腎不藏志型不寐模型大鼠相關組織IL-10、IL-1β的表達差異研究

陳 旭，張星平，梁瑞寧，王凱凱，梁政亭，閆德祺，王 慧

（新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆 烏魯木齊 830099）

失眠（insomnia）屬中醫“不寐病”范疇，指患者對自身睡眠總時長或睡眠質量不滿足并影響次日日間社會活動功能的一種主觀體驗[1]。一項10萬人的大樣本流行病學調查顯示，中國人群失眠患病率約為15%[2]，中老年占比約35.9%[3]。長期慢性失眠不僅會影響患者日常生活質量，更會增加患者罹患心腦血管疾病及精神心理疾病的風險，因此開展失眠的研究很有意義[4]。中醫藥治療失眠具有豐富的經驗，據文獻報道[5]其總有效率均在80%以上，表明中醫藥治療失眠具有良好療效。然而由于各醫家臨證角度不同、辨證分型方法各異，導致后人依據前人臨床辨證論治經驗很難得到良好臨床療效的問題長期存在，故很有必要探尋既符合中醫基本理論又方便客觀的不寐病辨證分型方法。

張星平教授在《內經》“五神臟”理論及歷代名家論著的啟發下，結合臨床經驗及不寐患者臨床癥狀表現特征，提出中醫不寐五神分型診斷法[6]。前期研究發現基于此法確立的五種不寐分型在多導睡眠圖分期特征方面存在差異[7]，其中以夜寐早寤為主要臨床表現特征的腎不藏志型不寐患者多導睡眠圖結構參數呈現出非快速眼動睡眠期（non-rapid eye movement，NREM）中N1、N2期較常人延長、快速眼動睡眠期（rapid eye movement，REM）較常人縮短的特征性變化[7]。同時還發現中醫不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上具有一致性[8]，這均表明了中醫不寐五神分型診斷法的科學性及客觀性。

失眠與機體氧化應激及炎癥反應存在密切聯系，研究[9-10]表明失眠患者機體炎癥因子水平較正常對照組升高。IL-10作為一種多細胞源、多功能細胞因子，參與機體炎癥及免疫抑制過程，在炎癥反應中發揮抗炎作用[11]；IL-1β作為關鍵促炎細胞因子，參與多種炎癥反應及細胞活動，研究發現[12]失眠模型小鼠血清及腦組織IL-1β水平較正常組明顯升高。以上研究證明IL-10、IL-1β與失眠密切相關。本研究采用D-半乳糖（D-gal）聯合對氯苯丙氨酸（p-chlorophenylalanine，PCPA）構建腎不藏志不寐模型大鼠[13]，以期探尋IL-10、IL-1β在腎不藏志型不寐模型大鼠相關組織中的表達差異。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 16只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量（200±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（新）2018-0003。將16只大鼠隨機分為模型組與對照組，每組8只，適應性飼養3 d，自由進食、飲水。SPF級飼養環境：溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，空氣潔凈度7級，晝夜明暗交替12 h/12 h，最小換氣次數≥15次/h。本項動物實驗經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批后進行，審批編號：IACUC20190116-01。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：Anti-IL-10 Antibody（DF6894，Affinity Biosciences）、Anti-IL-1Beta Antibody（AI08133511，Bioss）、中性樹膠（G8590，Solarbio）、免疫組織化學染色兔二步法試劑盒（2241D0401，中杉金橋）、DAB 試劑盒（218191011，中杉金橋）、EDTA 抗原修復液（C1034，Solarbio）、無水乙醇（20210901，天津致遠）、二甲苯（20200920，天津致遠）、多聚甲醛（50116，天津光復）。

儀器及軟件：真空干燥箱（DZF-6090，上海一恒）、電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-4，北京永光明）、輪轉式石蠟切片機（RM2235，Leica）、正置熒光生物顯微鏡（Eclipse Ni-U，Nikon）、NIS-Elements D 圖像采集 軟 件 （V5.01，Nikon）、Image J 圖 像 分 析 軟 件（V1.53，National Institutes of Health）。

1.3 制備腎不藏志型不寐大鼠模型及腦肌電檢測、戊巴比妥鈉翻正實驗 參考課題組前期研究[13]制備腎不藏志不寐模型大鼠：模型組大鼠先予D-gal 120 mg·kg-1·d-1行頸背部皮下注射，連續 42 d，后予 PCPA 300 mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續 3 d，共 45 d；模型組大鼠腦肌電圖特征呈現出與腎不藏志型不寐患者NREM期中N1、N2期較常人延長、REM期縮短的多導睡眠圖結構參數變化特征[7]一致，且戊巴比妥鈉翻正實驗顯示睡眠潛伏期延長、總睡眠時間縮短時，則表明腎不藏志型不寐大鼠模型制備成功。正常組大鼠同期同等飼養環境下給予等體積0.9% NaCl溶液行相應部位注射。

