野生越南槐組織特異性內生真菌組及體外抗病原菌功能

姚裕群 蘭可 黃榮韶 吳炫柯

摘 要：? 有益微生物組能幫助宿主植物防御病害。越南槐的根、莖和種子在野外環境下健康發芽生長，而栽培越南槐各組織極易感病。為了探明利用野生越南槐有益內生真菌組防治宿主病害的可能，該文在分離健康野生越南槐根、莖和種子內生真菌的基礎上，并結合形態學和ITS序列特征鑒定內生真菌，通過系統發育樹、α-多樣性指數和β-多樣性指數分別分析各內生真菌組的系統進化、多樣性和相似性，通過瓊脂塊法和平板對峙法測試內生真菌組的體外抗病原菌功能。結果表明：（1）從越南槐根、莖和種子內生真菌組分別分離鑒定131株23個分類單元、108株23個分類單元、64株11個分類單元；（2）特有屬多且所有種均為特有種顯示根、莖和種子內生真菌組在屬種進化上具有組織特異性；（3）根-莖/根-種子/莖-種子間極低的β-多樣性顯示根、莖和種子各內生真菌組間的物種相似性極低；（4）高的α-多樣性顯示越南槐根、莖和種子均有豐富多樣的內生真菌組；（5）各內生真菌組三分之一以上的分類單元在體外均能拮抗供試病原菌，根莖內生真菌組顯示了強廣譜的體外抗病原細/真菌功能，種子內生真菌組顯示了強廣譜的體外抗病原真菌功能。該研究結果表明健康野生越南槐根、莖和種子內部均存在有益內生真菌組，其具有生物多樣性、組織特異性以及強廣譜的體外抗病原菌功能，在宿主各組織的抗病性方面可能發揮重要作用。這些結果將為進一步利用有益真菌組防治栽培越南槐各組織病害提供了材料和實驗基礎。

關鍵詞： 野生越南槐， 有益內生真菌組， 生物多樣性， 組織特異性， 抗病功能

中圖分類號：? Q939

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1182-11

收稿日期：? 2022-06-16

基金項目：? 國家自然科學基金（81860671）； 廣西自然科學基金（2018GXNSFAA281120）； 2020年廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2020KY08012）； 廣西科技大學博士基金（18Z16）。

第一作者： 姚裕群（1979-），博士，副研究員，主要研究藥用植物內生真菌-宿主互作機制，（E-mail）yaoyuqun2005@126.com。

通信作者：? 吳炫柯，碩士，高級工程師，研究方向為應用氣象，（E-mail）wuxuanke@163.com。

Tissue-specificity and pathogen-resistant function

in vitro of endophytic fungal microbiome harbored

in Sophora tonkinensis from wild type

YAO Yuqun1， LAN Ke1， HUANG Rongshao3， WU Xuanke2*

（ 1. College of Medicine， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， Guangxi， China; 2. Liuzhou Agricultural Meteorological

Experimental Station， Liuzhou 545003， Guangxi， China; 3. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China ）

Abstract：? The beneficial microbiome assist the plant in disease defense. The root， stem and seed of Sophora tonkinensis from wild type were germinated and grew healthily， but they in cultivated type were susceptible to insect and pathogen attack. In order to explore the possibility of disease control using beneficial endophytic fungal microbiome harbored in S. tonkinensis from healthy wild type， endophytic fungi were isolated from the root， stem and seed of S. tonkinensis from healthy wild type， and then were further identified based on morphological characters and ITS sequence characters. Phylogenetic tree， α-diversity index and β-diversity index were used to analyze the phylogenetic evolution， diversity and similarity among different endophytic fungal microbiomes. The pathogen-resistant function in vitro of endophytic fungal microbiome was determined by the agar plug method and flat-stand method. The results were as follows： （1） A total of 131 strains with 23 taxa， 108 strains with 23 taxa， and 64 strains with 11 taxa， were respectively isolated and identified from the root， stem and seed of S. tonkinensis; （2） More endemic genera and all endemic species， indicated that endophytic fungal microbiomes harbored in the root， stem and seed had tissue specificity in genus and species evolutionary tree; （3） The extremely low β-diversity between root-stem， root-seed， and stem-seed indicated that species similarity was very low among different endophytic fungal microbiomes; （4） The high α-diversity showed that endophytic fungal microbiomes harbored in the root， stem and seed were abundant biodiversity; （5） More than one third of the taxa antagonized pathogens in vitro. Endophytic fungal microbiome harbored in the root/stem showed strong broad-spectrum pathogenic bacteria/fungi-resistant function in vitro， and endophytic fungal microbiome harbored in the seed showed strong broad-spectrum pathogenic fungi-resistant function in vitro. These results indicated beneficial endophytic fungal microbiome with tissue-specificity， biodiversity structure， and strong broad-spectrum pathogen-resistant function in vitro， harbored in healthy root， stem and seed of S. tonkinensis from wild type， and might play an important role in pathogen resistance in host tissues. Such results will provide material and experimental basis for disease control in different tissues of S. tonkinensis using beneficial endophytic fungal microbiome.

