南美白對蝦副產物酶解工藝優化及其蛋白肽活性評價

吳澤龍,何建林,白鍇凱,唐 超,張 怡,洪碧紅*

(1.閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心,福建 福州 350002;2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發利用工程技術創新中心,福建 廈門 361005;3.福建農林大學食品科學學院,福建 福州 350002)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)是中國主要的對蝦養殖品種,占對蝦養殖總產量的70%以上[1],在加工過程中產生的副產物(蝦頭蝦殼)占整蝦總重量40%～50%[2]。當前,蝦加工副產物利用率低,絕大部分未經利用而被丟棄,造成嚴重的資源浪費和環境污染。但蝦加工副產物中富含有價值的生物活性物質,包括蛋白質/肽[3]等,其中蝦頭中的蛋白質含量達6.38%[4],且氨基酸種類齊全。研究表明蝦蛋白肽具有抗氧化[5-6]、降壓[7]、降血糖[8-9]、增強免疫[10]、抗菌[11-12]等生物活性,還有安全性高、易于人體吸收等優點,可應用于開發膳食補充劑、功能性食品等[13-14]。目前,蝦蛋白肽的提取方法主要包括酸堿法[15-16]、微生物發酵法[17]、酶解法等。在酸堿法中,常用堿法或堿溶酸沉法提取蛋白肽,其水解程度難以控制,蛋白提取率低,氨基酸易被破壞,環境污染嚴重。微生物發酵法則是將原料通過微生物發酵方式獲得蛋白肽等物質,其機理尚未完全明確,發酵過程難以調控,產物復雜、雜質多。而酶解法具有水解高效、穩定性好、酶解過程易控制等優點[18],是當前制備食源性肽或活性肽的理想生產方法。近年來,利用酶解法制備蝦蛋白肽成為高值化開發南美白對蝦副產物的重要發展方向。因此,本研究以南美白對蝦加工副產物為原料,考察不同外源酶對蝦頭內源酶自溶酶解的協同作用,篩選出對內源酶具有較好協同作用的堿性蛋白酶進行單因素試驗,再經響應面法優化外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解工藝。最后,測定蝦蛋白肽的分子量,并進行功效評價,以期為對蝦加工副產物高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

南美白對蝦加工副產物(新鮮蝦頭蝦殼)由龍海市海澄萬家福水產店提供。

胃蛋白酶(10萬U/g),購自河南萬邦實業有限公司;酸性蛋白酶(20萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、風味蛋白酶(2.5萬U/g)、動物蛋白酶(10萬U/g)、胰蛋白酶(2 500 USP U/mg)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g),購自廣西南寧龐博生物科技有限公司;高效凱氏定氮片,購自上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)、甘氨酸(75.07 Da)、維生素B12(1 355.37 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)、細胞色素C(12 400 Da),購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甘氨酰甘氨酸(189.17 Da),購自上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS),購自美國西格瑪奧德里奇公司;地塞米松磷酸鈉,購自羅恩試劑公司;印度墨汁,購自飛凈科研試劑;胎牛血清(FBS)、PBS緩沖溶液、RPMI 1640 Medium(Giboc)、CCK8,購自北京索來寶科技有限公司;其余試劑均為市售分析純。

BALB/c種小鼠(SPF級),體質量為16～18 g,雄性;動物許可證號：SCXK(滬)2017-0005,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。小鼠在溫度(22±1)℃、相對濕度(55±5)%、12 h明暗交替的SPF級動物房中飼養。動物實驗遵循自然資源部第三海洋研究所動物倫理委員會管理規定。

1.2 儀器與設備

SHA-B型水浴恒溫振蕩器,購自金壇市訊生儀器廠;CT14RD臺式高速冷凍離心機,購自上海天美生化儀器設備工程有限公司;S210K 酸度計,購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RCT digital S025 磁力器攪拌器,購自艾卡(廣州)儀器設備有限公司;SCINO (KT260&DT208)定氮儀,購自福斯賽諾分析儀器蘇州有限公司;SPPM-18S-1膜分離設備,購自三達膜科技(廈門)有限公司;1812卷式膜(編號116695,截留分子量：1 kDa),購自法國蘇伊士公司;B-290噴霧干燥儀,購自瑞士布奇公司;AKTA purifierTM10蛋白層析儀,購自美國通用電氣公司;UV-1780 紫外可見分光光度計,購自島津儀器(蘇州)有限公司;MC21S電子分析天平,購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SUNRISE酶標儀,購自奧地利蒂肯公司。

