光強和鹽度對龍須菜生長及光合特性的影響

王津果,陳澤宇,石夢琪,倪嘉璇,武 卉,蔣書英,黃晶晶,王靜文,周 偉*

(1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院、江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室、自然資源部濱海鹽沼濕地生態與資源重點實驗室、江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇 連云港 222005;2.連江羅源灣金牌漁業科技有限公司,福建 福州 350512)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)是一種重要的產瓊膠海藻,其生長迅速,可用于多營養層次綜合養殖和海洋牧場生態系統的構建,兼具經濟效益和生態效益[1]。截止目前,龍須菜年產量高達398 920 t,栽培面積11 634 hm2,僅次于海帶,成為國內第二大栽培藻類,并呈上升的趨勢[2]。數據進一步表明,福建省龍須菜產量為308 933 t,栽培面積10 062 hm2,占全國總量的77.44%[2],成為我國栽培的主產地。福建省屬于亞熱帶季風氣候,沿海海域秋冬季節適宜龍須菜生長,其產量穩定,但隨著春季尤其是梅雨季節的到來,降雨量、海水表層鹽度、光照強度等逐漸變化,影響龍須菜生長,導致其產量的劇烈波動,引發龍須菜產量區域化差異嚴重,不利于地方藻類栽培產業的健康發展。

環境條件是影響大型海藻生物量累積的重要非生物因素,鹽度和光照強度是其中的兩個關鍵因素。近岸海水表層鹽度一般在30～35之間,易受降水或淡水涌入的影響而降低。大量研究表明,低鹽會影響大型海藻的生長和生理生化指標[3-6]。例如,25鹽度處理對長型龍須菜(Gracilariopsislongissima)的生長速率及葉綠素a、類胡蘿卜素和藻紅蛋白含量無顯著影響,但抑制藻藍蛋白合成[7];25鹽度培養條件下,龍須菜的生長速率最高,15鹽度環境下其生長速率和光合速率下降,暗呼吸速率上升[8];26.98鹽度培養條件下,江蘺屬(Gracilaria)藻類瓊膠、葉綠素a、胡蘿卜素和蛋白質的含量顯著增加,其含水率、碳水化合物、脂肪和灰分含量無明顯變化[9];24、28鹽度處理促進綠藻強壯硬毛藻(Chaetomorphavalid)的特定生長率,對其最大光合量子產率無顯著影響[10];24.84鹽度處理條件下,褐藻半葉馬尾藻(Sargassumhemiphyllum)幼苗的藻體質量增長率和光合色素含量最高,17.01、19.62鹽度處理使藻體質量增長率和光合色素含量顯著下降[11];10鹽度處理促進了綠藻滸苔(Ulvaprolifera)葉綠素a和葉綠素b的合成,對其最大光合量子產率無顯著影響[12]。由此可見,大型海藻對低鹽的響應機制存在明顯的種間差異。光照強度易受到水深、日照長短、季節等的影響,對于藻類的生長和光合作用至關重要,影響大型海藻的生長速率、光合活性、色素合成等生物過程[13-16]。前人大量研究表明,低光照強度使大型海藻的生長受到抑制,光合色素含量呈現降低[17]、升高[18-19,20-21]或不受影響[22]等不同特征。另外,低光條件下,褐藻裙帶菜(Undariapinnatifida)的最大光合量子產率、電子傳遞速率升高[19],龍須菜的最大光合量子產率等熒光參數升高[22],繩狀龍須菜(Gracilariachorda)的光合速率降低[23],緣管滸苔(Ulvalinza)的凈光合速率和最大光合量子產率下降[20],滸苔的凈光合速率和呼吸速率下降[21],表明低光對大型海藻光合作用的影響具有種屬特異性。

