纖維素酶酶解法提取荷葉堿的工藝優化

李詩虹 陳秋如 楊志堅 陳凌華

摘 要： 為優化纖維素酶酶解法提取荷葉堿的工藝條件，采用單因素試驗和正交試驗相結合的方法，考察纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間和液料比等因素對荷葉堿提取率的影響，得到纖維素酶提取荷葉堿的最佳工藝條件為：纖維素酶添加量2.3 ?mg·g ?-1 ?，酶解溫度50℃，酶解時間55 min，液料比（mL/g）30 ?∶ 1；在此條件下，荷葉堿的提取率可高達0.67%。研究結果可為后續荷葉堿的開發利用提供了積極參考價值。

關鍵詞： 荷葉堿；纖維素酶酶解法；提??；工藝優化

中圖分類號： TS 201 ???文獻標志碼： A ???文章編號： 0253-2301（2023）05-0037-05

DOI： ?10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.05.006

Process Optimization of the Extraction of Nuciferine by Cellulase Enzymatic Hydrolysis

LI Shi-hong 1， CHEN Qiu-ru 1， YANG Zhi-jian 2， CHEN Ling-hua ?1*

（1. Jinshan College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China;

2. College of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： ?In order to optimize the process conditions of extracting the nuciferine in lotus leaves by cellulase enzymatic hydrolysis， the effects of the adding amount of cellulase， enzymatic temperature， enzymatic time and the ratio of liquor to material on the extraction rate of nuciferine in lotus leaves were investigated by using the method of combining the single factor test and orthogonal test. The best technological conditions for the extraction of nuciferine in lotus leaves by cellulase were as follows： the adding amount of cellulase was ?2.3 ??mg·g ?-1 ?， the enzymatic temperature was 50℃， the enzymatic time was 55 min， and the ratio of liquor to material （mL/g） was ?30 ?∶ 1. ??Under these conditions， the extraction rate of nuciferine in lotus leaves could be as high as ?0.67 %. The research results could provide positive reference value for the subsequent development and utilization of nuciferine in lotus leaves.

Key words： ?Nuciferine； Cellulase enzymatic hydrolysis； Extraction； Process optimization

荷葉為睡蓮科植物蓮 Nelumbo nucifera ?Gaertn.的干燥葉，自古就有“清熱解暑、去脂瘦身”的美譽。荷葉藥食兩用，荷葉堿作為荷葉主要活性成分，具有降脂降糖 ?[1-2] 、抗腫瘤 ?[3] 、抑菌、抗病毒 ?[4] 等藥理作用，并作為荷葉質量控制指標收錄于中國藥典（2020 年版）。我國擁有豐富的荷葉原料資源，有低廉的生產成本和極高的產量，但利用率卻很低，大部分被廢棄于池塘，給環境保護和經濟建設造成極大浪費。隨著健康中國的推進實施，以荷葉堿為代表的植物活性物質已成為人們關注熱點。高效便捷提取荷葉活性物質荷葉堿，將其應用于食藥保健或學術研究等方面，將具有積極的實踐意義。

目前荷葉堿的提取方法主要有加熱回流法 ?[5] 、索氏提取法 ?[6] 、超聲波法 ?[7] 、微波法 ?[8] 、酶解法 ?[9] 等。根據荷葉堿易溶于有機溶劑以及酸性介質，常用的浸提劑有乙醇、甲醇、氯仿、HCl水溶液 ?[10-11] 等，但這些浸提劑原液一般有刺激氣味。為高效便捷安全、且能最大程度維持荷葉堿的藥理活性，本研究在檸檬酸緩沖溶液的酸性介質中，探索纖維素酶酶解法提取荷葉堿的工藝條件。檸檬酸緩沖溶液常用于食品生產，安全性高。纖維素酶酶解法反應條件溫和、通過破壞荷葉細胞壁，有效促進活性內溶物的釋放。本研究采用正交試驗，優化了影響荷葉堿提取的纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間和液料比等因素，為后續荷葉堿的開發利用提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河北省雄安縣的干荷葉（市購）；荷葉堿標準品、纖維素酶（400 ?μ·mg ?-1 ?）、檸檬酸（分析純）、檸檬酸鈉（分析純），購自福州鼎國生物技術有限公司。