1.3 酶解工藝

南美白對蝦副產物粉碎后制得蝦頭蝦殼勻漿液,其中,新鮮蝦頭蝦殼勻漿液為生基原料;生基原料經100 ℃ 滅酶10 min,即為熟基原料。根據試驗條件進行酶解,反應結束后,于100 ℃ 滅酶10 min,待樣品冷卻后,于轉速10 000 r/min離心10 min,取上清液并測定其氨基酸態氮含量并計算蝦蛋白水解度。

1.4 外源酶的篩選

以粉碎后蝦頭蝦殼生基或熟基勻漿液為原料,分別加入9種外源酶,酶添加量為原料的1%,在各自最適酶解條件下酶解3 h(表1),并以不加外源酶的生、熟基原料作為空白對照組(參考朱國萍等[19]的方法,結合前期實驗,酶解溫度為40 ℃,pH為8),探究外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解的作用。根據蝦蛋白水解度對比不同外源酶及生、熟基原料對照組的酶解效果,篩選出最適外源酶。

表1 外源酶的酶解條件Tab.1 Enzymatic conditions for exogenous enzymes

1.5 外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解單因素試驗

取粉碎后的蝦頭蝦殼生基勻漿液為原料,以篩選的最適外源酶進行酶解,單因素試驗分別考察不同因素對蝦蛋白水解度的影響。各因素梯度為：酶添加量：1%、2%、3%、4%、5%;酶解時間：1、2、4、6、8 h;酶解溫度：30、35、40、45、50、55 ℃;料液比：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.6 外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解工藝響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上,選取試驗中對蝦蛋白水解度有顯著影響的三因素,采用 Design-Expert 11.0 軟件,按Box-Benken設計原理,以蝦蛋白水解度作為響應函數,選取適當的響應面因素及其水平,通過響應曲面分析回歸得出自變量與響應函數之間的統計模型,優化外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解工藝,試驗因素水平編碼如表2所示。

表2 響應面因素水平Tab.2 Variables and experimental design levels for response surface analysis

1.7 蛋白水解度的測定

通過測定酶解液中氨基酸態氮的含量和原料中總氮的含量,按公式(1)進行蛋白水解度(DH)計算。其中,氨基酸態氮的測定采取甲醛電位滴定法[20];總氮的測定參照《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[21],按凱氏定氮法測定。

(1)

式(1)中：X1為酶解液中氨基酸態氮含量;X2為原料中總氮含量。

1.8 揮發性鹽基氮含量的測定

參照《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[22],按微量擴散法測定。

1.9 蝦蛋白肽的分離及活性評價

1.9.1 蝦蛋白肽的制備及分離

取粉碎后的蝦頭蝦殼生基勻漿液為原料,加入堿性蛋白酶,按優化后酶解工藝條件進行酶解。反應結束后于100 ℃滅酶10 min,待樣品冷卻后,于轉速10 000 r/min離心10 min,即得蝦蛋白肽上清液。上清液用截留分子量為1 kDa的卷式膜分離,收集透過液,經濃縮、噴霧干燥即得蝦蛋白肽粉末。

1.9.2 蝦蛋白肽分子量的測定

參照《海洋魚低聚肽粉》[23]標準測定收集的蛋白肽分子量,色譜條件：凝膠柱為SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL(10 mm×300 mm);流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸(45∶55∶0.1,體積比),流速0.5 mL/min;檢測波長為220 nm。校正曲線所用的標準品：甘氨酸、二甘氨酰甘氨酸、維生素B12、抑肽酶、細胞色素C。

1.9.3 羥自由基清除能力測定

配制FeSO4溶液(8 mmol/L)、水楊酸溶液(3 mmol/L,避光保存)以及過氧化氫溶液(20 mmol/L)備用。取試管依次加入樣品與上述溶液,渦旋混勻后置于37 ℃水浴鍋中恒溫30 min,反應結束后取出冷卻至室溫,再加入定量蒸餾水。于轉速5 500 r/min條件下離心15 min,取上清液備用,記為A2樣品組。用蒸餾水代替樣品,經相同處理后,記為A1空白對照組。在510 nm處測定吸光值[24]。按公式(2)計算羥自由基清除率：