目前已有大量關于龍須菜響應非生物因素如光照強度和鹽度變化的研究[9,22,24-26],但關于二者耦合作用的研究鮮有報道。另外,近年來受梅雨季節影響,南方栽培龍須菜的產量呈現大幅度波動狀態,這與周邊環境因素的變化有著潛在密切關系,其中降雨直接導致的光照強度和表層鹽度變化最為明顯。因此,有必要研究不同光照強度和鹽度處理條件下龍須菜的生長、葉綠素熒光參數和光合色素含量變化,以期揭示南方梅雨季節栽培龍須菜產量不穩定的原因,為南方梅雨季節龍須菜的栽培提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料及培養條件

龍須菜隨機采自福建省連江縣羅源灣海域養殖筏架(26°25′N,119°41′E),低溫避光保存帶回實驗室,用過濾海水沖洗掉藻體表面的附生生物和泥沙,挑選顏色鮮紅、雜藻附生少的藻體,剪成2～3 cm的小段,置于含Pro培養基[27]的滅菌海水中,在溫度為20 ℃、光照強度為120 μmol/(m2·s)、光周期為12 L∶12 D的智能光照培養箱(GXZ-500C,寧波江南儀器廠)中預培養1周。

1.2 實驗設計

實驗選取光照強度和鹽度兩個環境因子,根據梅雨季龍須菜栽培海域實際監測數據,將光強設置低光(lower light intensity,LL)30 μmol/(m2·s)和高光(higher light intensity,HL)120 μmol/(m2·s)兩個水平,每個光照強度水平下設置低鹽(lower salinity,LS)16、中鹽(medium salinity,MS)24(即鹽度適當降低)、高鹽(higher salinity,HS)32三個鹽度梯度,共6個光照強度和鹽度組合(LLLS、LLMS、LLHS、HLLS、HLMS、HLHS),每個組合設3個平行樣。將(0.20±0.01)g藻體置于含Pro培養基滅菌海水的500 mL培養瓶中,在溫度20 ℃、光周期為12 L∶12 D的智能光照培養箱中培養,每兩天更換1次培養液。

以HLHS處理組為對照。通過在培養瓶外部遮蓋不同層數的中性網來實現120 μmol/(m2·s)和30 μmol/(m2·s)水平的光照強度。根據不同比例混合海水和雙蒸水來配制16、24、32鹽度水平的海水。光照強度的測定采用光合有效輻射測量儀(QSL-2100,美國Biospherical公司),海水鹽度的測定采用手持式折光儀(LS10T,廣州市銘睿電子科技有限公司)。

1.3 相對生長速率的測定

每兩天測定1次6個處理組龍須菜的質量。稱重前,利用吸水紙將藻體表面的水分輕輕吸干,吸水紙的層數和吸水的時間盡量保持一致。每次稱量由同一人操作,以減少操作誤差,同時為減少對藻體生理活性的損傷,盡量縮短其干露時長[28]。根據下列公式計算藻體的相對生長速率(relative growth rate,RGR,單位為%/d)：

RGR=100×[ln(Wt/W0)]/t

(1)

式(1)中：Wt是第t天藻體質量(g),W0是藻體最開始的質量(g),t是藻體的培養天數(d)。

1.4 葉綠素熒光參數的測定

利用手持式PAM葉綠素熒光儀(AquaPen AP 100,捷克PSI公司)測定6個處理組龍須菜的葉綠素熒光參數。將樣品暗處理15 min后,置于培養光強下測定其有效光合量子產率[Y(II)]。在8個光化光強[0、10、20、50、100、200、500、1 000 μmol/(m2·s)]下測定快速光響應曲線(rapid light curve,RLC),快速光響應曲線根據Eilers等[29]的光強與相對電子傳遞速率關系進行擬合,計算公式如下：

rETR=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

(2)

式(2)中：rETR是藻體的相對電子傳遞速率,PAR是設置的光化光強[μmol/(m2·s)],a、b、c是擬合參數。

根據下列公式計算藻體的最大相對電子傳遞速率(rETRmax)、光能利用效率(α)和飽和光強[Ek,單位為μmol/(m2·s)]：

rETRmax=1/[b+2(a×c)1/2]