1.2 儀器

數顯恒溫水浴鍋（群安實驗儀器有限公司）；紫外可見分光光度計752N（上海儀電分析儀器有限公司）； PHS 3C 酸度計（上海雷磁有限公司）；島津AUY120電子天平（島津國際貿易上海有限公司）；拜杰多功能 BJ 150 型粉碎機（德清拜杰電器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 荷葉堿標準曲線的測定 ??稱取荷葉堿標準品10 mg，用pH=5檸檬酸緩沖溶液定容至25 mL，得到400 ?μg·mL ?-1 ?儲備液。移取5 mL儲備液定容于 50 mL 容量瓶，得到40 ?μg·mL ?-1 ?標準母液；吸取0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 mL的標準母液，用檸檬酸緩沖溶液定容于25 mL容量瓶，配成不同濃度的荷葉堿標準溶液。用紫外分光光度計于200～400 nm掃描，測定出荷葉堿標準品的最大吸收波長，然后在測得的最大吸收波長處，測定各濃度的荷葉堿標準溶液的吸光度，繪制標準曲線。

1.3.2 荷葉堿提取率的計算方法

荷葉堿的提取率 ?[10] = ?（c×v×n） m ?×100%

式中： c 為荷葉堿濃度，μg·mL ?-1 ； V 為樣液體積，mL； n 為提取液的稀釋倍數； m 為樣品質量，g。

1.3.3 荷葉堿提取的工藝流程 ??結合前人研究 ?[9，12-13] ，并考慮纖維素酶適宜pH范圍，擬定本試驗操作流程：稱取經干燥、過100目篩的干荷葉粉1 g→液料比（mL/g）30 ?∶ 1加入檸檬酸緩沖溶液→纖維素酶2 mg→50℃水浴60 min→室溫冷卻→離心取上層清液1 mL，加檸檬酸緩沖溶液定容于100 mL容量瓶→分光光度法測定荷葉堿含量。

1.3.4 荷葉堿提取的單因素試驗設計 ??在1.3.3工藝流程基礎上，考察以下4個單因素的不同水平對荷葉堿提取率影響。（1）酶添加量：固定酶解溫度50℃，酶解時間60 min，液料比30 ?∶ 1（mL/g），考察不同纖維素酶用量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ?mg·g ?-1 ?）對荷葉堿提取率的影響。（2）酶解溫度：固定酶解時間60 min，液料比30 ?∶ 1（mL/g），酶用量2.0 ?mg·g ?-1 ?，考察不同酶解溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）對荷葉堿提取率的影響。（3）酶解時間：固定酶解溫度50℃，液料比30 ?∶ 1（mL/g），酶用量2.0 ?mg·g ?-1 ?，考察不同酶解時間（20、30、40、50、60、70、80 min）對荷葉堿提取率的影響。（4）液料比：固定酶解溫度50℃，固定酶解時間60 min，酶用量2.0 ?mg·g ?-1 ?，考察不同液料比（10 ?∶ 1、20 ?∶ 1、30 ?∶ 1、40 ?∶ 1、50 ?∶ 1）對荷葉堿提取率的影響。

1.3.5 荷葉堿提取的正交試驗設計 ??根據單因素試驗結果，設計四因素三水平正交試驗考察酶添加量、酶解溫度、酶解時間和液料比對荷葉堿提取率的影響（表1）。

2 結果與分析

2.1 荷葉堿標準曲線繪制

由圖1可知，在270 nm處荷葉堿有最大吸收峰，故后續試驗選用270 nm作為測定波長。通過測定各荷葉堿標準溶液的吸光度，得到荷葉堿的標準曲線回歸方程（圖2）： y= 0.049：1 x- 0.012：8 ?（y 為提取液的吸光度A， x 為提取液的濃度）；其相關系數 R 2 為 0.997：6 ，線性關系良好。

