局部應用增生平水相提取物對實驗性口腔癌預防作用的研究*

張紅利，馬兆峰，王嘉祺，孫正，關曉兵

口腔癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，其中部分由潛在惡性病變如口腔白斑和紅斑發展而來[1]。而白斑和紅斑在組織病理學上通常伴有不同程度的上皮異常增生，這也是口腔黏膜癌前病變最基本的特征，是由正常上皮細胞向癌細胞轉化的過渡階段[2]。如果能在這個階段使用藥物抑制口腔腫瘤的發生發展，即利用天然或合成的化合物阻斷、逆轉或延遲浸潤性癌的發生達到癌癥的化學預防作用[3]，這將是很值得研究的。

“增生平”是由山豆根、拳參、敗醬草、白鮮皮、夏枯草、黃藥子六味中藥組成的中成藥制劑。最初應用于食管癌高發地區河南省林縣、河北省磁縣的食管癌前病變的阻斷治療并取得顯著療效，經臨床觀察證實服用增生平3～5 年，可使食管癌前病變（重增）的人群食管癌發生率下降50%左右，有效控制了食管癌的發生[4]。

本團隊一直致力于研究增生平對口腔癌的化學預防作用，在DMBA 誘導的金黃地鼠頰癌模型中，增生平灌胃組顯著降低了腫瘤數目及體積，抑制了口腔癌的發生，同時在4-硝基喹啉-1- 氧化物(4NQO) 誘導的小鼠舌癌模型中，增生平(10%膳食)也顯著降低了舌癌的發生率，由55.2% 降至22.2%。此外，在一項針對口腔白斑患者的隨機臨床試驗中，ZSP 口服組與安慰劑組相比顯著降低了口腔病變的大小，動物實驗和臨床實驗中都證實增生平對口腔癌有很好的化學預防作用[5]。然而，長期口服使用增生平可能會引起嚴重肝毒性[6]?？紤]到口腔解剖位置特殊，利于局部給藥，因此，將增生平改為局部用藥，可以提高用藥的有效性、安全性，減少藥物的用量，更加有利于藥物的治療效果。我們根據增生平的化學成分進行提取、分析，保留藥物的有效成分，去除毒性部分，得到四種提取物甲醇相（methanol fraction），丁醇相（n-butanol fraction），水相（water fraction），乙酸乙酯相（ethyl acetate fraction），通過動物實驗發現丁醇相（n-butanol fraction）（4g/100ml）和 水相（water fraction）（1.4g/100ml），在口腔癌組織中具有抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，腫瘤體積分別減少32.6%和22.9%[7]。本研究目的是為進一步證實局部應用低濃度增生平水相提取物對口腔癌依然具有良好的化學預防作用，以期獲得作用大、毒性小的口腔癌化學預防藥物。

1 實驗與方法

1.1 動物模型的建立 本研究已通過首都醫科大學附屬北京口腔醫院實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：KQYY-2012030301）。購入130 只雄性金黃地鼠（6～8 周齡、平均體重135 g），常規飼養1 周后隨機分為5 組。按照從增生平原藥中提取出的不同成分（甲醇相、丁醇相、水相、乙酸乙酯相）的比例，提取物水相原始濃度為1.4g/100 ml，進行動物實驗證實水相提取物（1.4g/100 ml），在口腔癌組織中具有抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，基于此劑量，我們依次降低水相提取物濃度，設置局部應用增生平水相提取物低劑量組（0.35g/100 ml），中劑量組（0.7g/100 ml），高劑量組（1.4g/100 ml）各30只，陰性對照組10 只，陽性對照組30 只。陰性對照組不做任何處理，其余各組0.5% DMBA 溶液涂于地鼠左側頰囊，每周3 次，連續涂6 周后陽性對照組不再做處理，低、中、高劑量組涂抹相應濃度的增生平水相提取物18 周。DMBA 誘導的地鼠頰囊口腔癌模型是經典的動物模型，一般在6 周時就會出現輕、中、重度異常增生（癌前病變）及原位癌（鱗癌的早期階段）的病理表現[8-9]，而本實驗的設計目的是研究藥物在癌癥發生的早期階段的阻斷作用，即癌癥的化學預防作用，因此設計在6 周后進行藥物干預。

在實驗結束24 周時，斷髓處死動物，取左側頰囊組織，首先觀察并記錄頰囊組織標本的損害狀態，然后沿長軸縱向分割成兩部分，一部分固定在10%的福爾馬林溶液中，用于HE 染色及免疫組織化學染色；另一部分置于-80 度低溫冰箱中保存，用于western blotting 的檢測。

1.2 口腔腫瘤發生情況 實驗結束后處死動物，記錄各組腫瘤發生情況、腫瘤數目及每個腫瘤的長、寬、高，取其平均值作為腫瘤半徑（r），計算各組平均瘤體積（瘤體積=4/3πr3，單位mm）

