粗山羊草種質遺傳多樣性及群體結構的ISSR分析

魏颯 張?；? 王玉泉 吳曉軍 胡喜貴 茹振鋼

摘 要：? 粗山羊草分布范圍廣，遺傳變異豐富，被認為是改良普通小麥的重要基因源。為深入了解不同來源粗山羊草種質的遺傳多樣性和群體結構，該研究利用ISSR分子標記對56份粗山羊草種質進行了遺傳多樣性和群體結構分析。結果表明：（1）16個ISSR引物共檢測170條多態性位點，每個ISSR引物多態性位點為3～18條，平均為10.63條；多態性信息（PIC）變異范圍為0.17～0.85，平均為0.67。（2）粗山羊草4個群體的遺傳多樣性比較顯示，中亞粗山羊草的群體遺傳多樣性水平最高（He=0.225 4，I=0.355 7），群體間的基因流較低（Nm=1.638 6）。（3）聚類結果在遺傳相似系數約0.67處，來源于塔吉克斯坦6份和土庫曼斯坦2份粗山羊草種質材料聚成一類（Group 2）；其他48份種質材料形成一大類（Group 1），其中Group 1可進一步分成3個Sub亞類，呈現出來源相同的粗山羊草種質材料傾向聚在一起。（4）群體結構分析將56份粗山羊草種質分為5個群體，其中，來源于西亞伊朗V群體種質材料遺傳背景比較一致，混雜程度相對較低；進一步分析各群體Q值，發現IV群體種質材料親緣關系的來源相對復雜，遺傳多樣最為豐富。該研究結果可為粗山羊草種質親緣關系解析、種質多樣性保護提供重要參考依據，為其科學利用以及進化研究奠定基礎。

關鍵詞： 粗山羊草， 遺傳多樣性， 聚類分析， 群體結構， ISSR分析

中圖分類號：? Q948

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1317-09

收稿日期：? 2022-08-26

基金項目：? 河南省重大公益專項（201300110800）； 河南省高校重點科研項目（21A210007）。

第一作者： 魏颯（1998-），碩士研究生，研究方向為種質資源創新與利用，（E-mail）1478441271@qq.com。

通信作者：? 胡喜貴，博士，副教授，研究方向為作物種質資源挖掘與利用，（E-mail）xiguihu@126.com。

Genetic diversity and population structure of Aegilops

tauschii accessions based on ISSR method

WEI Sa1， ZHANG Haihui2， WANG Yuquan1， WU Xiaojun1， HU Xigui1*， RU Zhengang1

（ 1. Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. Xinxiang

Institute of Engineering， Xinxiang 453700， Henan， China ）

Abstract：? Aegilops tauschii is considered as an important gene source for improving common wheat， which has wide distribution and rich genetic variation. In order to understand genetic diverstity and population structure of A. tauschii from different origins， ISSR markers were used to evaluate genetic diversity and population structure of 56 A. tauschii accessions. The results were as follows：（1） The 170 polymorphic bands were detected by 16 ISSR primers， and polymorphic bands of each ISSR primer ranged from 3 to 18， with an average of 10.63. The variation of polymorphism information content（PIC）ranged from 0.17 to 0.85， with an averaged of 0.67. （2） The comparison among four populations indicated that the population genetic diversity of Central Asia was the highest （He=0.225 4， I=0.355 7） and gene flow between populations was relatively low （Nm=1.638 6）. （3）The clustering results showed that 56 A. tauschii accessions were divided into two groups at the genetic similarity coefficient 0.67， of which eight accessions from Tajikistan and Turkmenistan were clustered in Group 2. And， the Group 1 including 48 accessions could be further divided into three sub-groups， which indicated that A. tauschii accessions with clustering together have the same origin. （4） Based on population structure analysis， 56 A. tauschii accessions were divided into five populations， of which the V population from Iran in West Asia had relatively consistent genetic background and relatively low degree of hybridization. Furthermore， the Q value analysis of populations showed that the genetic relationship of IV population were relatively complex， producing the most abundant genetic diversity. The results of this study can provide an important reference for analysis of genetic relationship， protection of biodiversity， and lay a foundation for the scientific utilization and evolution research of A. tauschii.