2.2 荷葉堿提取的單因素試驗結果

2.2.1 酶添加量對荷葉堿提取率的影響 ??由圖3可知，荷葉堿提取率隨著纖維素酶添加量的增大而增大，當纖維素酶添加量為2.5 ?mg·g ?-1 ?時，荷葉堿提取率達到最大，其后隨著纖維素酶添加量的增加，提取率有所降低。當纖維素酶添加量低于2.5 ?mg·g ?-1 ?時，纖維素酶的增加使其對荷葉細胞壁的降解作用加劇，有利荷葉堿的溶出釋放，所以荷葉堿的提取率會逐漸升高；當纖維素酶與底物的反應達到飽和狀態時，荷葉堿提取率達到高峰；隨后由于底物濃度不變，酶量的增加導致酶產生競爭性抑制，使酶促反應效率下降，荷葉堿提取率也略微降低。因此，選取2.3、2.5、2.7 ?mg·g ?-1 ??作為正交試驗中纖維素酶添加量的3個試驗水平。

2.2.2 酶解溫度對荷葉堿提取率的影響 ??由圖4可知，纖維素酶的最適溫度為50℃，當溫度低于或高于50℃，酶的反應活性均未達到最大值，荷葉堿的提取率均低于50℃的提取率。低溫時（T<50℃），酶活性隨溫度升高而提高；但過高溫度 （T> 50℃）會引起酶蛋白變性，導致提取率下降。故選擇45℃、50℃、55℃作為正交試驗中酶解溫度的3個試驗水平。

2.2.3 酶解時間對荷葉堿提取率的影響 ??由圖5可知，荷葉堿提取率在酶解時間60 min時最高，這也是酶促反應的最佳時間。酶促反應需要有個時間過程，使酶與底物充分接觸反應，因此酶促時間在60 min 之前，提取率隨著酶促反應的趨于完全而不斷提升；由于酶活性對時間有依賴性 ?[14] ，酶解時間大于60 min后，隨后時間的增加，酶的催化活性下降，提取率有所降低。故選擇55、60、65 min作為正交試驗中酶解時間的3個試驗水平。

2.2.4 液料比對荷葉堿提取率的影響 ??由圖6可知，當液料比小于30 ?∶ 1時，由于荷葉干粉的量較多，該比例下所能溶出的有效成分是有限的，存在剩余物料利用不完全的情況，溶劑不夠會導致提取不完全；這時隨著溶劑的增加，溶出的有效成分也隨之增加。當液料比等于30 ?∶ 1時，提取率最高。當液料比大于30 ?∶ 1時，過大的液料比降低了提取液的 濃度，導致荷葉堿提取率下降。故選取25 ?∶ 1、30 ?∶ 1、35 ?∶ 1作為正交試驗液料比的3個試驗水平。

2.3 正交試驗結果

由表2可知，影響荷葉堿提取率的因素順序為C（酶解時間）＞B（酶添加量）＞A （酶解溫度）＞ D（液料比）。其中，酶添加量、酶解時間、酶解溫度這3個因素對荷葉堿提取率影響極顯著，液料比對荷葉堿提取率影響顯著（表3）。正交試驗結果分析顯示，荷葉堿提取的最佳表現組合為A 2B 1C 1D 2。按照此優化后得到的提取條件，再次進行荷葉堿的測定，測得荷葉堿提取率為0.67%。

3 結論

本研究在檸檬酸緩沖溶液的酸性介質中，研究纖維素酶酶解法提取荷葉堿的最佳工藝。纖維素酶酶解法提取荷葉堿，能有效保持荷葉堿的生理活性；提取適宜的酸度條件由食品加工生產中常見的檸檬酸緩沖溶液提供，較一般的鹽酸、硫酸或醋酸更加的穩定安全，維持溶液pH值效果好。通過正交試驗獲得纖維素酶提取荷葉堿最優條件為酶解時間55 min、酶添加量2.3 ?mg·g ?-1 ?、酶解溫度55℃、液料比30 ?∶ 1（g ?∶ mL），得到的荷葉堿提取率為0.67 %。該提取方法提取效率高、操作簡便易行且安全、對試驗條件要求不高，可為后續以荷葉堿為代表的食藥功能產品的開發利用提供積極參考價值。

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（責任編輯：柯文輝）