Key words： Sophora tonkinensis from wild type， beneficial endophytic fungal microbiome， biodiversity， tissue specificity， pathogen-resistant function

越南槐（Sophora tonkinensis）是廣西著名道地藥材山豆根的基源植物。山豆根藥材清熱解毒、消腫利咽，常用于治療濕熱黃疸、心率失常、膀胱癌等癥（國家藥典委員會，2020）；含有生物堿、黃酮、皂苷等多種化學成分，其中苦參堿和氧化苦參堿為其主要活性成分（Zhang et al.， 2020）；具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抑菌、保肝、調節免疫、降血壓等藥理學作用（彭成， 2011）。隨著健康大產業及鄉村振興的深入發展，越南槐在廣西百色、靖西、河池等地區推廣種植。課題組在越南槐的野生馴化及其推廣栽培中發現，栽培越南槐容易感染各種病害，其種子容易霉變影響發芽，根莖時常腐爛，發生炭疽潰瘍，引起條斑黑斑，從而影響藥材生長。而大量化學農藥的使用，容易導致藥材農藥、重金屬等超標，嚴重影響藥材安全（Gu et al.， 2013）。因此，發展綠色環保的越南槐病害防治策略對山豆根藥材的可持續利用和發展極其重要。植物有先天的免疫系統以響應病原微生物的分子機制及效應物（Jones & Dangl， 2006; Dangl et al.， 2013）。植物有益微生物組通過與植物先天免疫系統的互作（Hacquard et al.， 2017），使植物系統獲得相關抗病性（Pieterse et al.， 2014），對植物的健康有重要的作用（Berg et al.， 2016）。番茄根系微生物組研究發現，抗病與感病植株根系微生物組的結構、抗菌性功能有很大差異，抗病植株根系微生物組作為有益微生物組轉接到感病植株，能激活感病株的抗病性 （Kwak et al.， 2018）。植物微生物組包括真菌組和細菌組，根系微生物組主要來源于高度多樣性的土壤生物，受土壤類型、植物基因型、植物年齡等影響，莖和種子微生物主要來源于氣溶膠、昆蟲及根系的遷移（Hacquard et al.， 2017）。在植物-有益內生真菌組中，各內生真菌通過與宿主進行復雜而精細的互作以激活植物先天免疫系統使宿主獲得抗病性以拮抗病原和害蟲的入侵，甚至部分內生真菌自身就可以分泌毒性代謝物以拮抗病原菌的入侵（Kusari et al.， 2012; Compant et al.， 2019），因此有益內生真菌組有利于宿主防御病害。野生越南槐生長于海拔500～800 m石灰巖山區的石頭縫里，周圍植被類型多樣，局部小氣候復雜多變，在這樣的生境下，野生越南槐依然能健康發芽生長并形成獨特的藥性，此外，項目組前期研究工作發現越南槐各組織內有內生真菌（姚裕群，2017）。因此，我們推測獨特復雜的野外生境容易使越南槐根、莖和種子形成獨特而多樣性的有益內生真菌組，這些內生真菌組在拮抗病蟲害方面可能發揮重要作用。本研究以相同生長年限不同時期采集的野生越南槐根、莖和種子為研究對象，依托廣西科技大學重點實驗室、柳州市農業氣象試驗站，采用組織塊法分離內生真菌， 結合形態和ITS序列測序比對鑒定真菌，最大似然法構建內生真菌組系統發育樹，R軟件計算內生真菌組的α-多樣性指數、β-多樣性指數，分別采用瓊脂塊法和平板對峙法體外測定內生真菌組各分類單元對病原細菌、真菌的拮抗活性。通過分析野生越南槐根、莖和種子內生真菌組的屬種系統發育、α-多樣性、β-多樣性及體外抗病原菌功能，擬探討以下問題：（1）野生越南槐根、莖和種子各有益內生真菌組在屬種系統發育上是否有差異；（2）野生越南槐根、莖和種子各有益內生真菌組的多樣性和相似性如何；（3）野生越南槐根、莖和種子各有益內生真菌組體外是否具有抗病功能。本研究結果擬為探索利用野生越南槐各有益真菌組防治栽培越南槐各組織病害提供材料及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥用植物 供試8株野生越南槐（Sophora tonkinensis），4年生，株高約2 m，根直徑約1 cm， 莖直徑約1.5 cm，種子大小均勻飽滿約（0.5 cm × 0.3 cm～1 cm × 0.8 cm，根莖采集期分別為2020年3月、8月、11月，不同成熟度種子采集期分別為2020年7月、8月、9月，均采自靖西市誠良村山上（106°25′26″ E、23°08′49″ N）。采集的越南槐根、莖和種子，分別裝袋、貼上標簽并立即運往廣西科技大學生物化學與分子生物學實驗室，并在24 h內處理樣品。