(3)

α=1/c

(4)

Ek=rETRmax/α

(5)

1.5 凈光合速率和呼吸速率的測定

利用液相氧電極(YSI 5300A,美國YSI公司)測定6個處理組龍須菜的凈光合速率和呼吸速率。稱重前,使用刀片將藻體切成長度約1 cm的藻段,為降低機械損傷,將其置于培養條件下1 h以上。隨后稱取0.1 g左右的藻體,將其放入反應槽中,其中含有8 mL培養基。使用恒溫循環器(DHX-2005,南京先歐儀器制造有限公司)將反應槽中培養基的溫度控制在20 ℃。待暗適應20 min之后,在黑暗條件下記錄反應槽中O2濃度變化,即呼吸速率[Rd,單位為μmol/(g·h)]。通過調整提供外源光照強度的鹵素燈與反應槽間距離,獲得培養光照強度,記錄反應槽中O2濃度變化,即凈光合速率[Pn,單位為μmol/(g·h)]。

1.6 色素含量的測定

稱取0.05 g左右龍須菜置于5 mL無水乙醇中,4 ℃暗處理24 h后,取上清液。利用分光光度計(Ultrospec 3300 pro,英國安瑪西亞公司)分別測定上清液在470、653、666 nm波長處的吸光值。根據下列公式計算葉綠素a、類胡蘿卜素的含量[30]：

CChl a=15.65×A666-7.53×A653

(6)

CCar=(1 000×A470+1 403.57×A666

-3 473.87×A653)/221

(7)

式(6)至(7)中：CChl a是葉綠素a含量(mg/g);CCar是類胡蘿卜素含量(mg/g);A470、A653、A666分別是470、653、666 nm波長處的吸光值。

采用機械研磨法測定藻紅蛋白的含量。稱取0.10 g藻體于研缽中充分研磨,轉移至含10 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH=6.8)的離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心15 min后,取上清液。利用分光光度計分別測定上清液在455、564、592 nm波長處的吸光值。藻紅蛋白含量的計算公式如下[31]：

CPE=[(A564-A592) -(A455-A592)×0.2]×0.12

(8)

式(8)中：CPE是藻紅蛋白的含量(mg/g);A592、A564、A455分別是592、564、455 nm波長處的吸光值。

1.7 數據統計及分析

所有數據用平均值±標準差(X±SD)表示。利用Origin 9.1與 SPSS 26.0分別對實驗數據進行作圖與統計分析。采用K-S、Levene檢驗先后對數據進行正態性、方差齊性分析。利用Turkey’s多重比較和單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理組間的統計學差異。利用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)檢驗光強和鹽度對龍須菜的RGR、Y(II)、rETRmax、α、Ek、Pn、Rd及葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白含量的交互作用。以P<0.05作為差異顯著性水平。

2 結果與討論

2.1 不同處理下相對生長速率變化

雙因素方差分析顯示,光照強度和鹽度對龍須菜的相對生長速率存在顯著影響,且二者交互作用顯著(P<0.05)(表1)。如圖1所示,在同一光強條件下,藻體相對生長速率隨著鹽度增加呈現出先升高后降低的趨勢,在鹽度適當降低培養條件下達到高值,分別為(8.19±0.76)%/d(LLMS)、(9.83±0.31)%/d(HLMS),比高鹽處理組分別提高10.38%(LLLS)、15.38%(HLLS),表明鹽度的適當降低促進龍須菜的生長;低鹽處理組的相對生長速率顯著低于高鹽處理組(P<0.05),降幅為51.89%(LLLS)、54.11%(HLLS),表明鹽度過低抑制龍須菜的生長。此外,在低鹽培養條件下,低光處理組與高光處理組間藻體的相對生長速率無顯著性差異(P>0.05);在鹽度適當降低、高鹽培養條件下,低光處理組藻體相對生長速率顯著低于高光處理組(P<0.05),降幅分別為16.68%、12.91%。

