柚皮素對胰腺癌細胞PANC-1增殖和凋亡的影響

夏瑩 王世全 路偉

胰腺癌是目前死亡率較高,生存期較短的惡性腫瘤之一。胰腺癌在我國屬于高發性疾病,發病率為7/10萬,然而胰腺癌的發病率仍逐年上升[1]。胰腺癌早期癥狀不明顯,有癥狀出現時多為中晚期,加之胰腺所處的位置關系,治療效果一直不佳。胰腺癌的5年生存率非常低,大約在5%[2]。近年來由于治療技術的發展,對胰腺癌的治療取得了一定的效果,但胰腺癌5年生存率仍是癌癥中最低的。因此,尋找新的治療藥物及方法對提升胰腺癌患者生存率有重要意義。從天然藥物中篩選治療胰腺癌的有效成分是目前重要的研究方向,柚皮素(Naringenin,NA)分子量為272,是一種天然黃酮類化合物,具有多種生物活性和藥理作用。有研究發現,NA可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等[3],有文獻報道NA可以抑制胰腺癌細胞的浸潤[4],但對胰腺細胞增殖和凋亡是否有影響,以及可能的機制需要進一步驗證。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β) 是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶。GSK-3β能調節細胞分化、增殖、存活和凋亡[5]。胰腺癌細胞中高表達GSK-3β[6]。因此,本實驗探討NA對人胰腺細胞PANC-1細胞活力、增值及凋亡的影響,以及GSK-3β在其中的作用,為臨床應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料 PANC-1 細胞(西京醫院消化病醫院保存),胎牛血清(澳大利亞),NA(sigma,美國),96孔板及24孔板(Costar,美國);總蛋白提取試劑盒,BCA蛋白定量試劑盒(康維試劑,中國);CCK 8試劑盒(七星,中國);兔源Ki-67、Cleaved caspase-3、GSK-3β、p-GSK-3β 和GAPDH一抗(abcam,英國);HRP標記的山羊抗兔二抗(GenTex,美國);Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒(四季青生物,中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:PANC-1細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養基中培養,第3天進行傳代培養。

1.2.2 慢病毒轉染:根據上海吉凱生物公司慢病毒手冊,在1 ml培養液中加入6 mg/ml 聚凝胺1 μl,在含有聚凝胺的培養液中加入對照慢病毒(上海吉凱生物,貨號:GIDV0210639)或GSK-3β過表達慢病毒(上海吉凱生物,貨號:GIDV0210640);轉染12 h后更換為正常培養基,72 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞GFP的表達,并分析病毒轉染效率,然后凍存備用。

1.2.3 藥物配制:用微量二甲基亞砜將NA全部溶解,使得NA的濃度為100 μmol/ml,然后將液體作為原液儲存于-20℃冰箱中,用前用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液將儲存液稀釋到實驗所需濃度。

1.2.4 實驗分組:將PANC-1細胞分為0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L組,分別用0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L的NA處理PANC-1細胞,進行后續檢測。

1.2.5 CCK-8檢測細胞活性:5組細胞分別在24 h、48 h和72 h,每個濃度4個復孔,每孔中加入10 μl的CCK 8試劑。37℃繼續溫育4 h后酶標儀450 nm 測定細胞活性。

1.2.6 細胞計數:在0 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組,每組4孔,培養48 h后,胰酶消化,收集細胞,細胞計數儀計數,計算細胞增值倍數。

1.2.7 蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達:RIPA裂解液提取各組細胞蛋白,每組4孔,BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白進行聚丙稀酰胺凝膠電泳,按濕轉法將電泳產物轉移到PVDF膜。5%的胎牛血清白蛋白常溫封閉1 h,分別加入一抗Ki-67、GSK-3β、p-GSK-3β、Cleaved caspase-1和GAPDH,4℃孵育過夜;辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加發光液(Milipore,貨號:wbklso500)凝膠成像儀采集圖像。

1.2.8 RT-PCR GSK-3β引物序列為:上游5’-AGTGGTGAGAAGAAAGATGAG-3’,下游3’-TGACATAAATCACAGGGAG-5’,具體操作步驟按照SYBR定量熒光PCR試劑盒進行操作。

1.2.9 流式細胞儀Annexin V-PI雙染檢測細胞凋亡:使用0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、control virus和GSK-3β,培養48 h后,使用胰酶消化,在4℃離心機中1 000 r/min離心10 min,收集細胞;然后加入100 μl Binding Buffer重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI,混勻;室溫避光孵育15 min,流式細胞檢測。