1.1.2 供試病原菌 供試病原細菌為細菌性軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum）、細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、細菌性潰瘍病菌（X. campestris pv. citri）；供試病原真菌為根腐病菌（Fusarium solani）、炭疽病菌（Colletotriehum gloeosporioides）、黑斑病菌（Alternaria panax）。以上菌株均保藏在廣西科技大學基礎醫學部。

1.1.3 培養基、試劑與測序 馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基、玉米培養基、LA培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司，所有培養基在121 ℃，1 × 105 Pa 下濕熱滅菌20 min 備用；次氯酸鈉、甘油、酒精，均購自成都金山化學試劑有限公司；2xTagMasterMix，購自天根生化科技有限公司；引物ITS1/ITS4合成及PCR產物測序均由南京鐘鼎生物技術有限公司完成。

1.1.4 儀器與設備 生物安全柜（Thermo1376）、PCR擴增儀（BIO-RAD C1000）、凝膠成像系統（Bio-Best 200E）、生化培養箱（SPX-250）、超低溫冰箱（Thermo 902）、離心機（Sigma 3K15）、顯微鏡（Olympus IX83）、鼓風干燥箱（DHG-9030）、全自動高壓滅菌鍋（Tomy XS500）。

1.2 方法

1.2.1 根、莖和種子內生真菌的分離純化 將越南槐的新鮮健康根段、莖段和種子用流水徹底沖洗表面，晾干后移到超凈工作臺分別進行表面消毒，即75%酒精1 min，無菌水漂洗3次，5%次氯酸鈉1～6 min（根段/莖段，1～2 min; 種子，5～6 min）后，無菌水漂洗3次，無菌吸水紙吸干表面，根段/莖段分別去除兩端和表皮后切成1 cm × 0.5 cm大小的組織塊，種子分為種皮和胚，均轉接至1/2玉米粉培養基（含氯霉素和氨芐青霉素），并于25 ℃培養箱黑暗培養。待各組織邊緣長出菌絲后及時挑取單一菌絲至PDA培養基上，長出的菌落，如果外部形態不一致，繼續挑取單一菌絲直至長出外部形態一致的菌落。

1.2.2 根、莖和種子內生真菌的分類鑒定 根據菌落的組織來源、培養時間及外部形態，分別將根段、莖段和種子分離到的菌株劃分為不同的形態型，采用DNA分子標記鑒定每個形態型的代表菌株。采用通用引物對ITS1/ITS4，從代表菌株基因組DNA擴增ITS序列并測序（ITS1-5.8S rDNA-ITS2）。分別使用軟件 ClustalX 1.81 和 BioEdit v7.0分析測序序列，登錄GenBank數據庫比對，下載最相似（盡量選擇正式發表）序列，使用MEGA 6.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹，經Bootstrap 1 000 次循環檢驗系統樹的可靠性。在系統發育樹中，比對測序序列與參考序列之間的相似性，依據真菌鑒定的常用相關閾值鑒定真菌（O′Brien et al.， 2005；González & Tello， 2011），即相似性<95%為未鑒定，95%≤相似性<97%為鑒定到屬水平，相似性≥97%為鑒定到種水平，在屬內比較中，明顯高于其他種時則被鑒定為同種。

