海南常見紅樹植物葉片脂肪酸組成

楊睿堯,謝麗梅,安文碩,陳順洋,陳 彬,4,陳光程,4*

(1.上海海洋大學海洋科學學院,上海 201306;2.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005;3.廈門大學環境與生態學院,福建 廈門 361005;4.自然資源部北部灣濱海濕地生態系統野外科學觀測研究站,廣西 北海 536015)

分布在熱帶、亞熱帶地區潮間帶的紅樹林通常會促進潮間帶生境的復雜性和多樣性,為諸多生物提供棲息和覓食的環境,為各種生物的生存繁衍提供了物質基礎,維持著與其密切相關的底棲動物群落和生物多樣性[1]。脂肪酸是植物細胞重要的組成部分,其組成與植物自身的生理功能密切相關,在不同物種和地理區域表現出明顯的差異[2-3]。脂肪酸在動物攝食過程中能夠相對保守地同化至消費者體內,隨著食物鏈傳遞至下一營養級,通過比較脂肪酸成分,能夠反映一段時間內動物的攝食情況[4]。一些學者也指出,紅樹植物體內多不飽和脂肪酸種類多,含有較多人體和動物必需的脂肪酸,是潛在的脂肪酸資源[5-6]。因此脂肪酸的組成分析對認識紅樹植物脂肪酸資源、紅樹林生態系統內部的營養關系、食物網的結構,以及紅樹植物對生境的適應等具有重要參考價值[7]。

目前我國針對秋茄(Kandeliaobovata)、白骨壤(Avicenniamarina)、桐花樹(Aegicerascorniculatum)和無瓣海桑(Sonneratiaapetala)等廣布種開展了植物體脂肪酸的研究[5,8-10],但總體上研究仍有限,對于熱帶地區紅樹物種的脂肪酸組成及差異的報道較少。本研究比較了我國海南三亞鐵爐港和文昌清瀾港常見紅樹植物葉片脂肪酸的組成,分析植物葉片脂肪酸在物種和區域之間的差異,以期豐富紅樹植物脂肪酸組成、資源利用潛力和生態學作用的信息。

1 材料與方法

1.1 研究區域

本研究的植物樣品采集自海南島南部的三亞市鐵爐港(18°15′N,109°42′E)和東部的文昌市清瀾港(19° 54′N,110° 84′E)。這兩個港灣屬于熱帶季風氣候,三亞市的年均氣溫為 25.5 ℃,年均降水量為1 738 mm;文昌市的年均氣溫為24.1 ℃,年均降水量為2 106 mm[11-12]。鐵爐港地貌上屬沙壩-潟湖型港灣,潮汐為不規則日潮型;土壤以砂土、砂質粘土為主,多砂石及貝殼珊瑚碎屑[13]。清瀾港屬潟湖潮汐通道港灣,潮汐為不規則日潮型,土壤以細砂、砂-粉砂-粘土為主[14]。

1.2 植物樣品采集與脂肪酸分析

本研究在鐵爐港和清瀾港分別采集紅海欖(Rhizophorastylosa)、杯萼海桑(Sonneratiaalba)、木果楝(Xylocarpusgranatum)、角果木(Ceriopstagal)、欖李(Lumnitzeraracemosa)、木欖(Bruguieragymnorrhiza)和正紅樹(Rhizophoraapiculata)等7種植物的葉片。隨機采集紅樹植株上的成熟葉片,在每株植物上采集3～5片成熟葉片合并為1份樣品,每個物種采集3份樣品。樣品運回實驗室后用蒸餾水洗凈,于-40 ℃冷凍干燥后研磨待測。

本研究中脂肪酸的表達式寫為CA：BnXt或CA：BnXc,A表示脂肪酸碳鏈的碳數,B表示雙鍵的數量,X表示第一個雙鍵離甲基端的碳數,t表示反式脂肪酸,c表示順式脂肪酸。碳鏈中含一個雙鍵的脂肪酸為單不飽和脂肪酸,含兩個及以上雙鍵的脂肪酸為多不飽和脂肪酸。脂肪酸的提取和測定參考崔瑩[15]和劉夢壇[16]的方法進行改進。取50 mg樣品,加入C19：0作為內標,用體積比為2∶1的二氯甲烷與0.01%BHT-甲醇混合液在80 ℃水浴下加熱2 h提取脂質,60 ℃水浴蒸干后加入3 mL甲醇和1 mL鹽酸,50 ℃條件下水浴4 h進行甲酯化。結束后迅速冷卻至室溫,用正己烷萃取,樣品定容至1 mL。脂肪酸組成和含量用氣相色譜儀測定,使用HP88色譜柱(60 m×0.25 mm×0.2 μm),柱箱初始溫度為 100 ℃,以 10 ℃/min 程序升溫至210 ℃,保持2 min,再以 1.5 ℃/min 程序升溫至240 ℃,保 持 3 min。采用峰面積歸一化法得到各種脂肪酸成分在樣品中的含量占比情況。樣品加標回收率為70%～90%;脂肪酸含量檢測限為1.01 μg/mL。

