基于生物光譜技術結合多元統計分析的消毒效果快速評價方法

劉 婧, 趙佳慧, 熊 倩, 鄧文靖, 劉 芳, 胡立新

(1. 華南師范大學環境學院, 廣州 510631; 2. 廣東省化學品污染與環境安全重點實驗室, 廣州 510631; 3. 香港教育大學科學與環境研究系, 香港 999077; 4. 華南師范大學地理科學學院, 廣州 510631)

飲用水加氯消毒是最常用的城市水消毒方法[1]。為確保飲用水安全,我國生活飲用水衛生標準(GB5749-2006)要求自來水廠出水余氯質量濃度大于0.3 mg/L,管網末端水中余氯質量濃度大于0.05 mg/L,可確保飲用水中的生物指標達標,防止一些細菌(如大腸桿菌)危害人類健康。據報道,在南亞和撒哈拉以南的非洲,由于供水和衛生條件差,因腹瀉死亡的人數占全球腹瀉死亡人數的87%[2]。因此,在日常生活中,消毒必不可少,各種消毒方法已被應用于水行業,如氯、紫外線輻射、臭氧或超氧化物消毒[3]。疫情期間,為做到高效精準消毒,對清潔程序進行了加強并且增加了消毒劑的使用量,亟需了解各種消毒劑的滅活能力及其消毒機理,以評價其消毒效果,提高消毒效率。

國內外對消毒劑消毒效果的評價方法主要是定量滅活試驗[4]。通過觀察消毒前后細菌和病毒等微生物含量的減少情況來表征消毒效果[5]。病毒所處環境對化學消毒劑滅活病毒的效果會產生較大影響,所以模擬實驗需要考慮選取不同的實驗干擾條件,來預測消毒效果可能存在的偏差[6]。目前的消毒效果評價方法較為復雜,人們對消毒劑在分子水平消毒機制的理解仍然有限,細菌失活和生物效應之間的關系迄今尚不清楚。而利用生物光譜技術結合多元統計分析,探索細菌失活與生物效應之間的關系,有望實現通過圖像以及數據分析直觀快速地評價消毒效果。

傅立葉變換紅外(FTIR)光譜作為一種表征和鑒定生物材料的有力工具,與多元統計分析相結合,可以在分子水平上增進消毒機理的研究。FTIR已被廣泛應用于環境監測[7]、毒理學研究[8]和病理診斷[9]。該方法的優點是無破壞性、無試劑、易于操作和可獲取詳細的生化信息[7,10-11]。當生物樣品與紅外光相互作用時,生物分子中的化學鍵吸收輻射并產生紅外吸收光譜[12]。每種生物都有其獨特的振動模式,包括峰位置、峰高和峰形信息,這些信息構成了生物材料的“指紋”[12-14]。因此,使用生物光譜法,可表征消毒前后生物分子的變化情況,進而通過多元統計分析快速評估消毒效果。主成分分析(PCA)是一種無監督分析方法,可被用于降低復雜數據集中的維數,同時在10個主成分(PC)中捕獲大部分生化信息[14]。線性判別分析(LDA)使組間方差最大化,同時使組內方差最小化[15],結果以得分圖和載荷圖呈現。得分圖通過組間距離直觀地顯示處理組和對照組之間的差異;而載荷圖可識別與化學物質引起的生物大分子變化相關的紅外波數。對聚類矢量圖中最突出的5個波數進行重點分析,以識別主要生化水平的變化。

本研究采用生物紅外光譜與多元統計分析相結合的方法,從生化水平進一步探討3種常用消毒劑(NaClO、H2O2和UV輻射)的消毒機理,以快速評價其消毒效果。選取2種具有代表性的細菌(革蘭氏陰性大腸桿菌(Escherichiacoli,簡稱E.coli)和革蘭氏陽性海氏腸球菌(Enterococcushirae,簡稱E.hirae)作為受試菌種,獲得其生化信息,并對其進行處理,以反映消毒后生物分子的變化。本研究有助于更好地理解消毒劑的消毒機理,更快速地對消毒效果進行評價,有助于優化消毒工藝,更好地保障用水安全。

1 研究方法

1.1 細胞培養

革蘭氏陰性菌E.coli(ATCC 8099)和革蘭氏陽性菌E.hirae(ATCC 8043)從廣東省菌種采集中心獲得,在Mueller-Hinton (MH)肉湯培養基中培養,溫度37 ℃,轉速150 r/min。將實驗用的細菌培養過夜,離心5 min (4 ℃,5 000 r/min),然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4)懸浮。

1.2 消毒劑

有效氯約為4.00%～4.99%的NaClO購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)并儲存于4 ℃。配制原液,并用余氯分析儀(pocket colorimeter TM II) (Hach Co.)測定HClO濃度。H2O2溶液(～30%)購自廣州化學試劑廠。用超純水配制H2O2原液,并用高錳酸鉀滴定法測定其濃度。紫外輻射由紫外燈產生,波長集中在254 nm,輻射強度由紫外輻照計(Sentry Optronics Co.)測量。

