穴位埋線對心肌梗死大鼠巨噬細胞MerTK胞葬作用的影響

張 薇，黃小樓，2，韋雪蘭，楊 珣，2，平蘭芝，吳高鑫，2*

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550025）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是因冠狀動脈阻塞血供中斷，局部心肌持續性缺血而引發的心肌壞死性疾病，其發病率逐年升高，威脅著全世界人民的健康[1]。在MI的發生發展中，炎癥反應的重要性已被證實[2]。MI后局部心肌組織持續的缺血缺氧及心肌能量供應障礙，導致心肌細胞出現病理性凋亡同時出現修復性的急性炎癥反應。適當炎癥因子的分泌可吞噬凋亡的細胞及碎片，促進組織的修復，炎癥過度表達則引發不良的心室重塑[3]。巨噬細胞表面受體MerTK的胞葬作用可通過對凋亡細胞的吞噬來避免炎癥過度的發生，進而產生抗炎效應[4]。穴位埋線療法是通過現代針具結合《靈樞·終始》“久病者……深內而久留之”的理論而衍生的一種長效針感效應的治療方法。有研究顯示[5]，穴位埋線療法對心絞痛患者有一定的治療作用。能明顯改善其缺血發作的時間和發作的次數。課題組前期研究表明[6]，內關穴位埋線能通過抑制雷帕霉素靶蛋白質合成改善心肌梗死大鼠心肌肥大程度，對心肌產生保護效應。但炎癥反應機制研究尚未開展，其機制尚未闡明。本研究通過“內關”和“心俞”穴位埋線對心梗大鼠心肌細胞大小形態改變的影響，進一步探究論證“內關”和“心俞”穴位埋線在巨噬細胞MerTK胞葬作用下對心肌梗死的保護作用機理，為穴位埋線在防治心肌梗死提供多靶點的分子實驗理論依據，為該理論在臨床治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性SD大鼠，8～10周齡，50只，SPF級。體質量180～220 g，均由天勤（長沙）生物技術有限公司提供，合格證編號：SCXK（湘）2019-0017，室溫20～25℃、濕度50%～70%，大鼠適應性喂養1周后進而造模使用。本實驗過程嚴格遵照動物倫理學相關使用規定，倫理委員會編號：20220081。

1.2 主要試藥與儀器 培哚普利叔丁胺片（上海東英藥業有限公司，國藥準字H20093504），戊巴比妥鈉（進口分裝西格瑪，批號20170510），HE染色試劑盒（珠海貝索生物科技有限公司），IL-1β（ZC-36391）、IL-6（ZC-36404）、TNF-α（ZC-37624）96Test ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），MerTK（abs146712），P-MerTK（abs140272）兔克隆抗體（愛必信上海生物科技有限公司）。一次性輔助埋線包（揚州伊貝康醫療科技有限公司），高精度電子天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司），小動物人工呼吸機（上海普辛儀器科技有限公司），BL-420N生物信號采集與分析系統（成都泰盟軟件有限公司），酶標儀（上海卓的儀器設備有限公司），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）等。

2 方法

2.1 造模 SD雄性大鼠采用左冠狀動脈前降支結扎法（LAD）構建急性心梗大鼠模型[7]，麻醉以1%的濃度（50 mg/kg）的計量給予大鼠腹腔注入戊巴比妥鈉，接著仰臥固定大鼠、備皮、氣管插管、依據相關參數設定小動物人工呼吸機并將與大鼠連接，術區消毒后沿著大鼠左側第三、四肋間鈍性分離肌肉直至打開胸腔，眼科鑷撕開心包膜，將心臟暴露視野，用5/0帶線縫合針將位于左心耳下緣2 mm處的左冠狀動脈前降支結扎。0.1 mL利多卡因注射液滴入胸腔并在縫合傷口上撒少許青霉素粉末，其作用分別是預防心律失常和傷口感染。模型構建術后，將大鼠肢體鏈接上Ⅱ導聯，觀測術后大鼠心電圖，如出現ST段抬高則構建模型成功。手術全程嚴格無菌，偽手術組過程同模型組，但僅開胸后撕開心包膜。實驗中，模型構建前心電圖異?；蛟炷２怀晒Φ挠杼蕹?。造模前后心電圖見圖1。

圖1 大鼠模型構建前后心電圖

2.2 分組與給藥 將構建成功的模型大鼠以隨機方式分為模型組、“內關”和“心俞”穴位埋線組、培哚普利組，同時單設偽手術組。并以術后7、28 d作為觀察點，每組5只，共40只。各時間點大鼠在造模后的第2天開始干預治療，培哚普利組藥物計量按照40 mg/kg灌胃，余下3組給予相當容積蒸餾水灌胃，每天1次?！皟汝P”和“心俞”穴位參照實驗動物穴位定位標準第2版《實驗針灸學》定位，將羊腸線（3-0）剪成2～5 mm長段置于75%酒精中，7號埋線針推入以上穴位。埋線出針后檢查有無線頭外露并用醫用藥棉按壓針孔1 min，心俞、內關均斜刺，埋線干預7 d/次，第7、28天行相關檢查。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度各組大鼠最后一次治療后，禁食不禁水12 h，麻醉后的大鼠行腹主動脈取血，全血靜置15 min，3 500 rpm離心10 min，移液槍將血清移入離心管，ELISA試劑盒實驗操作按照說明書對各組別大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β 濃度進行檢測。