1.4 取材與組織包埋切片 模型組與正常組均使用7%水合氯醛溶液，以0.5 mL/100 g的劑量行腹腔注射麻醉，迅速取肝、心、脾、肺、腎、膀胱、大腸、腦組織，并先后行4%多聚甲醛沖洗固定、石蠟包埋及切片（厚度 4 μm）。

1.5 免疫組織化學染色與觀察 石蠟切片經真空干燥箱65℃、120 min烤片后依次行二甲苯脫蠟、酒精復水、恒溫水浴鍋抗原修復、滴加內源性過氧化物酶阻斷劑、滴加一抗（IL-10、IL-1β）孵育過夜、滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物、滴加DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸分化、氨水返藍、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察臟器組織切片，2組各個組織均隨機觀察5張切片，每張切片隨機取3個視野，應用Image J圖像分析軟件V1.53計算平均灰度值（IntDen/Area）。

1.6 統計學方法 使用SPSS 26.0軟件行統計學分析，計量資料平均灰度值行兩獨立樣本t檢驗，結果以平均值±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠睡眠檢測各期差異 腦肌電圖分析結果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠覺醒時間增加（P＜0.05），NREM（1，2）期、REM 期縮短（P＜0.05），NREM（3，4）期無明顯差異（P＞0.05）。以上結果表明腎不藏志不寐大鼠模型構建成功。見圖1和圖2。

圖1 2組大鼠各期睡眠時間比較

圖2 2組大鼠白天睡眠各期比較

2.2 2組大鼠戊巴比妥鈉翻正實驗結果 與正常組比較，模型組大鼠睡眠潛伏期延長、睡眠時間縮短（P＜0.05）。見圖3。

圖3 2組大鼠戊巴比妥鈉翻正實驗結果比較

2.3 2組大鼠臟器組織中IL-10的表達差異 成功構建腎不藏志型不寐模型大鼠后使用免疫組織化學法測定（陰性細胞染色為藍色，陽性細胞染色為棕褐色），與正常組比較，模型組腎、腦、肺、大腸IL-10表達水平降低（P＜0.05），其中腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），肝、心、脾、膀胱IL-10表達水平2組未見明顯差異（P＞0.05）。見圖4和表1。

圖4 2組大鼠相關臟器組織中IL-10的表達情況（免疫組織化學染色）

表1 2組大鼠相關臟器組織中IL-10的表達水平差異（±s，n=8）

表1 2組大鼠相關臟器組織中IL-10的表達水平差異（±s，n=8）

組別 肝 心 脾 肺 腎 膀胱 大腸 腦正常組 0.37±0.04 0.33±0.03 0.48±0.03 0.60±0.05 0.50±0.05 0.44±0.06 0.55±0.03 0.38±0.03模型組 0.40±0.03 0.35±0.04 0.52±0.06 0.55±0.05 0.45±0.05 0.45±0.03 0.51±0.03 0.28±0.03 t值 1.703 1.042 1.677 2.165 -2.244 1.913 2.583 7.404 P值 0.108 0.313 0.113 0.046 0.039 0.074 0.02 <0.0001

2.4 2組大鼠臟器組織中IL-1β的表達差異 成功構建腎不藏志型不寐模型大鼠后使用免疫組織化學法測定（陰性細胞染色為藍色，陽性細胞染色為棕褐色），模型組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-1β表達水平較正常組顯著升高（P＜0.05），其中以腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），2組大鼠肝、心、脾、膀胱組織中 IL-1β 表達水平未見明顯差異（P＞0.05）。見圖5和表2。

表2 2組大鼠相關臟器組織中IL-1β的表達水平差異（±s，n=8）

表2 2組大鼠相關臟器組織中IL-1β的表達水平差異（±s，n=8）

組別 肝 心 脾 肺 腎 膀胱 大腸 腦正常組 0.29±0.07 0.29±0.03 0.18±0.05 0.35±0.04 0.26±0.02 0.38±0.07 0.32±0.02 0.27±0.03模型組 0.31±0.10 0.29±0.01 0.21±0.03 0.42±0.10 0.31±0.04 0.38±0.10 0.34±0.02 0.45±0.03 t值 0.532 0.866 1.39 2.252 3.531 -0.051 2.769 12.859 P值 0.602 0.399 0.183 0.039 0.003 0.096 0.014 <0.0001