2 結果

2.1 NA對PANC-1細胞活力的影響 CCK-8檢測NA對胰腺癌PANC-1細胞的活力的影響,結果顯示100～400 μmol/L的NA均對PANC-1細胞的活力有抑制作用,隨著濃素的增加抑制作用越來越明顯,且100～200 μmol/L時抑制率變化最大(P<0.05),在200 μmol/L時抑制效果最明顯;當NA濃度從200 μmol/L增加至400 μmol/L時,NA對PANC-1細胞的抑制作用未發生明顯變化(P>0.05)。同一濃度隨時間的延長抑制效果越明顯,48 h時抑制效果最好(P<0.05),72 h的抑制效果與48 h無差異(P>0.05)。表明NA對PANC-1細胞活力的抑制作用在100～200 μmol/L時存在明顯濃度依賴性,濃度越大抑制作用越強;且NA對PANC-1細胞活力的抑制作用在0～48 h時存在時間依賴性,時間越長,抑制越明顯。見表1。

表1 NA對細胞活性的影響 n=4,%,

2.2 NA對PANC-1細胞增值的影響 根據以上預實驗結果,選擇濃度為0、100、200、400 μmol/L 的NA對PANC-1細胞作用48 h,觀察細胞增值倍數和細胞增殖相關蛋白Ki-67的表達量。

2.2.1 與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細胞的增殖倍數明線降低(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細胞的增殖倍數進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細胞增殖倍數差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 NA對細胞增值的影響 n=4,

2.2.2 免疫熒光法檢測ki-67陽性細胞數量,Westeerm blot 法檢測Ki-67 蛋白表達水平,結果顯示:與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol組ki-67陽性細胞數量和Ki-67蛋白表達水平降低(P<0.05);與100 μmol/L組相比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組ki-67陽性細胞數量和Ki-67蛋白的表達水平進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組表達無明顯變化(P>0.05)。見圖1,表3。

圖1 NA對Ki-67陽性細胞數量及Ki-67表達水平的影響;A ki-67代表;B PANC-1細胞Ki-67相對表達量

表3 NA對Ki-67陽性細胞數及表達量的影響 n=4,

2.3 NA對PANC-1細胞凋亡的影響 流式細胞技術測定0、100、200、400 μmol/L 的NA對PANC-1細胞作用48 h用各組細胞凋亡百分比。結果顯示:與0 μmol/L組相比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組細胞凋亡百分比增加(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組細胞凋亡百分比進一步增加(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組無顯著變化(P>0.05)。Westerm blot法檢測Cleaved caspae-3的含量,結果顯示:100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組Cleaved caspase-3的含量增加,且均與0 μmol/L比較有統計學意義(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組Cleaved caspase-3的含量增加(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組間無差異(P>0.05)。見表4,圖2。

圖2 流式細胞術檢測不同組PANC-1細胞凋亡及cleaved caspase-3表達水平; A 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡比例分布;B PANC-1細胞中Cleaved caspase-3相對表達量

表4 NA對PANC-1細胞細胞凋亡的影響 n=4,

2.4 NA對PANC-1細胞GSK-3β含量及活性的影響 Westerm blot方檢測GSK-3β和p-GSK-3β的表達水平，RT-PCR檢測GSK-3β mRNA的表達水平,結果顯示:與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組GSK-3β、p-GSK-3β和GSK-3β mRNA的表達水平降低(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組GSK-3β、p-GSK-3β和GSK-3βmRNA的表達水平進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組間表達無明顯變化(P>0.05)。見圖3,表5。