1.3 中和劑鑒定試驗

為了在實驗結束時對殘留的消毒劑進行有效中和,停止其與微生物繼續反應,需要在滅菌試驗之前進行中和劑鑒定試驗,以選擇合適的中和劑。本試驗共設8組:(1)消毒劑+細菌懸浮液,檢測消毒效果;(2)(消毒劑+細菌懸浮液)+中和劑,檢測殘留消毒劑中和時的細菌回收能力;(3)中和劑+細菌懸浮液,檢測中和劑的滅活情況;(4)(消毒劑+中和劑)+細菌懸浮液,進行中和后產品的滅活試驗;(5)參照對照,用PBS代替消毒劑;(6)只使用PBS,確保PBS無菌;(7)只使用中和劑,確保中和劑無菌;(8)介質控制。選擇合適的中和劑已符合以下要求:第6、7、8組無菌,第3、4、5組的細菌數量相近,誤差率可控制在10%以內,第2組的細菌數量多于第1組,但少于3、4、5組。

1.4 消毒試驗

消毒試驗在超凈工作臺(SW-CJ-3FD,蘇州安泰愛爾科技有限公司)上進行,溫度控制在(20±1)℃。在2 mL試管體系內進行消毒反應,細菌數量保持在1×107～5×108CFU/mL。實驗前配制消毒劑濃度,用PBS稀釋。向每支容積為2 mL的試管中加入20 μL的細菌懸浮液,轉移至不同濃度的消毒劑(180 μL)中混勻。在規定的時間,取上述混合液100 μL加入試管中,每支試管中預先加入1.9 mL中和劑。10 min后收集細菌樣本,用于菌落平板計數和FTIR分析。

紫外線消毒試驗在清潔工作臺的水平紫外線燈下進行。將6孔板置于適當位置,每孔板含5 mL細菌懸浮液,紫外的輻射強度為100 mJ/cm2。紫外滅菌前,應將紫外燈提前20 min打開以穩定輻射強度。當輻射暴露實驗完成后,立即用錫紙覆蓋細菌懸浮液,防止進一步的紫外線輻射。然后采集細菌樣本進行后續分析。細菌計數公式為:

細菌對數殺滅率=lg(N0/Nt),

化學消毒劑劑量=Ct,

UV劑量=kt,

其中,N0為未處理細菌數量,Nt為處理后細菌數量,C為NaClO或H2O2濃度,t為暴露時間,k為UV輻射強度。

1.5 細菌滅活分析

用平板計數法測定抑菌活性。將細菌懸浮液用PBS溶液依次稀釋,用移液器取0.1 mL菌懸液滴在營養瓊脂平板上涂抹均勻。將細菌在恒溫培養箱(37 ℃)的一次性培養皿中培養24 h后,用平板菌落計數法測定細菌生長情況。此外,在細菌滅活處理后,取0.1 mL菌懸液,離心5 min (5 867 g,4 ℃),采用PBS洗滌,用質量分數為10%的中性福爾馬林溶液固定。最后用傅立葉變換紅外光譜儀檢測細菌的生物學效應。

1.6 FTIR光譜分析

對固定后的細菌懸液采用超純水沖洗3次并離心,用100 μL超純水重懸,用移液器轉移2 μL于BaF2載玻片上,然后在干燥器中干燥12 h。使用Bruker Vertex 70 FTIR光譜儀(Bruker Optics)進行紅外光譜測試。每張載玻片共獲得25張光譜圖,每個處理包含3個平行實驗。光譜采集分辨率為4 cm-1,掃描次數達64次。在生化指紋區(1 800～900 cm-1)獲取原始細菌光譜數據,經基線校正后將光譜信息歸一化至酰胺I (1 650 cm-1)。隨后,使用MATLAB r2010a中的IRootLab[16]對數據集進行主成分分析-線性判別分析(Principal Component Analysis-Linear Discriminant Analysis,PCA-LDA)。結果包含2種信息:(1)實驗組與對照組之間的差異大小;(2)實驗組與對照組之間的差異波數。

這對于酒店管理專業實踐教學質量的進一步提升起到良好的促進作用，同時也可以使得酒店管理專業的學生可以實現自身的良好發展。

1.7 數據分析

用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett’s檢驗(Dunnett’s post-hoc tests)分析LD1空間得分的統計學差異。采用S型劑量-反應法對非線性曲線進行擬合分析。所有統計分析在GraphPad Prism 4軟件(GraphPad software Inc.,USA)中進行。

2 結果與討論

2.1 細菌失活動力學

3種試驗消毒劑的滅活曲線如圖1所示。細菌對數殺滅率與暴露劑量呈顯著正相關關系(P<0.05),符合S型曲線。對于E.coli,NaClO、H2O2和UV分別在89.60 min·mg/L、75.18 min·g/L和41.32 min·mJ/cm2時的對數殺滅率為2。在E.hirae中,NaClO、H2O2和UV暴露劑量分別為91.11 min·mg/L、95.84 min·g/L和126.68 min·mJ/cm2時可獲得對數殺滅率為2的滅活效果。

