不同時間服用米非司酮對人絨毛組織MMPs/TIMPs表達的影響

張俊勤 李亞星 韓華

藥物流產作為一種非手術終止妊娠的方法,簡便、安全、高效,在臨床應用廣泛[1]。目前比較成熟的藥物流產方案主要為米非司酮150 mg或200 mg口服,48 h后米索前列醇600 μg頓服,完全流產率>90%[2,3]。但此種方法所需時間較長,若能將兩藥的用藥間隔時間縮短,可極大方便患者。本研究觀察停經49 d以內的早孕婦女頓服米非司酮12 h、24 h、48 h后絨毛組織中基質金屬蛋白酶系統(matrix metalloproteinase system,MMPs)/基質金屬蛋白酶組織抑制途徑因子系統(matrix metalloproteinase tissure inhibition pathway factors,T1MPs)中MMP-2、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制途徑因子-1(matrix tissure inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表達,明確米非司酮對MMPs/TIMPs的具體作用,從作用機制上分析米非司酮不同作用時間對早孕絨毛組織的影響,探討縮短其與米索前列醇用藥間隔的可行性,為臨床簡化藥物流產方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經河北省人民醫院醫院倫理委員會批準,選擇2019年9月至2021年5月我院婦科門診自愿要求終止早期妊娠的女性,共80例?；颊唠S機分為4組(對照組,12 h組,24 h組及48 h組),每組20例?；颊呔炇鹬橥鈺?。對照組年齡、停經天數、胎囊大小與與12 h組(t=0.4928、0.1063、0.4929,P=0.6250、0.9159、0.6249)、24 h組(t=0.6322、1.0431、0.8649,P=0.5311、0.3035、0.3925)、48 h組研究對象(t=0.2710、0.3594、0.1959,P=0.7879、0.7213、0.8457)差異無統計學意義,具有可比性。見表1。

表1 4組孕婦一般資料比較 n=20,

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①年齡18～40歲;②停經<49 d,且經B超證實為宮內早孕,宮內妊娠;③胎囊直徑<3 cm;④平時月經規則,半年內未服用任何激素類藥物。

1.2.2 排除標準:①生殖系統炎癥及腫瘤;②精神疾病,無法正常交流。

1.3 方法

1.3.1 米非司酮用藥方法:米非司酮,規格:25 mg/片(浙江仙琚制藥股份有限公司)。12 h組:口服米非司酮150 mg,12 h后行負壓吸引術;24 h組:口服米非司酮150 mg,24 h后行負壓吸引術;48 h組:口服米非司酮150 mg,48 h后行負壓吸引術;對照組:未服用任何藥物,直接采用常規負壓吸引術終止妊娠。分別留取4組吸宮術后的新鮮絨毛組織。

1.3.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1檢測

1.3.2.1 主要試劑及儀器:兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1(武漢博士德生物技術有限公司)、SP9001試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。水浴箱201-0(天津泰斯特儀器有限公司),普通光學顯微鏡(日本Olympus光學工業株式公司),Nikon尼康全自動顯微照相機(日本株式會社尼康),Motic Med 6.0數碼醫學圖象分析系統(廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司)。

1.3.2.2 免疫組化染色方法檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達情況:術中所取組織切片脫蠟至水;磷酸緩沖液(PBS)清洗;3%甲醇-雙氧水孵育;枸櫞酸鹽微波抗原修復;10%正常山羊血清37℃下孵育10 min;滴加一抗(兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1),4℃冰箱過夜;滴加生物素標記的二抗工作液(MMP-2、MMP-9、TIMP-1為山羊抗兔IgG); DAB顯色劑顯色,陽性顯色為棕黃色;蘇木素復染,1%鹽酸分化,氨水返藍;脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;每次染色均同步設有陽性和陰性對照。

1.3.2.3 免疫組化結果判斷:細胞質或細胞膜有明顯棕黃色顆粒沉著為陽性表達, Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統處理,測得陽性細胞染色的平均光密度(OD)值來表示抗原表達量。

1.4 觀察指標 (1) 4組臨床基本資料:包括年齡、停經天數及胎囊大小。(2) 4組絨毛組織形態學觀察:分析對照組、12 h組、24 h組、48 h組絨毛組織形態學。(3)分析4組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值差異。(4)比較4組絨毛組織MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1、TIMP-1表達情況。

2 結果

2.1 絨毛組織形態學觀察 早孕絨毛組織由外向內分別為合體滋養細胞、細胞滋養細胞及間質中心索。合體滋養細胞核大深染而不規則,游離緣呈刷毛樣,細胞滋養細胞邊界清晰,單核,絨毛間質疏松。3個用藥組絨毛組織均出現一定程度的變性、壞死,絨毛間質擴張水腫,合體滋養細胞胞漿減少呈多空泡,核固縮,深染等退變。細胞滋養細胞正?；蜃兓p微:細胞界限不清,核固縮,著色不良。見圖1。