Key words： Aegilops tauschii， genetic diversity， clustering analysis， population structure， ISSR analysis

粗山羊草（Aegilops tauschii， DD， 2n=2x=14）別稱為節節麥，屬于禾本科小麥族（Triticeae）山羊草屬（Aegilops），被認為是普通小麥（Triticum aestivum， AABBDD， 2n=6x=42）D基因組祖先的供體種（Lagudah et al.， 1991; Dvorak et al.， 2012）。粗山羊草主要分布在歐亞大陸中部，其起源中心位于里海南部海岸和阿塞拜疆，而后分別向東越過土庫曼斯坦的科彼特山脈擴散到中國的新疆和黃河中部地區，向西穿越土耳其東南的山谷傳播至敘利亞中部地區（Lubbers et al.， 1991）。已有研究表明，粗山羊草D基因組具有豐富遺傳變異性，如抗逆性（Abbas et al.， 2021）、抗病性（Olson et al.， 2013）、優異品質基因（Hsam et al.， 2001）等，已被作為改良普通小麥的重要種質資源之一（Lagudah et al.， 1991; Dvorak et al.， 2012; 趙昕鵬等， 2019; 郜曉峰等， 2021）。

核心種質的收集和評價是種質的應用、創新及作物新品種選育的基礎，尤其對供體物種遺傳多樣性和群體結構的研究不僅能了解物種親緣關系，還可以為其合理高效的保護和利用提供理論基礎（Mourad et al.， 2020）。粗山羊草的遺傳多樣性已從形態學、生理學、種子儲藏蛋白、同工酶、分子標記等進行廣泛研究（William et al.， 1993; Ghasemzade et al.， 2008; Mahjoob et al.， 2021）。其中，因為分子標記不受表型條件局限，可早期完成，所以被公認為是研究遺傳多樣性和群體結構高效、靈活的方法（Abouzied et al.， 2013）。Lubbers等（1991）對不同來源102份粗山羊草25個位點的RFLP分析，發現來自里海的粗山羊草變異最大，阿富汗次之，而土耳其和巴基斯坦的變異最小，并進一步支持粗山羊草起源于里海南部海岸?？琢钭尩龋?998）利用RAPD標記分析粗山羊草兩個亞種的基因組DNA多態性，表明Aegilops tauschii ssp. tauschii 多態性明顯高于A. tauschii ssp. strangulata。Pestsova等（2000）利用SSR標記分析113份粗山羊草遺傳多樣性，發現來自高加索地區的粗山羊草多樣性比中亞地區的豐富，同時，將其劃分為兩大類且與地理分布一致。

基于內部簡單重復序列（inter-simple sequence repeats，ISSR）是一種顯性分子標記，具有較高的多態性、重復性、穩定性且操作簡便等諸多優點，已廣泛應用在埃及小麥（Egyptian wheat）（Abdel-Lateif & Hewedy， 2018）、硬粒小麥（Triticum durum）（Aslan-Parviz et al.， 2020）、鉤刺山羊（Aegilops triuncialis）（Khodaee et al.， 2021）、大麥（Hordeum vulgare）（張超等，2020）等小麥及野生近緣屬種的遺傳多樣性研究。目前，利用ISSR標記研究粗山羊草遺傳多樣性的研究報道較少，僅李玉閣等（2017）利用9個ISSR標記研究了75份中國粗山羊草的遺傳多樣性，結果將中國粗山羊草劃分為黃河流域和新疆兩大群體，并篩選到5份具有獨特變異的黃河流域類型，進一步研究認為黃河流域種群是從伊朗或土庫曼斯坦南部地區直接傳播而來（Wei et al.， 2008; Su et al.， 2020）。普通小麥的D基因組來源于有限粗山羊草類群，但多倍化和進化“瓶頸”導致其遺傳基礎日益狹窄，與A、B基因組相比，小麥D基因組的遺傳多樣性尤其匱乏。為了利用不同來源粗山羊草類群拓展小麥D基因組，首先要解析粗山羊草種質遺傳多樣性。因此，本研究利用16個ISSR標記對不同來源的56份粗山羊草種質開展遺傳多樣性和群體結構研究，旨在了解它們的遺傳多樣性和群體結構，解析它們的親緣關系，以期為種質多樣性保護和科學利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

56份粗山羊草（Aegilops tauschii）種質材料（表1），其中來源于西亞23份（伊朗18份、土耳其和阿塞拜疆各2份、格魯吉亞1份），中亞26份（阿富汗11份、土庫曼斯坦9份、塔吉克斯坦6份），南亞3份（巴基斯坦3份），東亞1份（中國1份），未知3份，均由美國種質資源庫（National Genetic Resource Program， NPGS）饋贈，在河南科技學院小麥中心繁殖并保存。