1.2.3 根、莖和種子各內生真菌組的系統進化 基于真菌分類單元的ITS序列，通過MEGA 6.0軟件，采用最大似然法（maximun likelihood）構建系統發育樹來分析野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的屬種系統進化（González & Tello， 2011）。

1.2.4 根、莖和種子各內生真菌組的多樣性和相似性 基于野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的分類單元及其分離株系分別計算各真菌組的α-多樣性指數［香農-維納指數（Shannon-Wiener index）和辛普森多樣性指數（Simpsons diversity index）］及β-多樣性指數［索倫森指數（Sorensens index）和雅卡爾指數（Jaccards index）］。通過α-多樣性指數來分析野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的多樣性，通過β-多樣性指數來分析野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組間的物種相似性（Yao et al.， 2017）。使用生物統計軟件SPSS 28.0，以及運用方差和多重比較以分析野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的多樣性差異。

1.2.5 根、莖和種子各內生真菌組的體外抗病原菌功能 挑選內生真菌組各分類單元的代表菌株用于體外抗病原菌功能篩選。采用瓊脂塊法（姚裕群等，2017）篩選供試內生真菌對病原細菌的拮抗活性，即將新鮮病原細菌調成0.5麥氏濁度的菌懸液并將其在15 min內用無菌棉簽均勻涂布于 LA培養基平板上，將6 mm直徑的內生真菌菌塊接入風干后的LA培養基篩選平板，每皿接5個菌塊， （35±2） ℃培養16～18 h后觀察并測量抑菌圈直徑；采用平板對峙法篩選（Yao et al.， 2017）供試內生真菌對病原真菌的拮抗活性，即將內生真菌和病原真菌均制成6 mm直徑菌塊，1塊內生真菌接種于PDA培養基中央且周圍等距接種3塊病原真菌為處理，以不接種內生真菌為對照，28 ℃下培養，待對照長至平板中央測量各病原菌塊中心至平板中央之間病原菌的生長量，并計算抑菌率。

抑菌率（%）=對照生長量－處理生長量對照生長量×100。

1.3 統計分析

基于野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的分類單元及其分離株系計算相對頻率（relative frequency，RF），α-多樣性指數（香農-維納指數和辛普森多樣性指數）及β-多樣性指數（索倫森指數和雅卡爾指數）（Yao et al.， 2017）。使用生物統計軟件SPSS 28.0，以及運用方差和多重比較以分析野生與培越南槐內生真菌組多樣性差異。

2 結果與分析

2.1 根、莖和種子內生真菌的分離和鑒定

從野生越南槐根段共計60個組織塊中分離獲得131株內生真菌（圖1）；從莖段60個組織塊共分離獲得108株內生真菌（圖2）；從40粒種子共分離獲得64株內生真菌（圖3）。首先將分離自根、莖和種子的菌株分開，然后將相同組織來源的菌株分別培養，將相同培養時間內菌落孢子形態一致的菌株劃分為同一形態型，最后采用ITS序列分析鑒定每個形態型的代表菌株。結合形態學和ITS序列分析，從根內生真菌組的42個形態型代表菌株中共鑒定23個分類單元，從莖內生真菌組的38個形態型代表菌株中共鑒定23個分類單元，從種子內生真菌組的20個形態型代表菌株中共鑒定11個分類單元且均來自于種皮。每個分類單元為一個特定的真菌物種，依據真菌物種鑒定的常用相關閾值（見方法部分）。根內生真菌組的23個分類單元（物種）中，11個分類單元鑒定到屬水平，10個分類單元鑒定到種水平，2個分類單元未鑒定；莖內生真菌組的23個分類單元（物種）中，9個分類單元鑒定到屬水平，11個分類單元鑒定到種水平， 3個分類單元未鑒定；種子內生真菌組的11個分類單元（物種）中，1個分類單元鑒定到屬水平，9個分類單元鑒定到種水平，1個分類單元未鑒定。相關數據已上傳GenBank數據庫，登錄號為KP204264-KP204442、KT935174及KR611926。