(2)

1.9.4 DPPH自由基清除能力測定

稱取適量1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)粉末,溶解于無水乙醇,配制終濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液。取不同濃度樣品溶液加入等體積DPPH溶液,為樣品組B1;取不同濃度樣品溶液加入等體積乙醇溶液,為對照組B2;取DPPH溶液加入等體積的乙醇溶液,為空白組B0。以上試驗組渦旋混勻后,室溫避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度[25]。按公式(3)計算DPPH自由基清除率：

(3)

1.9.5 實驗動物分組及給藥

實驗動物(BALB/c小鼠)適應性飼養10 d后,隨機分為5組,包括陰性對照組、免疫低下模型組和蝦蛋白肽給藥組(低劑量1 mg/kg、中劑量10 mg/kg、高劑量100 mg/kg),每組11只。免疫低下模型組的造模方法采用隔日腹腔注射地塞米松,每次40 mg/kg,給藥10次;陰性對照組注射等量的生理鹽水。給藥組和模型組一樣給予地塞米松,給藥方法為灌胃給予不同劑量的蝦蛋白肽,連續灌胃給藥21 d。陰性對照組、模型組灌胃同體積的無菌水。

1.9.6 蝦蛋白肽對BALB/c鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

小鼠處死后,立即浸泡于75%酒精中5 min,無菌取出脾臟,在磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗2遍后,放置在盛有4 ℃預冷PBS的200目細胞篩中,注射器活塞研磨后,經細胞篩過濾即得脾細胞懸液。于1 500 r/min,4 ℃條件下,離心5 min,棄上清;加入Tris-HCl溶液混勻,同上述條件離心,棄上清,加入含10% FBS的RPMI 1640培養基重懸細胞,靜置,以200 μL/孔鋪96孔板(密度5×106個細胞/mL),2 h后加入蝦活性肽及絲裂源LPS處理。46 h后,以1∶10的比例加入CCK8(20 μL/200 μL),培養3 h后在450 nm處檢測光密度(OD)值[26]。

1.9.7 蝦蛋白肽對免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響

末次給藥1 h后,從小鼠尾靜脈注入印度墨汁(劑量為每10 g體重0.05 mL),立即計時,于2、8 min時分別從內眥靜脈叢取血10 μL,并立即將其加到1 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用全自動酶標儀在600 nm波長處測OD值,以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,稱重。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力,按公式(4)、(5)計算廓清指數(K)值和吞噬指數(a),按公式(6)、(7)計算小鼠胸腺指數(b)和脾臟指數(c)[27]。

(4)

(5)

(6)

(7)

式(4)至(7)中：M1為小鼠處死后體質量(g);m1為肝臟質量(mg);m2為脾臟質量(mg);m3為胸腺質量(mg);M2為小鼠處死前體質量(g)。

1.10 數據處理方法

所有實驗均進行 3 次平行實驗,數據以均值±標準偏差表示,采用 Design-Expert 11.0、Excel 2016 和GraphPad Prism 8.0 軟件分析處理數據。

2 結果與討論

2.1 外源酶篩選結果

9種外源酶,在各自最適酶解條件下酶解3 h,與空白(無外源酶)相比,水解度均有提高,且外源酶的生基原料試驗組水解度均高于熟基原料試驗組,以堿性蛋白酶效果最優,其熟基試驗組水解度為(26.50±0.23)%,生基試驗組水解度高達(40.88±0.40)%(圖1),表明堿性蛋白酶與南美白對蝦內源酶自溶酶解具有較好的協同作用,因此,選用堿性蛋白酶與生基原料進行后續酶解工藝優化實驗研究。

圖1 外源酶對蝦蛋白水解度(DH)的影響Fig.1 Effect of exogenous enzymes on the degree of shrimp proteolysis