1.2 DNA提取

按照Yan等（2002）2×CTAB的方法，從56份粗山羊草種質材料的幼嫩葉片中提取基因組DNA，并經Nanodrop 2000（美國賽默飛世爾）檢測DNA濃度和純度。

1.3 ISSR-PCR擴增分析

參照Khodaee等（2021）研究，選用擴增清晰且重復性好的16個ISSR引物（上海生物工程技術服務有限公司合成）對56份粗山羊草種質材料進行遺傳多樣性分析（表2）。

ISSR-PCR擴增體系20 μL：10 μL 2×Taq PCR StarMix（北京康潤誠業生物科技有限公司）、6 μL ddH2O、2 μL ISSR引物（10 pmol·μL-1）、2 μL DNA（50～60 ng·μL-1）。其PCR擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53.7～60.5 ℃（視不同引物而定）退化45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃再延伸7 min，4 ℃繼續保存。PCR擴增產物經1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳分離，D2000 bpDNA分子量標準（天根生化科技有限公司）作為對照，觀察結果，照相并保存。

1.4 數據分析

依據ISSR擴增電泳圖，分別讀取數據，相同遷移率處有帶為1，無帶為0，模糊不清楚為999，并建立二元數據矩陣。利用PowerMarker 3.2.5（Liu & Muse， 2005）軟件分析多態性信息含量（polymorphism information content，PIC）；應用Popgene 1.32（Yeh et al.， 1999）軟件計算群體觀察到的等位基因（Na）和有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（He）和Shannons信息指數（I）、不同群體間的總基因多樣性（Ht）、群體內的基因多樣性（Hs）、群體間的基因多樣性（Dst）、遺傳分化系數（Gst）和基因流（Nm）；采用Ntsys 2.1（Rohlf， 2000）軟件，基于簡單匹配系數（simple matching coefficient，SM）進行非加權平均法（UPGMA）聚類分析。

將數據轉換成Structure 2.3.4（Pritchard et al.， 2000）軟件的格式，進行群體遺傳結構分析。將K值設為2～20，基于模型每個K值進行10次分析，再通過Structure Harvester（Earl & Vonholdt， 2012）確定最合適的K值，構建遺傳結構圖。同時，計算群體中種質材料變異源于該群體中的概率Q值，用于分析其遺傳成分。

2 結果與分析

2.1 56份粗山羊草種質ISSR引物多態性

16個ISSR引物在56份粗山羊草種質材料中擴增出175條清晰穩定的條帶，其中，ISSR13引物擴增條帶最多（19條），ISSR23和ISSR28引物擴增帶最少（3條），平均為10.94條。各ISSR引物的多態性條帶數為3～18條，平均為10.63條，多態性位點百分率為97.14%。ISSR引物PIC在0.17（ISSR28）～0.85（ISSR5和ISSR27）之間，平均為0.67。其中12個ISSR引物的PIC值高于平均值，占75%（表2）。Botstein等（1980）提出了衡量基因變異程度高低的PIC，并將PIC分成3個程度：高度（PIC>0.50）、中度（0.25≤PIC≤0.50）和低度（PIC<0.25）。本研究中16個ISSR引物PIC中，除引物ISSR3（PIC=0.49）、ISSR7（PIC=0.19）、ISSR23（PIC=0.39）和ISSR28（PIC=0.17）外，其他均表現為高度多態性信息。

2.2 56份粗山羊草種質群體遺傳多樣性和分化程度分析

56份粗山羊草種質材料按中亞、西亞、南亞和其他4個群體進行遺傳多樣性分析，由表3可知，4個群體的觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（He）與Shannons信息指數（I）由高到低排序為中亞>西亞>其他>南亞。這說明中亞粗山羊草的群體遺傳多樣性水平最高，西亞次之，其他和南亞的相對較低。進一步分析群體基因的分化程度，由表4可知，56份粗山羊草種質材料的總基因多樣性（Ht）為0.236 0，4個群體間發生一定的遺傳分化（Gst=0.233 8），而群體內基因多樣性比值為0.766 2（Hs/Ht）， 并存在中等程度的基因交流（Nm=1.638 6）。這說明粗山羊草種質群體間的遺傳分化水平較低，大部分變異以群體內為主。

