布魯菌病患者外周血NK 細胞亞型及穿孔素蛋白的臨床分析

李宇璞，喬鵬飛，其其格，趙海珍，劉瑞軍，季曉磊

（1.內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，內蒙古 呼和浩特 010059；2.內蒙古醫科大學附屬醫院影像診斷科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古醫科大學附屬醫院感染性疾病科，內蒙古 呼和浩特 010050）

布魯菌?。˙rucellosis，簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮伲˙rucella）細菌引起的全球性人畜共患變態反應性傳染病，每年感染者超過50 萬[1]。布魯氏菌為胞內寄生菌，在胞內菌感染的機體抗感染免疫防御機制中，細胞殺傷效應占主導地位[2]。自然殺傷細胞（naturel killer cell，NK）作為機體天然免疫細胞的主要成分，識別外來病原體，識別被病原微生物感染的細胞，如單核、巨噬細胞，并無需依賴抗體，無需預先致敏，通過穿孔素、顆粒酶等發揮細胞毒性作用；同時分泌大量干擾素、白細胞介素等細胞因子、黏附分子受體及趨化因子的受體來發揮殺傷細胞和免疫調節作用。本研究通過流式細胞術測定布病患者外周血NK 細胞表型及穿孔素蛋白、顆粒酶的表達，從而進一步評估布病患者NK細胞功能狀態。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例來源 選取內蒙古醫科大學附屬醫院感染科及內蒙古地方病防治中心的布魯菌病患者，并將同期就診的健康人作為對照組。共納入65 例布魯菌病患者作為實驗組，按SAT 可分為兩組：將結果為SAT1：50（+～++）的30例，作為慢性布魯菌病患者組；將結果為SAT1：100（+～++++）的35例，作為急性布魯菌病患者組。并將同期體檢結果為BPT（-）、SAT（-）的30例作為健康對照組。故最終分組為RBPT（-）、SAT（-）組，SAT1：50（+～++）患者組和SAT1：100（+～++++）患者組。

1.1.2 疾病診斷標準（同時符合以下項目者）流行病學史+典型的臨床癥狀體征+虎紅平板凝集試驗（RBPT）試管凝集試驗（SAT）和/或局部活組織病理檢查陽性或細菌學診斷陽性。

1.1.3 納入標準（同時符合以下項目者） 門診/住院患者，年齡18～65 歲，符合布病診斷標準，自愿簽訂知情同意書。

1.1.4 排除標準 合并糖尿病、肺部感染、泌尿系統感染、風濕病、腫瘤、心腦血管病及肝、腎、造血系統嚴重疾病及其他骨關節病，妊娠期或哺乳期，過敏體質、精神病。

1.1.5 樣本量估算 病例數依據“樣本數須為變量數的5～10倍”的原則進行調整

1.1.6 CD56brightCD16+、CD56dimCD16+、CD56brightNK 細胞穿孔素蛋白、顆粒酶B等均購自BD公司。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集符合納入標準患者治療前兩天采集人口學特征、流行病學調查，于清晨采集納入者空腹狀態下外周血4 mL，并注入盛有EDTA 抗凝劑的抗凝管中低溫送至臨床試驗中心，6 h 內處理樣本，進行細胞表面標記抗體和細胞毒效應分子細胞內染色，利用流式細胞儀檢測NK 細胞的表型、NK細胞穿孔素蛋白、顆粒酶B表達量。

1.2.2 實驗步驟（NK 細胞的表型、NK 細胞穿孔素蛋白、顆粒酶B表達）：

（1）樣品（全血）100 μL。

（2）胞膜標記：樣品管依次加PerCP5 μL、FITC5 μL，渦旋混勻，室內避光孵育20～30 min（25 min）。

（3）裂解：樣品管加1X 裂解液（10X 裂解液555899 1.5 mL+13.5 mL去離子水）2 mL，渦旋混勻，室溫避光孵育20～30 min（30 min），離心3000～5000 g/min（1600 r/min）5 min，棄上清液。

（4）PBS2 mL 重懸細胞，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液。洗2遍。

（5）固定：樣品管加固定液554722 250 μL，重懸細胞。4 ℃避光孵育20 min，離心5 min，棄上清液。

（6）洗滌：樣品管加1X 洗脫液（10X 洗脫液554723 1.5 mL+13.5 mL 去離子水）1 mL，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液。洗2遍。