1.3 數據處理

運用SPSS 23.0軟件,對鐵爐港和清瀾港紅樹植物樣品中脂肪酸的含量在不同物種之間的差異進行單因素方差分析比較?；跇悠返闹舅岷拷M成,在Primer軟件中采用聚類分析對樣品進行分組,再用相似性分析(One-way ANOSIM)和相似性百分比分析(Simper)檢驗植物樣品處理組之間的相似性。不同植物樣品中脂肪酸組成的差異用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)的多維度分析(OriginPro 2019b)。

2 結果與討論

2.1 紅樹植物葉片脂肪酸種類組成

在鐵爐港和清瀾港采集的紅樹葉片中共檢測出25種脂肪酸(表1、2),鐵爐港的植物樣品中檢測到22種,十五烷酸(C15：0)、亞麻酸(C18：3n3)和芥酸(C22：1)未檢出;清瀾港的樣品中檢測到23種,葵酸(C8：0)和二十碳五烯酸(C20：5)未檢出。月桂酸(C12：0)、肉豆蔻酸(C14：0)、棕櫚酸(C16：0)、硬脂酯酸(C18：0)、油酸(C18：ln9c)、亞油酸(C18：2n6c)、二十碳烯酸(C20：ln9)和二十四烷酸(C24：0)等8種脂肪酸在所有樣品中均有檢測出。樣品中共檢測到16種飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA),不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)包括5種單不飽和脂肪酸(mono unsaturated fat acid,MUFA)和4種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。

所有脂肪酸中含量最高的是SFA中的C16：0,在所有樣品中占比均超過30.00%(30.06%～60.68%),除鐵爐港的紅海欖外,樣品中C18：0(4.38%～12.05%)占比也高于其他飽和脂肪酸。含量較高的UFA有C18：ln9c、C18：2n6c和C20：ln9。其中C20：ln9在木欖和木果楝中的占比均超過20.00%。木果楝和清瀾港的木欖樣品中C18：2n6c的占比也超過20.00%。脂肪酸不飽和指數(以UFA/SFA總含量比值表示)在0.19～1.13之間,木果楝和清瀾港的木欖樣品中脂肪酸不飽和指數大于1。碳原子數小于12的脂肪酸只在木果楝和木欖中檢測到,最短鏈脂肪酸為己酸(C6：0)。最長鏈脂肪酸為三十烷酸(C30：0),占比介于0.46%～5.22%,鐵爐港的正紅樹中未檢測到,清瀾港的紅海欖和杯萼海桑中也未檢出。

2.2 紅樹植物葉片脂肪酸含量比較

在兩個港灣,相同的紅樹物種葉片所含脂肪酸數量和組成有所不同,其中C16：0、C18：2n6c和C20：ln9的變化較明顯(表1、2)。在脂肪酸的組成上,這3種脂肪酸為所有紅樹植物脂肪酸的主要組成。正紅樹、角果木和木果楝的C16：0含量在兩個港灣之間接近,紅海欖和杯萼海桑的C16：0含量則表現為鐵爐港低于清瀾港。兩個港灣木果楝的C18：2n6c和C20：ln9含量也相似,木欖的C20：ln9含量在兩地之間也接近,而C18：2n6c含量在兩地之間差異較大。除正紅樹、木果楝和木欖外,其他物種的飽和脂肪酸占比表現為清瀾港顯著高于鐵爐港(P<0.05,圖1)。清瀾港和鐵爐港紅樹植物脂肪酸含量也表現出不一樣的種間差異。樣品中C16：0含量在不同物種中的差異較大,兩個港灣紅海欖C16：0含量顯著高于其他物種,木果楝的含量則最低。相反,木果楝中含有較高含量的C18：2n6c和C20：ln9(占比>20.00%),并且脂肪酸不飽和指數大于1,表現出與其他物種不同的脂肪酸組成特征。木欖中的C20：ln9占比在兩港灣均超過20.00%,但C18：2n6c的含量在清瀾港和鐵爐港之間存在差異。