2.3 56份粗山羊草種質的聚類分析

利用Ntsys 2.1軟件對56份粗山羊草種質材料的ISSR遺傳多樣性結果進行聚類分析，可將52份粗山羊草種質材料分開，占92.86%，其種質材料間的配對遺傳相似系數（genetic similarity coefficient，GS）變化范圍為0.64～0.94（圖1）。由聚類結果（圖1）可知，在遺傳相似系數約0.67處，來源于塔吉克斯坦6份（PI662084、PI662095、PI662105、PI662106、PI662112和PI662116） 和土庫曼斯坦2份（PI662076和PI662078）種質材料聚成一類（Group 2），其他48份粗山羊草種質材料形成一大類（Group 1）。而在遺傳相似系數約0.70處，可進一步將Group 1分成3個亞類：來源于8個國家的26份種質材料組成Sub 1亞類，其中具有相同來源仍聚在一起，如土庫曼斯坦（PI662065、PI662066、PI662067、PI662068、PI662069、PI662070、PI662072）、阿富汗（CIae3、CIae4、CIae5、CIae6、PI220331、PI220641、PI220642、PI317392、PI317394、PI317398、PI511366）等；除3份種質材料（土耳其PI486269和未知PI330489、PI369627）外，Sub 2亞類中種質材料主要來源于伊朗（CIae8、CIae9、CIae10、CIae13、CIae15、CIae16、CIae17、CIae18、CIae19、CIae20、CIae21、PI268210、PI276985、PI511368、PI511378、PI511379、PI511382）；Sub 3亞類種質材料來源于阿塞拜疆（PI349037和PI428564）。同時，發現未知CIae51與阿富汗PI220642，未知PI330489和PI369627與伊朗PI276985聚在一起，可推測未知CIae51來源于阿富汗，而未知PI330489和PI369627來源于伊朗。本研究聚類分析結果將大部分粗山羊草種質材料可聚類分開，說明供試粗山羊草種質之間具有一定的遺傳差異，也證明了ISSR標記在粗山羊草種質分析方面具有較好的效果。

2.4 56份粗山羊草種質的遺傳結構分析

基于ISSR數據，利用Structure 2.3.4軟件分析56份粗山羊草種質群體的遺傳結構，繪制K與ΔK的關系圖（圖2），K=5時，ΔK最大。因此，可將56份粗山羊草種質材料分成5個群體。由圖3可知，V群體的種質材料主要來源于西亞的伊朗，遺傳背景比較一致，其混雜程度相對較低，而其他群體間混合程度相對偏高，尤其IV群體。從遺傳結構整體分析也發現，相同來源的種質材料傾向聚在一起，這與聚類分析（圖1）的結果相似。

由56份粗山羊草種質材料在各群體中Q值分布（表5）可知，15份種質材料Q值小于0.6，占26.8%，Q值大于0.8和0.9的種質材料分別占50.0%和42.9%，這說明群體中大部分種質材料的親緣關系比較單一。對各群體Q值大于0.8的進行對比，發現V群體的Q值最大，為83.3%，而IV最小，僅為26.7%。這揭示了IV群體種質材料親緣關系的來源相對復雜，遺傳多樣最為豐富。

3 討論與結論

3.1 ISSR標記分析粗山羊草種質遺傳多樣性

近年來，分子標記在生物多樣性和進化關系方面研究中發揮著重要的作用，ISSR分子標記是基于PCR技術發展起來的一種DNA多態性檢測技術。本研究利用16個ISSR標記對56份粗山羊草種質的遺傳多樣性進行分析，結果表明多態性位點百分率為97.14%，觀測等位基因數為1.977 1，有效等位基因數為1.387 5，Neis基因多樣性指數為0.242 8，Shannons信息指數為0.382 6， 群體內基因遺傳多樣性為0.180 9； 李玉閣等（2017）用9個ISSR標記研究75份中國粗山羊草（新疆、河南和陜西）的遺傳多樣性，多態性位點百分率、觀測等位基因數、有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、Shannons信息指數、群體內基因遺傳多樣性分別為89.31%、1.993 4、1.471 5、0.273 4、0.415 2、0.236 7。經比較同物種的兩個群體，本研究粗山羊草群體（主要來源西亞和中亞）除多態性位點百分率外，各項指標均略低于中國粗山羊草群體，表明粗山羊草種質從西亞和中亞向東傳入中國的新疆和黃河中部地區后，中國區域內群體種質發生部分變異，進而提升了遺傳多樣性水平。另外，利用ISSR研究其他物種遺傳多樣性， 如鉤刺山羊引物多態性條帶平均為9.50條、PIC為0.30（Khodaee et al.， 2021）；硬粒小麥引物多態性條帶平均為10.00條、PIC為0.42（Aslan-Parviz et al.， 2020）；大麥引物多態性條帶平均為8.313條（張超等，2020）。與以上不同物種比較，粗山羊草ISSR引物多態性及PIC較高，這有可能與本研究粗山羊草種質材料的地理來源廣有關。