2.2 外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解單因素試驗

各因素對蝦蛋白水解度的影響見圖2。如圖2(a)所示,隨酶添加量增大,水解度呈上升趨勢,當酶添加量為4%時,水解度達最大值。繼續增加酶用量,水解度趨于平緩。這是由于酶添加量過高會影響酶活性中心對底物的定位和接近,抑制酶的活性[28],且繼續增加酶用量,酶與底物結合趨于飽和,出現酶過?，F象,抑制酶解反應的進行[29],使得水解度趨于平緩。因此,選取酶添加量為4%。

圖2 各因素對蝦蛋白水解度(DH)的影響Fig.2 Effects of various factors on the degree of shrimp proteolysis

如圖2(b)所示,酶解6 h時水解度達最高值,而后趨于平緩。酶解反應時間延長可能引起酶活力下降,底物肽鏈中可與酶活性位點結合的肽鍵數減少[30],導致水解度基本不變。因此,選取酶解時間為6 h。

如圖2(c)所示,在酶解溫度為40 ℃ 時水解度達到最高值,而后溫度繼續升高,酶的活性降低,甚至使其永久性失活,從而導致水解度降低[31]。因此,選取酶解溫度為40 ℃。

如圖2(d)所示,隨著料液比升高,水解度顯著增加。適宜的料液比,使得酶與底物在酶解時有充分的接觸,從而提高水解度。過高的料液比,導致底物濃度降低,酶解速率減慢,酶解效率下降,水解度趨于平緩。因此,選取料液比為1∶5。

2.3 響應面優化外源酶協同內源酶自溶酶解工藝

2.3.1 響應面設計方案與實驗結果

在外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解單因素試驗的基礎上,利用響應面優化進行酶解工藝條件的優化,響應面試驗數據見表3。

表3 響應面實驗設計與結果Tab.3 Response surface experimental factors and responses

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析

以蝦蛋白水解度為響應值,根據表3的數據,利用 Design-Expert 11.0軟件進行多元回歸分析,擬合得到二次多項回歸方程為：Y=49.71+0.586 3A-0.48B+2.15C-0.212 5AB+0.43AC-0.952 5BC-2.15A2-2.32B2-3.22C2。

該模型的方差分析見表4。模型(P<0.000 1)極顯著,失擬項(P=0.221 1>0.05)不顯著,相關系數R2=0.985 8,表明模型與試驗結果擬合較好,預測值與實測值間具有高度的相關性。各因素對蝦蛋白水解度的影響程度大小順序為：酶解時間>酶添加量>酶解溫度。

表4 回歸系數模型及方差分析表Tab.4 Model summary and analysis of variance

2.3.3 各因素間對蝦蛋白水解度交互作用的響應面分析

各因素間交互作用對蝦蛋白水解度的影響,可從響應面與等高線的變化得到直觀反映[32]。如圖3所示,因素B與因素C曲線最為陡峭,等高線為橢圓形,說明酶解時間與酶解交互作用最為顯著;因素A與因素B、因素A與因素C交互作用均不顯著,其中因素A與因素B,曲線平滑,等高線為圓形,交互作用最弱,與方差分析結果一致。

圖3 各因素交互作用對蝦蛋白水解度影響的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors on the degree of shrimp proteolysis

2.3.4 響應面試驗驗證

采用 Design-Expert 11.0 軟件優化功能,在試驗因素取值范圍內選擇響應值最大值,可得到最佳試驗條件：酶添加量4.05%、酶解溫度39.90 ℃、酶解時間6.48 h,此時預測的酶解液中蛋白水解度為50.12%。根據試驗實際操作可行性,取最優酶解條件為：酶添加量4%,酶解溫度40 ℃,酶解時間6.5 h,試驗重復3次,此條件下酶解,測得蛋白水解度實際值為(50.02±0.13)%,接近理論值。結果表明該工藝模型預測值與實際試驗結果擬合度高,利用響應面法優化南美白對蝦副產物酶解工藝準確可行。

2.4 揮發性鹽基氮含量的測定結果

揮發性鹽基氮含量與海水魚、蝦、頭足類等水產品的新鮮度有明顯的對應關系?！妒称钒踩珖覙藴?鮮、凍動物性水產品》指出通過測定揮發性鹽基氮含量可反應水產品的新鮮度,并要求海水魚、蝦、頭足類揮發性鹽基氮含量小于等于30 mg/100 g[21]。在響應面模型優化的最優酶解工藝條件下,檢測在酶解過程中,蝦加工副產物揮發性鹽基氮含量的變化。如圖4所示,在酶解0～6 h范圍內,揮發性鹽基氮含量平緩上升,在10 h才超過限定標準。結果表明：所用蝦加工副產物原料新鮮度、加工適用性好,且在酶解時間8 h范圍內,揮發性鹽基氮含量不超限,可用于開展后續實驗。