表1 光照強度和鹽度對龍須菜生長和光合參數影響的雙因素方差分析Tab.1 Two-way analysis of variance for the effects of light intensities and salinities on physiological parameters of G. lemaneiformis

2.2 不同處理下熒光參數變化

雙因素方差分析顯示,光照強度和鹽度對龍須菜的有效光合量子產率存在顯著影響,且二者交互作用顯著(P<0.05)(表1)。如圖2所示,在高光培養條件下：隨著鹽度增加,藻體的有效光合量子產率呈現出與相對生長速率相同的變化趨勢,即先升高后降低,在鹽度適當降低培養條件下達到最高值0.38±0.03,比低鹽處理組、高鹽處理組分別顯著提高153.33%、26.67%(P<0.05),表明高光條件下鹽度的適當降低提高龍須菜的有效光合量子產率。在低光培養條件下：藻體有效光合量子產率隨著鹽度增加而逐漸增加,在高鹽培養條件下達到高值0.32±0.03,顯著高于低鹽處理組(P<0.05),增幅為60.00%,與鹽度適當降低處理組無顯著差異(P>0.05)。此外,鹽度適當降低和正常鹽度培養條件下,低光處理組和高光處理組間藻體的有效光合量子產率無顯著影響(P>0.05);在低鹽培養條件下,低光處理組藻體有效光合量子產率顯著高于高光處理組(P<0.05),增幅為33.33%。

最大相對電子傳遞速率、光能利用效率、飽和光強由快速光響應曲線計算得出,如表2所示。雙因素方差分析顯示,光照強度和鹽度對龍須菜的最大相對電子傳遞速率、光能利用效率和飽和光強有顯著影響(P<0.05),二者交互作用顯著影響最大相對電子傳遞速率和飽和光強(P<0.05),對光能利用效率無顯著影響(P>0.05)(表1)。如表2所示,在同一光強條件下,藻體光能利用效率隨著鹽度增加呈現出先升高后降低的趨勢;在高光培養條件下,藻體最大相對電子傳遞速率和飽和光強隨著鹽度增加呈現出與光能利用效率相同的變化趨勢,先升高后降低;在低光培養條件下,隨著鹽度增加,最大相對電子傳遞速率逐漸降低,飽和光強先降低后升高。此外,在低鹽培養條件下,低光處理組的最大相對電子傳遞速率顯著高于高光處理組(P<0.05),增幅84.02%;低光處理組的光能利用效率顯著低于高光處理組(P<0.05),降幅50.00%。同一鹽度下,低光處理組藻體的飽和光強比高光處理組顯著提高306.85%(LLLS)、63.10%(LLMS)、112.01%(LLHS)(P<0.05)。

表2 不同處理下龍須菜的最大相對電子傳遞速率、光能利用效率和飽和光強Tab.2 Maximum rETR,light utilization efficiency and saturation irradiance of G. lemaneiformis under various light intensities and salinities

2.3 不同處理下凈光合速率和呼吸速率變化

鹽度、光強及二者交互作用顯著影響龍須菜的凈光合速率(P<0.05),鹽度顯著影響其呼吸速率(P<0.05),光照強度和二者交互作用對其呼吸速率無顯著影響(P>0.05)(表1)。如圖3(a)所示,在同一光強條件下,隨著鹽度增加,藻體凈光合速率呈現出與相對生長速率相同的變化趨勢,即先升高后降低,在鹽度適當降低培養條件下達到高值,分別為(22.80±0.54)μmol/(g·h)(LLMS)、(26.23±0.16)μmol/(g·h)(HLMS),比高鹽處理組分別提高11.49%、10.35%,表明鹽度的適當降低提高了龍須菜的凈光合速率;在同一光強條件下,低鹽處理組的凈光合速率顯著低于高鹽處理組(P<0.05),降幅為42.69%(LLLS)、43.79%(HLLS),表明鹽度過低使龍須菜的凈光合速率下降。此外,同一鹽度下,低光處理組藻體的凈光合速率顯著低于高光處理組(P<0.05),降幅為12.28%(LLLS)、13.08%(LLMS)、13.97%(LLHS),表明光照強度下降抑制了龍須菜的凈光合速率。