3.2 粗山羊草群體遺傳結構

Mizuno等（2010）和Sohail等（2012）對不同地理分布的粗山羊草種質遺傳結構進行分析，將其分成兩個親緣譜系：L1（隸屬于Aegilops tauschii ssp. tauschii）和L2（隸屬于A. tauschii ssp. strangulata），并表明少數L2譜系的粗山羊草參與了普通小麥D基因組的起源；而未參與起源的L1譜系的粗山羊草具有豐富遺傳變異。Wang等（2013）進一步按地理分布，將兩個親緣譜系細劃分成西（W）亞系和東（E）亞系，其中L1W亞系位于土耳其東部、 亞美尼亞、 阿塞拜疆和伊朗西部，L1E亞系位于伊朗中部到中國西部；L2W和L2E亞系分別位于亞美尼亞到阿塞拜疆區域和阿塞拜疆南部到伊朗北部的里海沿岸區域。Pestsova等（2000）利用SSR標記分析不同地理來源的113份粗山羊草遺傳多樣性，發現高加索地區（格魯吉亞、亞美尼亞和俄羅斯的達吉斯坦地區）的粗山羊草多樣性最為豐富，而中亞（烏茲別克斯坦和土庫曼斯坦）粗山羊草多樣性最低。本研究56份粗山羊草種質材料按4個群體的遺傳多樣性對比，表明來自中亞（阿富汗、土庫曼斯坦和塔吉克斯坦）的粗山羊草群體遺傳多樣性水平最高（He=0.225 4，I=0.355 7），這與Pestsova等（2000）研究結果相反，這可能歸因于來自中亞阿富汗和塔吉克斯坦的粗山羊草種質變異較大。王亞娟等（2010）基于SSR標記對78份粗山羊草進行聚類分析，在遺傳相似系數0.77處劃分成6個主要類群；而Sohail等（2012）基于DarT標記對81份粗山羊草進行聚類分析，將其分成3大類（Group A/B/C），Group C類主要來源伊朗。本研究聚類結果在遺傳相似系數約0.67處，56份粗山羊草種質材料主要聚成2大類（Group 1和Group 2），其中Group 1進一步分成3個Sub亞類；群體結構將其分成5個群體。兩種分析方法在分類數量上略有差異，但均呈現出來源相同的粗山羊草種質材料傾向聚在一起，本研究結果進一步支持種質材料間的親緣關系與其地理來源有一定的相關性（王亞娟等，2010； Sohail et al.， 2012）。同時，本研究56份粗山羊草種質材料中Q值小于0.6的15份，僅占26.8%，也進一步說明大部分種質材料的親緣關系比較單一，以群體內或地理區域變異為主。因此，粗山羊草種質在傳播過程中，群體內種質的基因交流或重組是造成不同群體粗山羊草差異的主要原因。

3.3 粗山羊草保護生物學意義

自然遺傳變異是植物生物學最重要的基礎資源之一（Koornneef et al.， 2004）。普通小麥是四倍體小麥和粗山羊草天然雜交后經過染色體加倍而形成的，其起源、馴化及現代育種過程，排斥了供體物種的大量遺傳變異（Dubcovsky & Dvorak， 2007; Dvorak et al.， 2012）。模擬普通小麥起源過程而創制的人工合成小麥，是重新引入供體物種遺傳變異的重要橋梁，在小麥育種中的應用潛力很大（Hao et al.， 2019）。但Waines（1998）研究發現，許多粗山羊草物種的棲息地已經遭受破壞甚至面臨危機，尤其是在地中海東部沿岸地區。因此，從遺傳多樣性保護來看，了解粗山羊草種群結構十分重要。本研究對不同來源的56份粗山羊草種質進行遺傳多樣性和群體結構分析，了解它們的親緣關系，對每個種群或地區選取代表性的種質保護，可為今后粗山羊草自然遺傳變異研究與利用提供基礎。

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（責任編輯 周翠鳴）