圖1 海南鐵爐港和清瀾港紅樹植物葉片脂肪酸中各類脂肪酸的占比Fig.1 Proportion of various fatty acids in the leaves of mangrove plants in Tielugang and Qinglangang,HainanPUFA：多不飽和脂肪酸,MUFA：單不飽和脂肪酸,SFA：飽和脂肪酸;Rs：紅海欖,Sa：杯萼海桑,Ct：角果木,Lr：欖李,Ra：正紅樹,Xg：木果楝,Bg：木欖;Q：清瀾港,T：鐵爐港,下同。

2.3 基于脂肪酸組成的樹種差異和空間差異分析

紅樹葉片脂肪酸組成的聚類分析結果顯示,紅樹植物脂肪酸組成因物種和采樣地點而異(圖2),在7種紅樹植物中,兩個港灣樣品中脂肪酸組成相似水平達90%以上的只有木果楝和正紅樹兩個物種,其他物種在兩個采樣區域表現出明顯的差異?；诰垲惙治龅慕Y果,在相似性71%水平下區分為3組進行One-way ANOSIM分析。結果表明,組I與組II(R=0.434,P=0.012)、組I與組III(R=0.935,P=0.022)之間存在顯著差異。對I、II組之間差異性貢獻最大的脂肪酸是C16：0,其次是C20：ln9和C18：2n6c;對II、III組之間差異性貢獻最大的同樣為C16：0,其次是C18：0、C18：ln9c和18：2n6c;對I、III組之間差異性貢獻最大的則是C20：ln9。

圖2 海南鐵爐港和清瀾港紅樹植物葉片脂肪酸組成的聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis results of fatty acid composition of mangrove leaves collected from Tielugang and Qinglangang,Hainan

PCA分析將紅樹植物的脂肪酸組成分為4組(圖3),兩個港灣相同物種的脂肪酸組成上只有木果楝、正紅樹、紅海欖和木欖處于相同分組,在相似性上兩個港灣紅海欖和木欖的相似程度低于木果楝和正紅樹,結果與聚類分析結果相似。對兩個港灣其余物種Simper分析表明,造成各組內部物種之間差異貢獻最大的脂肪酸是C16：0(貢獻率35.47%～56.67%);C16：0是造成組4與其他3組之間差異性貢獻最大的脂肪酸(貢獻率12.43%～25.51%);C20：ln9是造成1、2組與2、3組之間差異性貢獻最大的脂肪酸(貢獻率21.94%、19.23%);1、3組之間的差異性則由18：2n6c 引起(貢獻率25.94%)。

圖3 海南鐵爐港和清瀾港紅樹植物葉片的脂肪酸組成PCA分析結果Fig.3 PCA analysis results of fatty acid composition of the mangrove leaves collected from Tielugang and Qinglangang,Hainan紅色圖形為鐵爐港,黑色圖形為清瀾港。

2.4 討論

本研究調查了海南三亞鐵爐港和文昌清瀾港7種紅樹植物葉片的脂肪酸組成及其差異。在樣品中檢測到25種脂肪酸,脂肪酸碳鏈長度集中在C12～C20之間,與前人對秋茄、桐花樹、木欖、無瓣海桑等紅樹葉片脂肪酸的研究相一致[8-10]。本次研究中紅樹植物脂肪酸以C20以下脂肪酸為主,其中C20脂肪酸含量低于C16和C18脂肪酸含量。植物脂肪酸的合成是乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶的共同作用下發生連續的聚合反應,最終合成C16至C18的飽和脂肪酸,大多數高等植物脂肪酸碳鏈長度在C18以下[2],由于普通高等植物缺少脂肪酸碳鏈延長的相關酶(如Δ6脂肪酸去飽和酶),所以高等植物C18以上的多不飽和脂肪酸含量較少[17]。脂肪酸組成上,C16：0、C18：0、C18：ln9c、C18：2n6c和C20：1在各樣品中均有較高的含量,在所有樣品中含量最高的C16：0已被證實為紅樹植物葉片脂肪酸組成中的主要成分。一些研究指出紅樹植物葉片中不飽和脂肪酸含量通常高于飽和脂肪酸含量[5,10]。本研究則發現,除木果楝外的其他紅樹植物葉片脂肪酸的組成以飽和脂肪酸為主,木欖的不飽和脂肪酸含量在鐵爐港和清瀾港之間也存在明顯的差異,說明紅樹植物脂肪酸的組成上因地區和物種等因素而異。這種差異在以往的研究中也被報道,例如,珠海淇澳島的木欖樣品中飽和脂肪酸含量低于不飽和脂肪酸,但湛江特呈島的飽和脂肪酸含量可達到不飽和脂肪酸的兩倍[10]。除物種和地理因素外,謝麗梅等發現,紅樹葉片衰老和腐爛后脂肪酸不飽和指數出現明顯的變化[18]。