2.3.2 HE染色 嚴格無菌操作下，取出心臟組織，沿心臟最大橫徑將心臟分為上下部分，4%多聚甲醛將心臟上半部分固定，石蠟包埋心臟上半部組織，切片厚度5 μm，不同濃度酒精脫水，用二甲苯進行脫蠟處理，HE染色，切片封固，高清全景掃描儀采集切片圖像，應用Image-J軟件對心肌細胞橫切面積進行測量。

2.3.3 Western blotting檢測心肌組織 MerTK、p-MerTK的蛋白表達 將梗死心肌周圍組織放入研磨管中，組織研磨管中加入強RIPA裂解液，裂解后提取各時間組大鼠心肌組織中的蛋白含量，BCA法測定蛋白濃度。待100 V電壓穩定15 min后開始電泳，PVDF膜放200 mA電流中轉膜1～2 h，并放入孵育盒。一抗 MerTK、p-MerTK孵育，濃度 1：1 000，βactin濃度1：50 000，二抗孵育，均勻滴入發光液，曝光顯影成像，Image-J軟件分析處理蛋白灰度，各時間組蛋白灰度值相比β-action灰度值，得到目的蛋白灰度表達。

2.4 統計學處理 各時間點實驗數據選用SPSS 26.0進行統計并分析，實驗數據計量單位以（±s）表示。選用單因素方差分析，其計量資料先進行正態和方差齊性檢驗，方差齊性選擇“LSD”。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各時間點大鼠心肌組織HE染色情況和心肌細胞橫截面積比較 術后7、28 d不同時間點的偽手術組心肌細胞的大小、形態均未發生明顯改變、細胞間平行排列且有序，細胞核呈現出卵圓形，位居細胞中央。模型組心肌細胞大小形態異常、呈肥大改變且錯亂排列，游離細胞核增多，見明顯的細胞間質，兩治療組心肌細胞形態相對規則，排列相較平行有序，心肌細胞核游離及肥大的情況不同程度改善。見圖2。

圖2 各時間點大鼠心肌細胞HE切片結果（×400）

術后7 d，模型組大鼠心肌細胞橫截面積明顯大于偽手術組（P＜0.05），兩治療組大鼠心肌細胞橫截面積均小于模型組（P＜0.05）。術后28 d，模型組大鼠心肌細胞橫截面積明顯大于偽手術組（P＜0.05），兩治療組大鼠心肌細胞橫截面積均小于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各時間點大鼠心肌細胞橫截面積結果相比較（±s）

表1 各時間點大鼠心肌細胞橫截面積結果相比較（±s）

注：與偽手術組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n 治療后7 d（μm2）治療后28 d（μm2）偽手術組 5 203.78±15.31 244.4±16.01模型組 5 372.54±7.74＃ 676.8±41.45＃埋線組 5 347.98±14.48* 533.6±32.44*培哚普利組 5 280.48±9.81* 459.6±35.10*

3.2 各時間點大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平相比較 術后7、28 d，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度水平明顯高于偽手術組（P<0.05）。治療后 7 d，大鼠血清 IL-6、TNF-α、IL-1β 兩治療組大鼠均低于模型組（P<0.05）。治療后28 d，相較于模型組，兩治療組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β均不同程度降低（P<0.05）。見表2、表3。

表2 7 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

表2 7 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

注：與偽手術組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n IL-1β（pg/mL）偽手術組 5 2.23±0.19模型組 5 4.88±0.48＃埋線組 5 4.15±0.25*培哚普利組 5 3.22±0.17*IL-6（pg/mL）11.98±0.42 20.84±0.82＃17.57±1.44*15.47±0.83*TNF-α（pg/mL）12.69±0.84 27.05±1.10＃24.01±1.61*19.34±1.84*

表3 28 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

表3 28 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

注：與偽手術組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n IL-1β（pg/mL）偽手術組 5 1.84±0.13模型組 5 5.91±0.56＃埋線組 5 3.21±0.28*培哚普利組 5 2.64±0.23*IL-6（pg/mL）10.58±0.65 22.65±1.10＃15.40±0.63*13.36±0.58*TNF-α（pg/mL）12.42±0.71 30.75±1.16＃20.38±1.85*15.16±0.60*