圖4 揮發性鹽基氮含量在酶解過程中的變化Fig.4 Changes of volatile base nitrogen content during enzymatic hydrolysis

2.5 蝦蛋白肽分子量的測定及活性評價結果

2.5.1 蝦蛋白肽分子量測定

選取5種標準品,通過標準品過凝膠柱的色譜圖,測定蝦蛋白肽樣品的分子量。標準品對應的洗脫時間為：細胞色素C 9.25 min,抑肽酶11.73 min,維生素B12 15.10 min,二甘氨酰甘氨酸18.00 min,甘氨酸19.30 min。同等條件下測定蝦蛋白肽的分子量。如圖5所示,蝦蛋白肽的分子量主要分布在1.5 kDa以下,其中75～1 355 Da占比為76.35%。

2.5.2 羥自由基清除率

活性肽的羥自由基清除能力主要由暴露的氨基酸側鏈基團和肽序列所決定。與維生素C(VC)相比,蝦蛋白肽清除羥自由基(·OH)的能力相對較弱(圖6)。隨著反應濃度的增加,兩者清除·OH的能力也隨之升高。通過GraphPad Prism 8.0分析擬合并計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),可得VC的IC50為0.17 mg/mL,蝦蛋白肽的IC50為4.64 mg/mL,表明蝦蛋白肽具有一定的清除·OH能力。

圖6 VC和蝦蛋白肽對·OH的清除作用Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of VC and shrimp peptide on ·OH

2.5.3 DPPH自由基清除率

如圖7所示,VC和蝦蛋白肽對DPPH的清除率隨著樣品濃度的增加而呈上升趨勢,存在量效關系。當蝦蛋白肽含量在5 mg/mL 時,DPPH清除率達到了85.13%。通過GraphPad Prism 8.0分析擬合并計算,可得VC的IC50為0.03 mg/mL,蝦蛋白肽的IC50為3.08 mg/mL。表明蝦蛋白肽具有一定的DPPH清除能力。

2.5.4 蝦蛋白肽對BALB/c鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

機體的特異性免疫主要包括細胞免疫和體液免疫。在細胞免疫中,淋巴細胞增殖活性的提高對機體免疫具有正向調節作用。如圖8所示,蝦蛋白肽單獨給藥對淋巴細胞的增殖無影響;但是同時添加蝦蛋白肽(1 μg/mL或10 μg/mL)和絲裂源LPS(10 μg/mL)具有促進作用,顯著刺激了小鼠淋巴細胞增殖,且與絲裂源LPS(10 μg/mL)相比有統計學意義,表明蝦蛋白肽具有一定的促進淋巴細胞增殖的作用。

圖8 蝦蛋白肽對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.8 Effect of shrimp peptides on the proliferation of splenic lymphocytes“***”表示P<0.001(與對照組相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01(與LPS組相比)。

2.5.5 蝦蛋白肽對免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響

吞噬指數反映了巨噬細胞的吞噬能力,進而反映機體非特異性免疫水平。而胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官,免疫器官的質量變化可反映機體的免疫功能,免疫器官質量增加為免疫增強的表現,反之則為免疫抑制。如圖9所示,模型組小鼠的吞噬指數、胸腺指數、脾臟指數明顯降低,說明免疫力低下的模型成功建立。用蝦蛋白肽給藥21 d的小鼠,3個劑量組均能顯著提高免疫低下模型小鼠的胸腺指數,中劑量組(10 mg/kg)能顯著提高吞噬指數和脾臟指數。以上結果表明蝦蛋白肽能使免疫力低下小鼠的免疫器官增重并提高免疫細胞的吞噬能力,顯示出提高免疫力的功效。