（7）胞質標記：樣品管加1X 洗脫液50 μL，重懸細胞。依次加APC 5 μL、PE 5 μL，4 ℃避光孵育20～30 min（20 min）。

（8）PBS1 mL，重懸細胞，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液，洗1遍。

（9）PBS500 μL重懸細胞，上機，進行流式分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件包分析數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用snk-q 檢驗；計數資料以例n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05 表示組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

納入布病患者65 例，包括慢性布魯菌病患者SAT1：50（+～++）30 例和急性布魯菌病患者SAT1：100（+～++++）35 例，其中男性40 例、女性25 例，平均年齡48.84 歲，職業分布以農民、獸醫為主；主要接觸牛羊，以接觸羊為主（見表1）。

表1 布魯菌病及對照組一般情況（n，±s）

表1 布魯菌病及對照組一般情況（n，±s）

一般資料RBPT(-)、SAT(-)組SAT1：50(+～++)患者組SAT1:100(+～++++)患者組例數性別（男/女）年齡（歲）職業接觸史30 15/15 52.43±10.85農民羊30 17/13 50.86±12.25農民羊35 23/12 48.03±15.24農民羊

2.2 患者外周血NK細胞表型特點

應用流式細胞技術對布病患者（SAT1：100+～++++、SAT1：55+～+++）和對照組（SAT 陰性）外周血NK細胞（CD56brightCD16+/-+CD56dimCD16+）細胞進行檢測。急、慢性布魯菌病患者外周血淋巴細胞中CD56dimCD16+和CD56brightNK 細胞細胞比率與RBPT（-）、SAT（-）組比較有所減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 3組外周血外周血NK細胞比例

2.3 穿孔素在急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）外周血NK細胞的表達

流式細胞技術檢測了穿孔素、顆粒酶B 在NK細胞兩亞群CD56dimCD16+和CD56brightCD16+/-NK 細胞上的表達頻率。實驗結果表明急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）外周血NK 細胞顆粒酶B 的表達率與RBPT（-）、SAT（-）組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。而急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）組外周血NK 細胞穿孔素蛋白的表達率與RBPT（-）、SAT（-）組NK 細胞穿孔素蛋白表達率比較差異具有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。

表3 3組外周血外周血NK細胞顆粒酶B、穿孔素蛋白的表達

3 討論

NK 細胞作為人體抗感染免疫防御系統抵御外來病原微生物侵入的第一道防線，具有強大的溶解細胞的能力，其具備激活不受MHC 限制、不依賴抗體、無需預先致敏、快速非特異性地識別病原微生物、識別被感染的靶細胞、殺傷作用效果早等特性，在機體抗腫瘤和抗病毒的早期發揮重要作用[3]。同時也參與機體獲得性免疫調節功能。

在人體，NK 細胞主要分布于外周血循環和淋巴器官，在外周血中占單核細胞的5%～20%。NK細胞表型為CD3-CD56+，根據其功能不同按細胞表面CD56 和CD16 的表達水平不同分為CD56brightCD16+和CD56dimCD16+/-兩個不同的細胞亞群，它們在裂解靶細胞的功能上和產生細胞因子的功能上有所不同。外周血和炎癥組織中90%的NK 細胞為CD56dim，具有細胞毒性作用，而不足10%為CD56bright細胞，細胞毒活性低于CD56dim細胞，具有分泌免疫調節細胞因子作用[4，5]。賴瀚鈴等[6]研究中提示在SLE患者外周血CD3-CD56+NK、CD16+NK、CD107a+NK細胞比例均顯著低于對照組，活動亞組SLE 患者CD3-CD56+NK、CD16+NK 細胞比例均顯著低于非活動亞組（P＜0.05）。張偉等[7，8]研究中梅毒患者與正常對照比較外周血中NK 細胞比值差異無統計學意義（P＞0.05）。梅毒患者NK細胞中Tim-3的表達水平明顯上調，特別是CD56dimNK細胞，且Tim-3的表達與血清中IFN-γ 水平呈負相關性（P＜0.05，r=-0.4506）。潘招軍[9]認為在EV71 感染和重癥手足口病患兒外周血NK 細胞顯著減少，主要表現為CD56dimNK 細胞的減少，而CD56brightNK 細胞無明顯變化，外周血CD56dimNK 細胞在手足口病患兒病情較輕時，細胞毒性作用（GL 和GB，CD107a）增加可能與病毒清除相關。EV71 感染患兒中，CD56brightNK 細胞增加，炎性細胞因子與抗炎因子分泌功能嚴重紊亂，可能參與了EV71 感染的手足口病的重癥化。劉貝貝等[10]在艾滋病的研究中得出Siglec-7+NK 細胞亞群功能優于陰性亞群，但在HIV感染中本群發生明顯下降，Siglec-7+CD56dimNK細胞亞群數量與CD95的表達呈負相關。EBVcHL 患者與EBV-cHL 患者相比，CD56dimCD16 NK 細胞亞群頻率降低[10]。COVID-19患者NK CD57 和CD56dimNK 細胞比例較高，NKT 和CD56bright細胞比例較低[11]。我團隊在前期研究中得出布魯菌病患者外周血NK 細胞計數下降的結論[12]。在本研究中，急、慢性布魯菌病患者外周血淋巴細胞中CD56dimCD16+和CD56brightNK 細胞細胞比例與RBPT（-）、SAT（-）組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