1.3 組織病理學觀察 頰囊組織固定于10%中性福爾馬林24 h 后取出，卷成筒狀，自動脫水機脫水，分切成5-6 mm 長的條狀，石蠟包埋，每個樣品切25 張4 um 切片，取第1、10、25 張進行HE染色，光鏡下觀察病理改變，并記錄不同病變數目。病理改變分為口腔黏膜上皮單純增生、輕-中度異常增生、重度異常增生-原位癌和浸潤癌。上皮異常增生參照世界衛生組織（WHO）（2005）分類標準進行診斷[10]。

1.4 細胞增殖指數分析 實驗結束動物處死前2 h 腹腔注射50 mg/kg 的5-氟脫氧尿嘧啶（BrdU，Sigma-aldrich 公司，美國）采用免疫組化Envision二步法檢測，在第2、9、24 張玻片上隨機選取正常黏膜、輕-中度異常增生，重度異常增生-原位癌和浸潤癌中的4 個區域，400 倍顯微鏡計數陽性細胞數，作為BrdU 增殖指數即細胞增殖指數。

1.5 Bcl-2 蛋白表達的分析 利用western blotting檢測低溫冷凍保存的地鼠頰囊組織Bcl-2 蛋白的表達，將剪碎的組織裂解搖勻，4℃，13 000 rcf，離心10 min。取上清，上清即為總蛋白。用BCA 法計算蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳濕轉的方法完成蛋白轉運，用β-actin 作為內參蛋白完成抗原封閉及抗體雜交，用化學發光法檢測PVDF 膜上陽性信號制成膠片，將膠片掃描成圖像文件，用Gel-Doc 凝膠成像系統，通過Image J 圖形分析軟件計算單位光密度值和條帶面積，將各實驗點的總光密度值與內參比較，得到相對灰度值。

1.6 統計學分析 應用SPSS18.0 for windows 統計進行統計分析，數據用mean±SD 表示，檢驗以a=0.05 作為檢驗水準。

（1）采用秩和檢驗（Rank-Sum Test）進行不同組間平均瘤數目及平均瘤體積比較。（2）采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗BrdU 增殖指數，LSD 兩兩比較。（3）采用單因素方差分析Bcl-2 蛋白的表達灰度值差異。

2 結 果

2.1 口腔黏膜腫瘤發生率及組織病理學分析 正常金黃地鼠頰黏膜為淡粉色、光滑、菲薄、有彈性，黏膜下血管清晰可見。實驗第1 周至第6 周涂0.5%DMBA 期間，地鼠頰囊黏膜炎癥明顯，伴出血化膿。6 周以后，地鼠頰囊黏膜炎癥逐漸加重，部分地鼠頰囊可見增生物，為球形、乳頭狀或菜花狀，有蒂或無蒂，表面充血或有膿性分泌物，呈紅黃色相間狀，其中陽性對照組炎癥明顯比各用藥組嚴重，用藥組頰囊瘢痕攣縮明顯(圖1)。

圖1 腫瘤大體觀察情況

高劑量組和中劑量組肉眼腫瘤發生率由88.9%（陽性對照組）分別下降為78.9% 和83.3% (表1)。高劑量組顯著降低了上皮單純增生病灶數目（P ＜0.05）；低、中、高劑量組顯著降低了輕-中度異常增生的病灶數目（P ＜0.05）(表2、圖2)。

表1 腫瘤發生情況

表2 病理結果

圖2 病理結果

2.2 細胞增殖指數 低、中、高劑量組的細胞增殖指數在癌旁正常黏膜和輕-中度異常增生中與陽性對照組相比有非常顯著差異（P ＜0.01)，且中劑量組與高劑量組組間具有非常顯著性差異（P ＜0.01)。在浸潤癌中，中、高劑量組與陽性對照組相比具有顯著性差異（P ＜0.05)(表3，圖3)。

表3 細胞增殖指數

圖3 BrdU 增殖指數免疫組化結果（×400）

2.3 Bcl-2 蛋白表達水平 低、中、高劑量組Bcl-2蛋白的表達較陽性對照組依次降低，中劑量組與陽性對照組相比，有顯著性差異（P ＜0.05)；高劑量組與陽性對照組相比，有非常顯著差異（P＜0.01)(圖4)。

圖4 Bcl-2 蛋白表達水平

3 討 論

增生平是一種傳統中藥，通過對其藥理研究發現，增生平有調節免疫反應，抑制炎癥細胞因子的產生和抑制食管上皮腫瘤發生的作用[11]。這與我們的研究結果是一致的，各用藥組在整個過程中炎癥反應明顯較陽性對照組輕，進一步證實了增生平的抗炎作用。此外，之前的實驗發現，環氧化酶或5-脂氧合酶抑制劑作為抗炎劑，通過抑制異常的花生四烯酸代謝，阻止口腔鱗狀細胞癌的發生發展[12-13]。那么增生平水相提取物的抗癌作用是否也是由此通路實現，還需要進一步研究。