2.2 根、莖和種子各內生真菌組的系統進化

基于野生越南槐根內生真菌組23個分類單元，莖內生真菌組23個分類單元以及種子內生真菌組11個分類單元的ITS序列，采用最大似然法分別構建了野生越南槐根、莖、種子內生真菌組的系統發育樹（圖1，圖2，圖3）。在根內生真菌組的已鑒定分類單元中， 有12個屬10個種，其中有4個優勢屬，鐮刀菌屬（Fusarium）為最優勢屬，其次為莖點霉屬（Phoma）、 青霉屬（Penicillium）、Rhexocercosporidium；在莖內生真菌組的已鑒定分類單元中，有15個屬11個種，其中有4個優勢屬，分別為節孢霉屬（Arthrinium）、青霉屬、鐮刀菌屬、枝孢菌屬（Cladosporium），其中節孢霉屬為最優勢屬；在種子內生真菌組的已鑒定分類單元中，有6個屬9個種，其中有3個優勢屬，分別為炭疽菌屬（Colletotrichum）、枝孢菌屬和假尾孢菌屬（Pseudocercospora），其中炭疽菌屬為最優勢屬。根、莖和種子3個內生真菌組共有屬為2個，即青霉屬和枝孢菌屬，特有屬分別為10個、13個、4個，特有屬分別約為共有屬的5倍、7倍、2倍；根、莖和種子3個內生真菌組間共有種為0個，所有種均為特有種，特有種分別為10個、11個、9個。研究結果表明，在野生越南槐根、莖和種子內生真菌組中，共有屬少而特有屬多，且所有種均為特有種，各組織內生真菌組在屬種進化上具有組織特性。

2.3 根、莖和種子各內生真菌組的多樣性和相似性

基于越南槐根、莖和種子各內生真菌組的分類單元（物種）、分離株系及其共有分類單元（物種）（圖1，圖2，圖3）計算α-多樣性指數（香農-維納指數和辛普森多樣性指數）（表1）及β-多樣性指數（索倫森指數和雅卡爾指數）（表2），進一步比較野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的α-多樣性指數及β-多樣性指數。越南槐根、莖和種子各內生真菌組的α-多樣性指數結果如表1所示，比較其他藥用植物組織內生真菌組（González & Tello， 2011; 李玲玲，2021），野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組的物種多樣性指數均較大，表明野生越南槐根、莖和種子內均有較豐富多樣的內生真菌組，而根莖內生真菌組的α-多樣性指數顯著高于種子內生真菌組，表明越南槐根莖內生真菌組的物種多樣性顯著高于種子內生真菌組；越南槐根、莖和種子各內生真菌組間的β-多樣性指數如表2所示，即索倫森指數和雅卡爾指數在0～0.148之間，基于相似性系數原理，當β-多樣性指數介于0～0.25時為極不相似，0.25～0.50為中等不相似，0.50～0.75為中等相似，0.75～1.00為極為相似，研究結果表明野生越南槐根、莖和種子各內生真菌組間的物種相似性極低。

2.4 根、莖和種子各內生真菌組的體外抗病原菌功能

3種病原細菌（細菌性軟腐病菌、細菌性條斑病菌、細菌性潰瘍病菌）和3種病原真菌（根腐病菌、炭疽病菌、黑斑病菌）能廣泛引起植物根、莖和種子的相應病害，因此以這6種病原菌為靶標菌測試越南槐根、莖和種子各內生真菌組的體外抗病原菌功能。

以上述3種病原細菌為靶標菌，對越南槐根、莖和種子各內生真菌組的分類單元（分別為23個、23個、11個）進行體外抗病原細菌活性測定。由表3可知， 在野生越南槐根內生真菌組中，有3個分類單元 （13%）對靶標菌有不同程度的抑制作用，其中2個分類單元對細菌性軟腐病菌有抑菌圈且抑菌圈直徑均等于陽性對照，3個分類單元對細菌性條斑病菌有抑菌圈且抑菌圈直徑均大于或等于陽性對照，3個分類單元對細菌性潰瘍病菌有抑菌圈，1個分類單元的抑菌圈直徑等于陽性對照，2個分類單元對3種靶標菌均有抑菌圈，尤其是分類單元黑僵菌（Metarhizium anisopliae）對3種靶標菌的抑菌圈直徑均等于陽性對照； 在野生越南槐莖內生真菌組中， 有2個分類單元（9%）對靶標菌有不同程度的抑制作用，其中分類單元Bionectria sp.對3種靶標菌的抑菌圈直徑均大于或等于陽性對照；在野生越南槐種子內生真菌組中，沒有發現抑制靶標病原細菌的分類單元。

