TG、FFA含量的影響(mmol/L)

2.4 GBE對高脂血癥大鼠肝功能的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清ALT和AST活性極顯著升高(P<0.01);與模型組比較,經GBE各劑量干預后,大鼠血清ALT和AST活性明顯降低(P<0.05,P<0.01).但GBE低、中劑量組大鼠血清ALT和AST活性高于對照組(P<0.05,P<0.01),高劑量組血清ALT和AST活性與對照組差異不顯著(P>0.05),見圖4.

圖4 GBE對高脂血癥大鼠血清AST和ALT水平的影響

2.5 GBE對高脂血癥大鼠甘油三酯水解酶的影響

與對照組相比,模型組大鼠脂肪中甘油三酯水解酶HSL活性明顯升高(P<0.01),ATGL含量顯著降低(P<0.01);與模型組相比,GBE低、中、高劑量組大鼠脂肪甘油三酯水解酶HSL含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),ATGL含量明顯升高(P<0.05,P<0.01).但GBE低、中劑量組大鼠脂肪中甘油三酯水解酶與對照組差異顯著(P<0.05,P<0.01),高劑量組脂肪中甘油三酯水解酶與對照組差異不顯著(P>0.05),見圖5.

圖5 GBE對高脂血癥大鼠甘油三酯水解酶的影響

2.6 GBE對高脂血癥大鼠肝組織脂質代謝相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠肝組織PP1、SREBP-1c、DNA-PK、USF1蛋白的表達量均極顯著升高(P<0.01),而肝組織中PPARγ和AMPK蛋白的表達量極顯著降低(P<0.01);與模型組比較,低、中、高劑量GBE均能影響肝組織PP1、DNA-PK、USF1、SREBP-1c、AMPK和PPARγ蛋白的表達,其中PP1、DNA-PK、USF1、SREBP-1c的表達量均顯著降低(P<0.05,P<0.01),AMPK和PPARγ的表達量顯著增加(P<0.05,P<0.01).定量PCR檢測肝組織PP1、SREBP-1c、DNA-PK、USF1、AMPK及PPARγ mRNA表達水平的結果與其蛋白表達水平一致.

3 討論

高脂血癥是血中膽固醇和(或)甘油三酯過高的一種“血脂異?！北憩F,由生物脂肪代謝或運轉異常引起,能誘發脂肪肝和動脈粥樣硬化等并發癥的發生［17-18］.肝臟在脂類的消化、吸收、分解、合成及運輸等脂質代謝過程中起核心作用,當脂肪組織堆積于肝臟,導致肝組織浸潤變性,就會加劇脂代謝紊亂［19］.一般而言,高脂血癥屬于可逆性疾病,盡早發現并及時治療往往可恢復正常,這為臨床診療提供了參考依據［20］.陳梅霞、陳為健、許麥成等［13-15］研究發現,GBE能明顯降低高脂血癥大鼠血清TC、TG和低密度脂蛋白含量,抑制脂質反應,具有明顯降血脂的功效,這與本實驗結果一致.GBE可改善高脂血癥模型大鼠肝組織的病理變化,顯著降低肝指數及血清FFA、TG、ALT、AST水平,減輕炎癥細胞浸潤或脂肪病變.但本研究通過觀察檢測肝臟結構功能、甘油三酯水平、甘油三酯水解酶、脂代謝調控因子等指標,主要研究GBE影響高脂血癥大鼠肝的作用機制.研究發現,機體內脂類代謝的途徑包括脂類的合成、吸收及排泄,而脂類代謝途徑的穩態依賴于體內多個因子的共同調控［21］.PPARγ-HSL/ATGL、AMPK/SREBP-1c和PP1-DNA-PK-USF1信號通路與脂肪細胞形成、脂肪沉積和脂肪因子分泌、營養水平等脂肪代謝過程密切相關［22-23］.本實驗結果顯示,模型組大鼠肝組織PPARγ、AMPK、p-AMPK表達水平顯著降低,肝組織SREBP-1c、PP1、DNA-PK和USF1表達水平顯著增高;脂肪ATGL含量顯著降低,HSL含量顯著升高.GBE干預后,大鼠肝組織PPARγ、AMPK、p-AMPK表達水平顯著增高,肝組織SREBP-1c、PP1、DNA-PK和USF1表達水平顯著降低;脂肪ATGL含量顯著升高,HSL含量顯著降低.這說明GBE對PPARγ-HSL/ATGL、AMPK/SREBP-1c和PP1-DNA-PK-USF1信號通路有明顯的干預作用,進而影響大鼠脂類物質代謝.銀杏提取物能改善肝功能,減輕肝臟損傷,進一步說明GBE作用PPARγ-HSL/ATGL、AMPK/SREBP-1c和PP1-DNA-PK-USF1信號通路是防治高血脂癥的有效靶點.

圖6 GBE對高脂血癥大鼠肝組織脂質代謝相關蛋白表達的作用

總之,GBE通過調節PPARγ-HSL/ATGL、PP1-DNA-PK-USF1和AMPK/SREBP-1c信號通路,影響高脂血癥大鼠的血脂水平,加速膽固醇的代謝,改善肝功能,進而改善脂質代謝紊亂,減少脂質沉積作用.此研究以期為降血脂中藥新藥或保健食品研發提供參考和理論依據,也為探究中藥多靶點協同調控脂質代謝作用提供了研究思路.