肉眼觀察結果中，與陽性對照組比較，中劑量組及高劑量組肉眼腫瘤發生率由88.9%（陽性對照組）分別下降為83.3%和78.9%，雖無統計學差異，但提示增生平水相提取物的局部應用對腫瘤的發生是有抑制作用，并且有一定的劑量依賴性，濃度越大，作用越明顯。而前期動物實驗多為將增生平進行地鼠頰癌模型灌胃或在小鼠舌癌模型中加入10%膳食[5]，這些模型可認為是口服給藥的一種模式，而本實驗考慮口腔解剖位置特點，設為局部給藥，創新了增生平用藥的方法并證實可行有效，為后續藥物轉化奠定了基礎。

病理結果顯示，高劑量組顯著降低了上皮單純增生病灶數目（P ＜0.05）；低、中、高劑量組顯著降低了輕-中異常增生的病灶數目（P ＜0.05）。從結果上可以看出，增生平水相提取物對單純增生及輕-中度異常增生的作用較明顯，也就是癌癥發生的早期階段，這也正是化學預防藥物作用的適宜階段。

在化學致癌的過程中，細胞增殖被認為可以促進腫瘤發生的啟動階段，并且在腫瘤的促進因子和非基因毒性的致癌物中發揮了重要作用[14]。由于不同部位的癌前損害是以細胞過度增殖為特征的，并且隨著異常增生的程度而加重，因此，細胞增殖標記物有助于評價口腔癌前病變的程度和類型以及組織癌變的情況[15]。BrdU 是一種人工合成的核酸前體，是胸腺嘧啶類似物，可以被處于S期的細胞亞群經由核酸旁路攝取，代替胸腺嘧啶整合入新合成的DNA 單鏈之中，因而檢測BrdU的陽性細胞率能反映組織細胞的增殖情況。由于BrdU 特異性的反映S 期細胞的活躍程度，因而對評價組織細胞的癌變潛力及預后也有重要的參考意義[16]。本項研究中通過對地鼠頰囊標本中BrdU的陽性細胞率的測定，發現隨著組織病損惡性程度的增加，BrdU 的陽性細胞率明顯增加，這就代表細胞增殖在相應增加，提示細胞的異常增殖與口腔癌的發生發展密切相關。

2004 年美國的一項體內研究實驗提示增生平是一種有效的肺癌化學預防藥物，可能是通過抑制細胞增殖、增加細胞凋亡或兩者兼有達到預防效果[17]。本實驗BrdU 增殖指數結果說明增生平提取物水相在癌癥發生早期階段發揮主要作用，可能也是通過遏制細胞的過度增殖，阻斷腫瘤的發生。不同濃度之間的作用效果也不同，說明增生平提取物水相對細胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性。

腫瘤的發展是由于細胞的增殖和凋亡之間的平衡被打破。2012 年美國的一項研究發現ZSP 在體外抑制腦腫瘤生長，部分原因是通過誘導細胞凋亡完成[18]。Bcl-2 不僅是癌基因，也是重要的細胞凋亡調節劑，它可以保護細胞拮抗凋亡。Bcl-2的升高可以使腫瘤細胞繞過生理性凋亡的正常調控機制，并且使這些細胞更進一步地產生基因的改變，如c-myc 的擴增、p53 的突變或激活其它的癌基因，從而使腫瘤的侵犯性進一步增加[19-20]。

本次實驗利用western blotting 檢測Bcl-2 蛋白的表達，結果顯示增生平提取物水相中、高劑量組明顯的抑制了Bcl-2 蛋白的表達，Bcl-2 蛋白表達的下調可以促進細胞凋亡，從而抑制口腔癌的發生和發展。在低劑量組中，Bcl-2 蛋白表達也有所下降，且與中劑量組極為接近，說明增生平提取物水相可以抑制Bcl-2 蛋白的表達，從而促進癌細胞的凋亡，并且呈劑量依賴性，劑量越高，效果越明顯。

本實驗創新了增生平在實驗性口腔癌中應用方法，證實局部應用增生平水相提取物對口腔癌有一定的化學預防作用，但也存在很多局限性，因為在實驗中我們更多的關注于癌變組織發生的病理變化，那么癌旁正常組織細胞的增殖和凋亡是否會因為藥物的影響而發生改變呢，就需要我們進一步的研究。同時本實驗基于前期動物實驗結果，在增生平水相提取物原始濃度（1.4g /100ml）的基礎上直接按二分法下調藥物濃度設置分組，未進行有效濃度的梯度篩選也是本實驗的一個很大的不足，在后續實驗中，應增加濃度篩選過程，細化實驗分組，最終篩選出最佳有效濃度。

4 結 論

局部應用增生平水相提取物能夠通過抑制細胞增殖以及促進細胞凋亡來發揮腫瘤的化學預防作用，在口腔癌促癌及進展階段時這種化學預防效果最為顯著且呈一定的劑量依賴性。