以上述3種病原真菌為靶標菌，對越南槐根、莖和種子各內生真菌組的分類單元（分別為23個、23個、11個）進行體外抗病原真菌活性測定。由表4可知，在野生越南槐根內生真菌組中，有9個分類單元（39%）對靶標菌均有不同程度的抑制作用， 其中8個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%， 9個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，5個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，茄鐮孢菌（Fusarium solani）、可可球二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉（P. herbarum）5個分類單元對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強的拮抗活性；在野生越南槐莖內生真菌組中，有9個分類單元（39%）對靶標菌均有不同程度的抑制作用，其中4個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%，7個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，1個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，分類單元尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強的拮抗活性；在野生越南槐種子內生真菌組中，有4個分類單元（36%）對靶標菌均有不同程度的抑制作用，其中2個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%，3個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，1個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，分類單元海水仙炭疽菌（Colletotrichum hymenocallidis）對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強的拮抗活性。

體外抗病原菌功能測定結果（表3，表4）顯示，野生越南槐根內生真菌組具有豐富的抗病原菌分類單元（10個，43%），體外對6種病原細/真菌均顯示了強廣譜的拮抗活性，尤其是黑僵菌、茄鐮孢菌、可可球二孢菌、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉6個分類單元對3種以上病原細/真菌均具強廣譜的拮抗活性；野生越南槐莖內生真菌組也具有豐富的抗病原菌分類單元（10個，43%），體外對6種病原細/真菌也均顯示了強廣譜的拮抗活性，尤其是Bionectria sp.、尖孢鐮刀菌2個分類單元對3種以上病原細/真菌均具強廣譜的拮抗活性；野生越南槐種子內生真菌組同樣具有豐富的抗病原菌分類單元（4個，36%），體外對靶標病原細菌沒有拮抗活性，但對3種病原真菌均顯示了強廣譜的拮抗活性，尤其是分類單元海水仙炭疽菌對3種病原真菌均具強廣譜的拮抗活性。研究結果表明，野生越南槐根莖內生真菌組體外均能有效拮抗病原細/真菌，具強廣譜的體外抗病原細/真菌功能，而野生越南槐種子內生真菌組體外均能有效拮抗病原真菌，具強廣譜的體外抗病原真菌功能。

3 討論與結論

植物的每個組織都定殖有不同而多樣的內生真菌組，內生真菌組與宿主植物協同進化、互惠共生 （Gogarten & Townsend， 2005）。在內生真菌組與宿主植物的互作過程中，基于“獲得性免疫”理論，部分內生真菌能激活植物的天然免疫系統使宿主植物獲得免疫活性以拮抗害蟲和抗病微生物（Arnold et al.， 2003）；基于“馬賽效應”，部分內生真菌通過內生真菌-宿主/內生真菌-內生真菌間的互作在宿主植物組織里合成多樣性的化學成分以保護宿主（Carroll， 1991）；基于“平衡協作”學說，部分內生真菌能幫助宿主直接拮抗病原菌（Kusari et al.， 2012; 李玲玲， 2021）。已有研究結果表明，內生真菌組在植物宿主的抗病中發揮著重要的作用。課題組在越南槐的栽培推廣中發現，栽培越南槐的根、莖和種子非常容易發病，而野生越南槐各組織則極少發病，且越南槐各組織內有內生真菌（姚裕群， 2017; Yao et al.， 2017）?；趦壬婢M及越南槐的前期研究工作，推測生長于廣西石灰巖山區獨特生境的越南槐根、莖和種子內部可能存在獨特的有益內生真菌組，這些獨特內生真菌組在野生藥材抗病性方面可能發揮著重要的作用。宿主生長年限、生長季節、生長環境及組織類型也顯著影響內生真菌組的系統進化、多樣性及功能（Mishra et al.， 2012; Nascimento et al.， 2015）。為了避免生長年限和生長季節對內生真菌組的影響，研究獨特生境下越南槐根、莖和種子內生真菌組的系統發育、多樣性及抗病潛力，進而有效利用獨特生境野生越南槐各組織有益內生真菌組防治其宿主栽培越南槐病害，本研究分三個時期分別從相同生長年限/相同發育期的野生越南槐根莖/種子分離鑒定內生真菌，分析各組織內生真菌組的系統發育、多樣性、相似性和體外抗病原菌功能，探明野生越南槐各組織內生真菌組作為有益微生物組防治栽培宿主病害的潛力。