3 討論

中醫不寐五神分型診斷法是張氏在《內經》“五神臟”理論及歷代名家論著啟發下，結合不寐患者臨床癥狀表現特征及自身臨床經驗所提出的，依據不寐患者臨床單一癥狀主訴確定不寐病五臟病位診斷的分型方法，該分型方法將不寐病分為5型[6]：以夢繞紛紜為主訴的肝不藏魂型；以入寐維艱為主訴的心不藏神型；以睡前思慮紛紜為主訴的脾不藏意型；以夜寐輕淺易寤或頻寤為主訴的肺不藏魄型；以夜寐早寤為主訴的腎不藏志型。課題組前期研究發現基于此種分型方法確立的5種不寐分型不僅在多導睡眠圖分期特征方面存在差異[7]，同時中醫不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上亦具有一致性[8]，表明中醫不寐五神分型診斷法具有科學性及客觀性。此外，前期研究[7]表明腎不藏志型不寐患者的多導睡眠圖結構參數呈現出NREM期中N1、N2期較正常對照組延長、REM期較正常對照組縮短的特征性變化，在本次研究中作為評判腎不藏志型不寐模型大鼠構建成功的標準，此種模型評價標準已于課題組前期研究中得以驗證[13]。

《素問·陰陽應象大論》云：“人年四十，而陰氣自半也，起居衰矣?！薄端貑枴ど瞎盘煺嬲摗酚醒?，“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，腎精為人體先天之本，腎精充足，則腎之陰陽調和，五臟得以溫煦濡養，臟腑調和，五臟各安其位而睡眠得安，然人年過四十，腎臟精氣虛損，腎志不安則不寐[14-16]。故在本次研究中，課題組使用D-gal誘導大鼠快速衰老以造成“腎虛”，進而使用PCPA誘導大鼠失眠，用此復合模型以構建腎不藏志型不寐?！澳X腎相濟”，腦為髓海，精生髓，腎藏精，腎精充盛則腦髓充盈，腎精虧虛則髓海不充而變生諸癥。且腎為水臟，膀胱為水腑，兩者五行中同屬水，經絡相互絡屬，構成臟腑表里相合關系，因此本研究選取腎、心、腦、肝、脾、肺、膀胱作為腎不藏志型不寐研究的相關臟器組織。此外，研究[17]表明“微生物-腸-腦軸”與失眠存在密切聯系，腸道菌群可通過調節5-羥色胺、褪黑素等神經遞質水平影響下丘腦-垂體-腎上腺軸及中樞神經系統功能改變睡眠結構參數，在這一過程中，腸道菌群易受腸道微小炎癥反應影響[18]，故同時選擇大腸行腎不藏志型不寐基礎研究。

失眠是一種慢性應激過程，可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸增加皮質醇分泌，使患者免疫功能發生紊亂，加劇體內微小炎癥反應，其中以神經炎癥反應為著[17]。炎癥反應對睡眠-覺醒周期調節具有重要作用，炎癥因子可改變神經遞質的產生及重新攝取，影響下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，進而改變睡眠-覺醒周期[19]。炎癥因子可分為促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6）與抗炎細胞因子（如 IL-10、IL-1Ra）兩類[9]，促炎細胞因子與抗炎細胞因子動態平衡以維持正常免疫功能及內環境穩態，其中一者發生異常變化皆會導致機體發生病理性改變。失眠與機體慢性炎癥狀態具有直接聯系，IL-10作為抗炎細胞因子，能反映慢性全身性炎癥反應狀況，在炎癥反應發生發展過程中具有重要調控作用，其通過調節Th1類細胞因子來抑制炎癥反應[11]。Hirotsu等[20]發現睡眠剝奪小鼠較正常組小鼠體內IL-10表達降低、IL-1β表達升高，亦有研究表明失眠患者血清促炎細胞因子IL-1β表達上調[21]?；谏鲜鑫墨I研究結果，課題組推測腎不藏志型不寐模型大鼠因相關臟器抗炎細胞因子IL-10表達水平降低、促炎細胞因子IL-1β表達水平升高而致機體炎癥因子釋放增多，進而對睡眠-覺醒周期產生影響。課題組此次研究發現，模型組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10表達水平較正常組降低（P＜0.05），IL-1β表達水平較正常組升高（P＜0.05），且均以腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），此研究結果與文獻[20][22]發現睡眠剝奪小鼠腦組織中IL-10表達降低、IL-1β表達升高一致。

總之，本項研究發現了腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10表達水平降低，而IL-1β表達水平升高，且均以腦組織變化最為顯著，表明腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10與IL-1β表達水平的變化主要與腦存在關聯，其次與腎、肺、大腸相關。腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10與IL-1β表達水平的差異特點可能是腎不藏志型不寐炎癥因子的特征性變化之一。