圖3 不同處理下龍須菜的凈光合速率和呼吸速率Fig.3 Net photosynthetic rate and respiratory rate of G. lemaneiformis under various light intensities and salinities

如圖3(b)所示,龍須菜的呼吸速率隨鹽度增加呈先降低后升高的變化趨勢,與凈光合速率相反,在低鹽培養條件下達到高值,分別為(27.75±1.20) μmol/(g·h)(LLLS)、(29.60±1.50 )μmol/(g·h)(HLLS),比高鹽處理組分別提高20.92%、28.19%;在同一光強條件下,鹽度適當降低處理組的呼吸速率顯著低于高鹽處理組(P<0.05),降幅為37.12%(LLMS)、33.78%(HLMS)。此外,同一鹽度下,龍須菜的呼吸速率在不同光照強度處理間無顯著變化(P>0.05)。

2.4 不同處理下光合色素含量變化

鹽度、光強及二者交互作用顯著影響龍須菜的葉綠素a含量,鹽度顯著影響其類胡蘿卜素含量,鹽度和二者交互作用顯著影響其藻紅蛋白含量(P<0.05)(表1)。如圖4(a)所示,在同一光強條件下,隨著鹽度增加,葉綠素a含量呈現出與相對生長速率相同的變化趨勢,即先升高后降低,在鹽度適當降低培養條件下達到高值,分別為(0.16±0.00) mg/g(LLMS)、(0.17±0.01) mg/g(HLMS),比高鹽處理組分別增加了11.36%、32.56%;在同一光強條件下,低鹽處理組的葉綠素a含量顯著低于高鹽處理組(P<0.05),降幅為46.15%(LLLS)、20.00%(HLLS)。此外,鹽度適當降低、高鹽處理組的葉綠素a含量在不同光照強度間存在顯著差異(P<0.05);低鹽處理組的葉綠素a含量在不同光強處理間差異不顯著(P>0.05)。如圖4(b)所示,類胡蘿卜素含量在不同處理組間無顯著變化(P>0.05)。如圖4(c)所示,藻紅蛋白含量隨著鹽度增加先升高后降低,與葉綠素a含量的變化趨勢相同,在鹽度適當降低培養條件下達到高值,分別為(0.57±0.04) mg/g(LLMS)、(0.70±0.05) mg/g(HLMS),比高鹽處理組分別增加32.56%、112.12%;在同一光強條件下,低鹽處理組的藻紅蛋白含量顯著低于高鹽處理組(P<0.05),降幅為60.47%(LLLS)、42.42%(HLLS)。此外,鹽度適當降低、高鹽處理組的藻紅蛋白含量在不同光照強度間存在顯著差異(P<0.05);低鹽處理組的藻紅蛋白含量在不同光照強度間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同處理下龍須菜的葉綠素a、類胡蘿卜素和藻紅蛋白含量Fig.4 Contents of chlorophyll a,caroteniod and phycoerythrin in G. lemaneiformis under various light intensities and salinities

2.5 討論

鹽度的變化對于大多數海藻來說都是一種脅迫,其波動會改變細胞滲透壓,從而影響生物體的化學成分如光合色素、蛋白質等的合成[32]。龍須菜的相對生長速率和凈光合速率在MS培養條件下達到高值,表明鹽度適當降低促進龍須菜的生長。這種現象在菊花心江蘺(Gracilarialichenoides)[3]、半葉馬尾藻[11]、Gracilariacorticata[33]等大型藻類中均有報道。隨著鹽度增加,葉綠素a和藻紅蛋白含量呈現出先升高后降低的變化趨勢,與相對生長速率、凈光合速率相同,在低鹽培養條件下最低,鹽度適當降低培養條件下最高,表明葉綠素a和藻紅蛋白是將光能轉化為化學能的關鍵色素,與藻類的光合作用密切相關[34]。在低鹽培養條件下,龍須菜的凈光合速率被抑制,表明鹽度過低會降低龍須菜的光合性能,可能是由色素含量下降引起的[28],因為藻類通過調整自身色素含量來適應環境變化是一種普遍現象[35],而葉綠素a在光系統的電子傳遞中起著非常重要的作用[36]。此外,鹽度的適當降低促進龍須菜的凈光合速率和相對生長速率,可能與降雨量增加導致攜帶營養鹽的大量陸源淡水入海,引起近岸海水營養鹽濃度增加有關[37-38]。