NK 細胞對靶細胞的殺傷有多種途徑，如細胞毒性顆粒，其中含有穿孔素蛋白、顆粒酶A/B 和Fas配體等蛋白定向胞吐、特異性分泌溶酶體[13]；NK 細胞在與易感性靶細胞接觸后分泌干擾素-γ（IFN-γ），IFN-γ 可增強NK 細胞的細胞毒性。黃崇剛等[14]認為手足口病患兒存在NK 細胞穿孔素表達過高，危重型組、重癥組、普通型組患兒NK 細胞數低于對照組，其中危重型組、重癥組低于普通型組，穿孔素、顆粒酶B 反之，差異具有統計學意義（P＜0.05）。然而姜濤等[15]研究則認為普通型手足口病組和重型手足口病組急性期比較，NK細胞穿孔素和顆粒酶B差異均無統計學意義（P＞0.05）；重型組EV71 手足口病恢復期患兒較急性期明顯升高（P＜0.05）；普通型組EV71 手足口病恢復期患兒較急性期雖稍升高，但差異仍無統計學意義（P＞0.05）。在HBV 相關性失代償期肝硬化（HBV-DLC）患者NK 細胞（包括CD56dimNK 和CD56brightNK 細胞）的功能特性的研究中提示[16]HCs 和HBV-CLC 患者相比，HBV-DLC 患者循環CD56brightNK 細胞頻率明顯升高，而循環CD56dimNK 細胞明顯降低。HBV-DLC 患者外周活化的CD56brightNK 細胞可能表達較低水平的抑制性受體CD158b1/2 和較高水平的活化受體NKG2D，其穿孔素和顆粒酶A/B 的表達也較HCs 明顯增加，提示HBV-DLC患者外周CD56brightNK細胞具有較高的免疫激活狀態。在HBV-DLC患者中，循環CD56dimNK細胞中CD107a 和穿孔素的表達與細胞溶解能力呈正相關，而循環CD56dimNK細胞中CD107a和穿孔素的表達顯著降低，提示循環CD56dim NK 細胞的溶解能力受損。此外，我們還發現循環CD56dimNK細胞穿孔素表達與HBV-DLC 患者的Child-pugh 分級呈負相關。實驗組中分泌IFN-γ 細胞數（SFU）較健康對照組增高（F= 25.413，P＜0.01）。登革熱患者NK 細胞內穿孔素和顆粒酶B 的表達水平發生顯著上調，細胞脫顆粒水平也顯著增加[17]；同時表達穿孔素或顆粒酶B 的NK 細胞比例顯著高于CD8+T 細胞。布魯菌病患者血清中的IgG 抗體、穿孔素和顆粒酶B的濃度也增加（F=13.653，P＜0.01）[18]。本研究中急性布魯菌病患者，即（SAT1：100+～++++）患者組外周血NK細胞穿孔素蛋白的表達率與RBPT（-）、SAT（-）組比較有顯著下降。