圖3 PANC-1細胞中p-GSK-3β和GSK-3β的表達水平

表5 NA對PANC-1細胞GSK-3β的影響n=4,

2.5 過表達GSK-3β對NA抑制PANC-1細胞增殖和促進細胞凋亡的影響 根據以上結果,選擇200 μmol/L/L NA進行以下實驗,進一步驗證GSK-3β在NA促進PANC-1凋亡中的作用。結果顯示:與control virus比較,過表達PANC-1細胞中的GSK-3β可以部分逆轉NA對PANC-1細胞的作用,表現為Ki-67陽性細胞百分比增加(P<0.05);Ki-67蛋白表達量增加(P<0.05),細胞凋亡百分比降低(P<0.05);Cleaved caspase-3表達水平下降(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 過表達GSK-3β對NA作用的影響;A PANC-1細胞中Ki-67和Cleaved caspase-3的表達水平;B 流失細胞術檢測不同組PANC-1細胞凋亡;C ki-67典型代表

表6 過表達GSK-3β對NA作用的影響 n=4,

3 討論

胰腺癌癥狀不明確、診斷手段有限,胰腺癌的5年生存率非常低。造成的主要原因是胰腺癌細胞的多重耐藥性。聯合用藥是解決耐藥性的主要方法,然而聯合用藥可以增加藥物毒性及不良反應。中藥單體是從中藥材中提取出的天然化合物,具有安全性高、毒性低的特點。其分子結構清晰,生物活性好,藥理作用相對明顯,且研究證實中藥單體在抗腫瘤細胞耐藥性方面發揮著重要作用[7]。NA是從中藥中提取的一種天然有機化合物,分子式為C15H12O5,具有多種生物學功效[8]。NA具有抗胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌的作用。主要分子機制包括抑制MMP-2、MMP-9、磷酸化AKT、MAPKs/AP-1以及Ikks/IκB/NF-κB等;激活caspase-3、PARP以及DR5等[9]。有研究證實NA可以通過TGF-B1/Smad3通路抑制胰腺癌細胞的遷移[10]。本實驗表明,100～400 μmol/L的NA均可降低PANC-1細胞的活力,抑制增殖,同時促進胰腺癌細胞凋亡的作用,在100～200 μmol/L有濃度依耐性,在200～400 μmol/L沒有濃度依耐性。相同濃度下,48 h的抑制率比24 h強,表明NA的作用具有時間依耐性;而在同一濃度下48 h的抑制率和72 h間無明顯差異。導致這種NA作用時間和濃度特點可能和NA在細胞的轉運方式是ATP依賴的被動轉運方式有關。

在有氧或無氧條件下,癌細胞比正常細胞代謝更多的糖并轉化為乳酸,為大分子的合成提供物質基礎,也可以促進腫瘤細胞對周圍正常組織的侵襲。糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,大約有100個已知靶點,不僅參與調控糖代謝還參與調控多種細胞途徑,包括正常細胞的內環境穩態,也可以促進腫瘤的發展、侵襲和轉移[11]。GSK-3有兩種亞型:GSK-3α和GSK-3β。兩種亞型在組織中的分布不同,GSK-3α在神經系統、卵巢和皮膚中低表達,而在網織紅細胞和闌尾中高表達。GSK-3β在網織紅細胞、淋巴結和胰腺組織中低表達,而在NK細胞和骨髓粒細胞中高表達。有文獻證實GSK-3β在胰腺癌的發展過程中表達量逐漸增加,并在腫瘤侵襲和對化療耐受方面發揮重要作用[12]。GSK-3β通過自身磷酸化來調控其活性,在216和279位點酪氨酸磷酸化可以增加其活性。在胰腺癌細胞種216位點酪氨酸磷酸化水平增高。GSK-3β可以促進STAT3的磷酸化從而增加NFATc2-STAT3復合物,調控細胞增殖相關基因表達促進癌細胞增殖[13]。GSK-3β抑制劑可以降低GLI1組織G1到S期的轉換抑制胰腺癌細胞增殖。GSK-3β不但促進胰腺癌細胞增殖外,還可以通過磷酸化MDM2抑制細胞凋亡[14]。本實驗證實NA可以降低GSK-3β的蛋白含量和mRNA表達水平,同時可以降低216位點磷酸化GSK-3β的表達,說明NA不但降低胰腺癌細胞PANC-1種GSK-3β的含量也降低GSK-3β的活性。進一步用慢病毒過表達PANC-1細胞中GSK-3β,發現NA對PANC-1細胞增殖和凋亡的影響減弱。

綜上所述,NA通過降低GSK-3β的表達及活性抑制PANC-1細胞增殖,促進凋亡。