光照是影響藻類生長和光合作用的主要非生物因子之一,過高或過低都會影響光合作用,進而影響藻體的正常生長[15,19]。光照強度過低引起能量短缺或者光合作用的關鍵酶未能充分活化,導致藻體的光合活性下降。龍須菜在高光培養條件下的相對生長速率、凈光合速率顯著高于低光處理組,這與其他大型海藻如裙帶菜[19]、繩狀龍須菜[23]、緣管滸苔[22]、滸苔[23]、真江蘺(Gracilariaasiatica)[39]的研究結果一致。此外,低光培養條件下龍須菜的光能利用效率低于高光處理組。福建梅雨季引起的持續陰天,導致栽培海域光照強度下降,不利于龍須菜生物量的累積。葉綠素a和藻紅蛋白是藻體進行光合作用的反應中心及捕光系統,其中藻紅蛋白捕獲光能并將其傳遞給光系統II,最終到達反應中心葉綠素a,二者易受外界環境的影響[30-31]。在高鹽培養條件下,低光處理促進龍須菜葉綠素a和藻紅蛋白的合成,光合色素含量與光照強度呈負相關的現象在其他海藻中普遍存在。原因在于光強不足引起的生長速率、光能利用效率下降,藻體會通過補償性的合成光合色素來彌補上述不足,這是藻體響應外界環境變化的一種積極策略,具備重要的生理、生態作用[19-20]。

本研究中龍須菜的最佳生長條件位于HLMS處理組,即當光照強度為120 μmol/(m2·s)、鹽度為24時,龍須菜的生長和產量達到了最高值。福建臨近北回歸線,屬于暖熱濕潤的亞熱帶季風氣候,春夏之際梅雨季的到來,引起栽培海域光照強度、鹽度的短期變化。近年來,主產地福建龍須菜的栽培年產量不穩定,尤其在梅雨季其產量發生劇烈波動,少數呈增產趨勢,多數呈下降趨勢。本研究通過研究光照強度、鹽度及二者耦合作用對龍須菜生長和光合生理的影響,在一定程度上揭示了梅雨季節龍須菜生長不穩定的原因,也即梅雨季節龍須菜栽培產量潛在地取決于光照強度、海水表層鹽度及其耦合作用的變化。降雨引起的海水鹽度適當降低對龍須菜的生長具有促進作用,但當鹽度過低會導致龍須菜產量急劇下降。降雨過程中,適當地增加光照將有利于龍須菜生長的恢復和產量的提高。這為我們在梅雨季更好地進行龍須菜栽培提供理論思路,如通過將其掛養在靠近海水表層的水層,以接受更多光照,促進龍須菜的生長。

3 結論

在本研究中,光照強度和鹽度耦合對龍須菜生長和光合作用產生顯著影響,梅雨季節栽培龍須菜產量的增加或減少,一定程度上取決于光照強度與海水鹽度的變化及其耦合作用。栽培龍須菜最適生長條件為光照強度120 μmol/(m2·s)、鹽度為24。充足的光照耦合鹽度的適當降低(HLMS)促進龍須菜的生長,但鹽度過低會抑制其生長。這為預判龍須菜栽培產量提供一定的理論依據,同時為梅雨季節更好地開展龍須菜栽培提供科學支撐數據。