α-多樣性表明野生越南槐根、莖和種子內均存在分類單元較豐富多樣的內生真菌組。根莖內生真菌組的α-多樣性顯著高于種子可能由于根莖的生長時期遠大于種子，研究結果與前人研究基本一致（González & Tello， 2011；Nascimento et al.， 2015; 李玲玲， 2021）?；凇矮@得性免疫”理論，越南槐根、莖和種子內生真菌組的分類單元越豐富越有助于激活宿主各組織的天然免疫系統，使宿主各組織獲得拮抗多種病原的免疫活性；基于“馬賽效應”，分類單元多樣的越南槐根、莖和種子內生真菌組通過多樣的分類單元-宿主/分類單元-分類單元互作而有益于在宿主各組織內合成多樣性的化學成分以保護宿主各組織免受多種病原侵害。因此，基于“獲得性免疫”理論和“馬賽效應”，豐富多樣的野生越南槐根、莖和種子內生真菌組有益于幫助宿主各組織防御病害。聚類分析和低的β-多樣性進一步表明，越南槐根、莖和種子內生真菌組在屬種的發育上差異大，表明越南槐各組織內存在不同的內生真菌組，內生真菌組具有組織特異性，組織特異性的內生真菌組在與特異組織的互作中，可能幫助宿主組織拮抗特異的病原。內生真菌組的體外抗病功能分析發現，在越南槐根、莖和種子的內生真菌組中均有三分之一以上的分類單元具有體外抗病原菌活性，這些抗病原菌活性分類單元，尤其是強廣譜抗病原菌活性分類單元，如根內生真菌組分類單元黑僵菌、茄鐮孢菌、可可球二孢菌、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉，莖內生真菌組分類單元Bionectria sp.、尖孢鐮刀菌，種子內生真菌組分類單元海水仙炭疽菌，可能直接參與拮抗宿主各組織病原菌的入侵。根、莖和種子3個內生真菌組共有青霉屬、枝孢菌屬這2個屬，共有屬可能在幫助宿主越南槐根、莖和種子拮抗共同病害方面發揮作用。根-莖/莖-種子間均有共同的分類單元，推測各組織內生真菌組間可能存在菌株交流。

番茄抗病植株根系微生物組中的優勢屬，雖然在體外不能抑制病原菌，但是接種番茄后能激活宿主的天然免疫系統而強烈抑制病原菌引起的番茄枯萎?。↘wak et al.， 2018）?？梢娢⑸锝M中的優勢屬在幫助宿主獲得抗病活性方面發揮著重要作用。本研究中，野生越南槐各組織的內生真菌組均存在特定的優勢屬，如根內生真菌組中的優勢屬鐮刀菌屬、莖點霉屬、青霉屬、Rhexocercosporidium，莖內生真菌組中的優勢屬節孢霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬、枝孢菌屬，種子內生真菌組中的優勢屬炭疽菌屬、枝孢菌屬、假尾孢菌屬，特別是這些優勢屬的部分分類單元還具有病原菌拮抗活性，這些優勢屬定殖根、莖和種子后可能激活其天然免疫系統，使宿主組織能拮抗各病原菌引起的相關病害，由此推測越南槐根、莖和種子內生真菌組內的這些優勢屬在保護宿主各組織拮抗病害方面可能發揮著重要作用。此外，雖然野生越南槐種子內生真菌組檢測不到病原細菌的體外拮抗活性，但其優勢屬定殖種子后仍可能激活宿主使其獲得拮抗病原細菌的免疫活性。

野生越南槐根、莖和種子內均有較豐富的內生真菌組，這些內生真菌組具有生物多樣性、組織特異性以及強廣譜的體外抗病原菌功能，作為有益微生物組在宿主各組織的抗病性方面可能發揮重要作用。

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（責任編輯 周翠鳴）