由于生物體自身代謝水平的差異,一些生物類群會合成特異性的脂肪酸種類或是趨向于較多地合成某幾種脂肪酸,這些脂肪酸就是該生物類群的特征脂肪酸[2]。在濱海濕地植物中,碳鏈長度大于24的脂肪酸被認定為紅樹植物的特征脂肪酸而被廣泛用于指示紅樹植物對海洋動物的食物供給[7]。紅樹植物的特征脂肪酸組成存在明顯的種間差異和區域差異,其長鏈脂肪酸的組成和含量存在很大的不確定性,在一些物種中存在兩種及以上的長鏈脂肪酸,但一些物種中甚至未能檢測到長鏈脂肪酸[8-10]。本研究中紅樹植物的特征脂肪酸組成也表現出種間和區域間的差異;清瀾港的紅海欖和杯萼海桑,以及鐵爐港的正紅樹中未檢測出特征脂肪酸。因此,采用脂肪酸示蹤研究紅樹林動物食源時,需根據植物脂肪酸的組成選擇特征脂肪酸,并結合胃含物分析和穩定同位素示蹤等方法提高結果的準確性[7]。

除自身的遺傳特性決定外,植物體內脂肪酸組成也受多種環境因素的影響[19]。低溫、光照、病害和鹽度等環境因素對植物不飽和脂肪酸的合成有一定的調控作用[20]。由于植物脂肪酸組成與植物細胞膜的結構和功能密切相關,不飽和脂肪酸含量增加則會提高膜的流動性,提高植物對環境的抗逆性和適應性[21]。本研究中C18：ln9c、C18：2n6c和C20：1是造成不同紅樹物種之間差異性的主要脂肪酸,鐵爐港和清瀾港紅樹葉片中不飽和脂肪酸的含量也存在差異,除木果楝和木欖外其他物種總體上表現出清瀾港低于鐵爐港。光照時長和氣溫可能是造成兩個研究區域之間紅樹葉片脂肪酸組成差異的因素。三亞年日照時長(2 500 h)高于文昌(1 800 h)[14]。光照時長已被證實會使植物脂肪酸的含量和組成產生明顯差異,隨著光照時間的延長,不飽和脂肪酸如C18：ln9c的占比增加[22-23]。植物的脂肪酸不飽和指數與植物對溫度的適應性密切相關[24],低溫能夠誘導植物中脂肪酸的去飽和相關酶表達,使脂肪酸不飽和指數升高,提高植物的耐寒性[25-26]。本研究樣品采集于低緯度的熱帶地區,這些植物葉片的脂肪酸不飽和指數總體上低于其他地區報道的秋茄、桐花樹、老鼠簕(Acanthusilicifolius)等物種的結果[5,10],說明這些紅樹林物種的地理分布可能與它們體內脂肪酸不飽和指數關系密切。以紅海欖為例,其脂肪酸不飽和指數在福建九龍江口和廣東湛江(特呈島)分別為1.12和0.76[5,27],在清瀾港和鐵爐港則分別為0.38和0.24,總體上隨緯度降低而降低。在環境溫度的變化中能否調節體內脂肪酸組成的能力也關系著植物對低溫條件的適應性[28],因此,我們推測一些紅樹林廣布種可能具有較強的脂肪酸調控能力以適應不同的氣溫條件,但還需要進一步的驗證。

3 結論

本研究結果表明,海南三亞鐵爐港和文昌清瀾港7種紅樹植物的脂肪酸以偶數碳原子脂肪酸為主,其中C16：0在所有植物中含量最高,紅樹植物中存在C26：0和C30：0等特征脂肪酸。不同紅樹物種之間脂肪酸的組成不同,除木欖和正紅樹外的其他紅樹植物的脂肪酸在兩個區域之間也存在差異,這些差異主要歸因于植物葉片中C16：0、C18：ln9c和C18：2n6c含量的變化?？傮w上,鐵爐港紅樹植物中不飽和脂肪酸占比高于清瀾港,但兩地的紅樹植物中脂肪酸不飽和指數較低,可能與溫度和光照時長等環境因素有關。因此,脂肪酸的組成可應用于紅樹植物對環境因素生理響應的研究,而不同物種在其適宜分布的地理區域內對環境適應性的差異、脂肪酸組成是否反映熱帶地區的植物種源北移的抗寒性等問題還需要進一步探索。