對照組 12 h組 24 h組 48 h組

2.2 4組絨毛組織MMPs/TIMPs OD值比較 12 h組、24 h組、48 h組的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在絨毛組織的陽性目標OD值均明顯高于對照組[(12 h組vs對照組t=2.5690、20.8139、19.6514,P=0.0142、0.0000、0.0000)、(24 h組vs對照組t=2.7901、17.8057、16.5854,P=0.0082、0.0000、0.0000)、(48 h組vs對照組t=2.8076、17.6131、25.9878,P=0.0078、0.0000、0.0000)];12 h組、24 h組、48 h組之間的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在絨毛組織的陽性目標OD值比較均無統計學意義[(12 h組vs 24 h組t=1.7595、0.5199、0.8165,P=0.0865、0.6061、0.4193)、(12 hvs 48 h組t=1.9417、1.7879、1.9029,P=0.0596、0.0818、0.0647)、(24 h組vs 48 h組t=0.1054、1.2117、0.6989,P=0.9166、0.2331、0.4888)];12 h組、24 h組、48 h組TIMP-1在絨毛組織的OD值均明顯低于對照組(t=6.1648、6.5872、8.3553,P=0.0000、0.0000、0.0000),12 h組、24 h組、48 h組之間TIMP-1的OD值差異均無統計學意義[(12 h組vs 24 h組t=0.0000,P=1.0000)、(12 h組vs 48 h組t=1.7594,P=0.0866)、(24 h組vs 48 h組t=1.7594,P=0.0866)]。見表2。

表2 4組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值 n=20,

2.3 4組絨毛組織MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1表達情況 MMP-2、MMP-9、TIMP-1均為胞漿表達,在12 h組、24 h組、48 h組的MMP-2、MMP-9、TIMP-1細胞滋養細胞、合體滋養細胞胞漿內和胞膜較對照組呈強陽性表達,表現為棕黃色物質在細胞胞漿內呈網狀分布,其中各用藥組之間無明顯差異;對照組中TIMP-1的表達高于12 h組、24 h組、48 h組,各用藥組之間無明顯差異。見圖2。

對照組MMP-2的表達 對照組MMP-9的表達 對照組TIMP-1的表達

3 討論

早前,有學者就曾進行縮短米非司酮與米索前列醇用藥間隔的研究[4,5]。近年來,臨床資料表明縮短兩種藥物的用藥間隔在臨床上具有可行性:一項回顧性隊列研究表明,米非司酮-米索前列醇間隔時間<12 h組,12～24 h組,24～48 h組在服用米索前列醇后至排出妊娠產物的臨床誘導時間相似(P>0.05)[6];Flynn等[7]通過對隨機試驗資料進行探索性二次分析表明,用藥間隔時間在7～20 h完全流產率最高,達到96.6%,遠高于0～6 h組及21～48 h組(P<0.01)。

米非司酮作為一種孕激素拮抗劑,可引起蛻膜絨毛組織變性壞死,誘發流產[8]。有關米非司酮的作用機制涉及到多個方面,其中,基質金屬蛋白酶系統(MMPs)可通過降解細胞外基質,參與胚泡植入的生理過程,且與基質金屬蛋白酶組織抑制途徑因子系統(T1MPs)一起調控著滋養層細胞的浸潤程度[9],妊娠早期絨毛滋養細胞可通過分泌MMP-2、MMP-9,促進胎盤滋養細胞入侵子宮內膜基質,TIMPs(如TIMP-1,TIMP-2) 能夠抑制 MMPs 的產生和活性,一定程度上維持二者平衡,保證胚胎形成和妊娠維持[10]。Nissi 等[11]通過測定129例正常妊娠以及89例早期自然流產患者血清中MMPs的表達發現,MMP-2、MMP-9水平升高可能在早期自然流產中發揮作用。施林領等[12]報道了稽留流產及復發性流產的發生可能與絨毛組織中MMP-9的表達升高、MMP-9/TIMP-1的失衡有關,說明MMPs/TIMPs平衡的精準調控在正常妊娠中發揮著重要作用。另據蔣艷麗等[13-15]研究發現,MMPs蛋白表達情況與早發性子癇前期的胎盤滋養細胞侵襲有關,而MMPs高表達,可能與Wnt/β-catenin信號通路、絨毛組織中IκB蛋白降解及活化NF-κB有關,或與MMP-9表達水平下降、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3表達水平增加引起的MMPs/TIMPs失衡有關,很容易增加流產風險。

本研究發現各用藥組MMP-2、MMP-9的表達及MMP-9/TIMP-1比值較對照組明顯升高(P<0.05),提示米非司酮可通過提高MMP-2、MMP-9的活性,抑制TIMP-1的調節作用,打破MMPs/TIMPs平衡,滋養細胞過度浸潤,子宮內膜細胞外基質降解,宮頸組織水解剝脫,誘發流產[16]。在3個用藥組之間,MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達及MMP-9/TIMP-1表達并無明顯差異,說明服用米非司酮后12 h對絨毛組織即發揮作用,從而達到抗早孕的目的。

綜上所述,米非司酮作用后最早12 h就已對早孕絨毛組織產生影響,證明將米非司酮與米索前列醇用藥間隔縮短至12 h的服用方法理論上是可行的,這極大地縮短了藥物流產時間。有學者Meta分析得出結論,兩種藥物同時應用也能維持早期妊娠藥物流產的臨床效果[17];由此,我們大膽設想女性甚至可根據自己的需求在一定時間范圍內自行掌握兩藥的時間間隔,從而接受更加便利及個體化的流產方案。