圖9 蝦蛋白肽對免疫抑制小鼠吞噬指數、胸腺指數和脾臟指數的影響Fig.9 Effects of shrimp peptides on phagocytic index,thymic index,and splenic index in immunosuppressed mice“*”表示P<0.05,“***”表示P<0.001(與陰性組相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01,“###”表示P<0.001(與模型組相比)。

2.6 討論

利用酶解法提取蛋白肽,主要包括內源酶自溶酶解法及外加酶復合酶解法。內源酶自溶酶解法對副產物蝦頭蝦殼的水解能力普遍不足,本研究采用9種外源蛋白酶與蝦頭內源酶對蝦頭蝦殼進行復合酶解,結果表明：堿性蛋白酶對蝦頭內源酶具有較好的協同作用,經單因素試驗及響應面優化后的蝦蛋白水解度達(50.02±0.13)%,高于藍尉冰等的堿性蛋白酶解工藝[蝦蛋白水解度為(43.88±0.03)%][33]和何穎恒等的超聲波輔助堿性蛋白酶與中性蛋白酶復合酶解(蝦蛋白平均水解度為42.5%)[34],本研究的酶解工藝更具優勢。

文獻報道酶解工藝制備的蝦蛋白肽具有顯著的抗氧化、清除自由基、免疫調節、保護肝腎等功能,而且蝦蛋白肽的活性與酶解位點及蛋白肽的分子量緊密相關。如分子量小于 6 kDa的低分子量肽更容易穿過胃腸屏障與目標物質結合發揮作用[35]。王晉等采用風味蛋白酶制備蝦蛋白肽,其中3～10 kDa的多肽組分具有顯著的抗氧化作用[36]。黃湛媛等采用中性蛋白酶酶解,從竹節蝦(Penaeusjaponicus)蝦頭酶解產物中分離制備抗氧化肽中分子量在<3 kDa的組分具有顯著的抗氧化活性[37]。姜爍琦經體外模擬胃腸道消化制備低分子量(小于1 kDa的組分占84.38%)中華管鞭蝦(Solenoceracrassicornis)蝦頭肽,其低分子量肽可增強小鼠體液免疫、細胞免疫及改變腸道菌群結構,改善小鼠免疫低下,并恢復小鼠的肝腎代謝功能[38]?？梢?低分子肽段可能顯示出更佳的生物學功效。本研究采用堿性蛋白酶協同蝦頭內源酶自溶酶解,酶解產物經膜分離后獲得的蝦蛋白肽分子量主要分布在1.5 kDa以下,屬于低分子量肽段。此蝦蛋白肽對羥自由基、DPPH自由基具有一定的清除能力,較方磊等報道的南極磷蝦肽的羥自由基清除能力[39]更優。此外,蝦蛋白肽可顯著促進淋巴細胞增殖,并能顯著提高小鼠的胸腺指數,特別是中劑量組(10 mg/kg)能顯著提高吞噬指數和脾臟指數,顯示出免疫增強功效。后續工作可結合蝦蛋白肽的氨基酸序列研究,探究蝦蛋白肽的結構特征與其功效活性(抗氧化、免疫調節等)的構效關系,為開發高質化功能性蛋白肽產品奠定基礎。

3 結論

本研究以南美白對蝦加工副產物(蝦頭蝦殼)為原料,通過外源酶協同蝦頭內源酶自溶酶解工藝制備蝦蛋白肽,并對其進行功效評價。結果表明堿性蛋白酶協同內源自溶酶具有較好的酶解效果。通過單因素試驗及響應面實驗優化,得到最佳酶解工藝條件為：酶添加量4%、酶解時間6.5 h、酶解溫度40 ℃、料液比1∶5。在此條件下,蝦蛋白水解度為(50.02±0.13)%,且在酶解8 h內,蝦加工副產物的揮發性鹽基氮含量符合《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》限定標準。酶解產物經膜分離后,所得蝦蛋白肽分子質量主要分布在75～1 355 Da,占比為76.35%,其對羥自由基、DPPH的IC50分別為4.64 mg/mL和3.08 mg/mL ,具有一定的自由基清除能力。此外,南美白對蝦副產物蝦蛋白肽能促進淋巴細胞增殖,改善胸腺和脾臟萎縮,提高免疫細胞的吞噬能力,顯示出較明顯的免疫增強功效,具有開發成為功能性免疫調節劑的潛能,值得深入研究和開發。