3.3 各時間點大鼠蛋白MerTK、p-MerTK表達水平比較 術后7、28 d，模型組大鼠MerTK蛋白表達明顯低于偽手術組（P<0.05），而p-MerTK蛋白表達高于偽手術組（P<0.05）。治療后7、28d兩治療組MerTK蛋白水平均高于模型組（P<0.05），而p-MerTK蛋白低于模型組（P<0.05）。MerTK、p-MerTK呈反比。見表4、圖3。

表4 7、28 d各組大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表達比較（±s）

表4 7、28 d各組大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表達比較（±s）

注：與偽手術組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

7 d 28 d組別 n MerTK p-MerTK偽手術組 5 1.250±0.024 0.566±0.012 1.227±0.011 0.478±0.005 MerTK p-MerTK 1.154±0.014#埋線組 5 1.033±0.027*培哚普利組 5 0.898±0.013*模型組 5 0.894±0.016#0.926±0.018*1.111±0.009*1.247±0.004#0.664±0.007*0.687±0.274*0.736±0.013#0.826±0.010*1.049±0.198*

圖3 各組大鼠MerTK和p-MerTK表達

4 討論

在中醫學中心肌梗死屬“胸痹、真心痛”等范疇，本虛標實乃該病病機[8]，在治療選穴中選用既是手厥陰心包經之絡穴，又為八脈交會穴中通陰維脈的“內關”，加上即可調節臟腑氣機又可扶正補虛的屬足膀胱經之穴的背俞穴“心俞”[9]，兩穴合用可補心養氣、通脈止痛。本實驗通過手術結扎大鼠LAD，術中被結扎處心肌組織變白、術后大鼠心電圖ST段抬高，提示心肌缺血受損，造模構建成功，經穴位埋線干預治療后7、28 d心肌細胞的排列、形態、大小、細胞核游離情況均有所改善，揭示穴位埋線對MI后的心肌細胞有一定的治療和保護效果，該實驗結果與課題前期研究結果大體相同[6]。

巨噬細胞是心臟中固有免疫細胞群的一種，在MI情況下被激活，巨噬細胞可分為M1型和M2型巨噬細胞，其主要作用分別是促炎和抗炎。兩種分型的巨噬細胞參與了心肌梗死后的急性炎癥期、纖維增殖期和穩定恢復期的全過程[10]。MI后的細胞和受損基質釋放危險信號激活先天免疫補體級聯，導致中性粒細胞和促炎單核/巨噬細胞快速浸潤在梗死區[11]，從而M1型巨噬細胞分泌大量IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子以促進梗死的細胞清除，但心梗后炎癥的過度表達與不良心室重塑中的心肌肥大關系密切，心肌肥大增加了復發性心梗、心律失常、猝死等不良心肌事件的風險[12]。因此，炎癥的精準調控與巨噬細胞的平衡有望成為干預梗死后不良心室重構的一種新方法和策略。MerTK是受體酪氨酸激酶Tyro-Axl-MerTK（TAM）家族成員之一，存在于巨噬細胞的表面[13]，其胞葬作用通過“識別我”“找到我”“吞噬我”發揮對凋亡細胞的吞噬和其代謝產物之間的相互作用，實現炎癥的負向調控發揮抗炎效應。有研究表明[14]MerTK基因缺乏的小鼠在敗血癥中，小鼠的TNF-α表達異常升高，Mer受體酪氨酸激酶信號能調節TNF-α等促炎因子的分泌，減輕因內毒素引起的休克。Wan等[15]在心肌梗死小鼠模型中發現，體內MerTK基因缺乏，凋亡心肌細胞會過多積累，心臟收縮功能受損，缺血壞死組織持續擴大。本實驗結果中造模后7、28 d與偽手術組相比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β表達顯著上升，MerTK蛋白水平著降低，p-MerTK蛋白水平明顯升高，經穴位埋線和培哚普利7、28 d的治療后大鼠血清中 IL-6、TNF-α、IL-1β表達下降，MerTK蛋白表達不同程度上升，p-MerTK蛋白水平不同程度下降。從實驗結果中我們推測由于MerTK的減少，心梗后的大鼠巨噬細胞胞葬和橋接作用減弱，凋亡細胞不能迅速被識別，吞噬作用減慢，梗死心肌周圍被大量炎性細胞浸潤，導致炎癥過度的表達。穴位埋線對心肌的保護作用可能與維持心肌組織內巨噬細胞表面受體MerTK的水平，從而降低IL-6、TNF-α、IL-1β炎性細胞因子的產生介導炎癥消退相關。

綜上，“內關”和“心俞”穴位埋線療法對MI治療效果優良，可改善大鼠MI后心肌肥大橫截面積、減輕不良心室重塑，且有就診次數少、穴位刺激長效、創傷疼痛相對較低的優勢，值得推廣。但目前我們只從動物實驗部分分子機制出發，探討了其中的可能性，下一步我們將多維度出發，更長期的有效性、針藥結合等優效性觀察以及增加明確的信號通路和增加臨床試驗將是我們后續重點。