圖1 NaClO、H2O2和UV對E.coli和E.hirae的暴露劑量-對數殺滅關系

由實驗所得對數殺滅率可知,這三類消毒劑中,NaClO對2種細菌均表現出較好的殺滅效果;H2O2處理對E.coli的失活能力大于對E.hirae的失活能力,在300 min·g/L的質量濃度下,其對數殺滅率僅為2.3;紫外光處理對E.coli的失活能力也大于對E.hirae的失活能力。受試消毒劑均有滅活能力,但NaClO組的殺菌效果最好。對比研究2種細菌發現,革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對消毒劑表現出更強的抗性。

2.2 生物變化

對于E.coli,LD1得分圖顯示了消毒劑殺滅組與對照組之間的差異(圖2)。在用NaClO處理的E.coli中,生化信息變化效應是非線性的,并且隨著暴露劑量的增加而增加。NaClO引起的生物變化主要與酰胺II(1 543 cm-1)的C—N鍵伸縮振動和N—H鍵彎曲振動、酰胺I(1 624 cm-1)的C=O伸縮振動、糖原(1 030 cm-1)的C—O鍵伸縮振動、DNA/RNA(1 084 cm-1)的對稱磷酸伸縮振動以及脂質(1 747 cm-1)的C=O伸縮振動相關(表1)。在H2O2處理的細胞中,也存在劑量-效應關系。主要的生化信息變化與酰胺II(1 543 cm-1)、酰胺I(1 608 cm-1)、脂質(1 724 cm-1)和糖原(1 018 cm-1)有關。對于暴露在紫外線下的細胞,基于生物大分子變化的影響也隨暴露劑量的增加而增加,主要振動發生在酰胺I(1 651、1 597 cm-1)、蛋白質磷酸化(987 cm-1)、糖原(1 107 cm-1)和DNA/RNA的不對稱磷酸伸縮振動(1 230 cm-1)。

表1 不同劑量消毒劑處理的E.coli和E.hirae的前5個峰的峰指認

圖2 不同劑量消毒劑處理E.coli的紅外光譜分析

如圖3、表1所示,當E.hirae暴露在NaClO中,隨著暴露劑量的增加,存在明顯的劑量效應關系,主要的生物學變化與酰胺I(1 624、1 658 cm-1)、糖原(1 061 cm-1)、RNA(995 cm-1) 以及碳水化合物(1 161 cm-1)相關。H2O2處理的細胞主要振動與糖原(999、1 064 cm-1)、酰胺I(1 624 cm-1)、DNA/RNA(1 246 cm-1)和酰胺II(1 523 cm-1)有關。對于暴露在紫外線輻射下的E.hirae,其生物大分子的變化情況與E.coli暴露組不同。從兩者暴露于紫外線的EC50可以看出,革蘭氏陰性菌(EC50=0.58)比革蘭氏陽性菌(EC50=48.3)對紫外線更敏感,且兩者在紫外線誘導下的主要生物改變也有所不同。如表1所示,對于E.hirae,紫外線引起的主要振動與酰胺I(1 662 cm-1)、脂質(1 701 cm-1)、酰胺II(1 520 cm-1)、DNA/RNA(1 215 cm-1)和糖原(1 030 cm-1)有關。

圖3 不同劑量消毒劑處理的E.hirae的紅外光譜分析

2.3 不同消毒劑介導生化信息變化的比較

為了確定3種消毒劑引起的生物變化差異,在對暴露的細菌分別進行2-log失活測試后,獲得了另一個數據集。如圖4的評分圖所示,在LD1和LD2上觀察到處理組和對照組之間的明顯分離。不同消毒劑處理組在評分圖上的距離代表不同的效應變化。由于在E.coli中用不同的消毒劑處理細胞,當細胞減少為2-log時,處理后的細胞與對照組之間的距離相似,表明基于生化信息的影響具有可比性。這些差異主要表現為酰胺Ⅱ(1 585、1 539 cm-1)、酰胺I(1 655 cm-1)、脂質(1 701、1 739 cm-1)、氨基酸殘留(1 408 cm-1)和蛋白磷酸化(933 cm-1)。對于E.hirae,不同處理組和對照組之間的評分圖中距離的變化更大。沿LD1方向的不同距離從大到小順序:NaClO、H2O2、UV(圖4B),說明消毒劑有不同的滅活能力。主要的生物變化與酰胺I(1 628 cm-1)、糖原(999、1 064 cm-1)、碳水化合物(1 118 cm-1)、酰胺III(1 180 cm-1)、DNA/RNA(1 230 cm-1)和蛋白質(1 458 cm-1)有關。結果表明:NaClO比H2O2和UV暴露引起的生物變化更大。

圖4 E.coli和E.hirae 2-log滅活狀態下的紅外光譜PCA-LDA得分圖和聚類向量圖

如圖5所示,對數失活和由3種不同消毒劑引起的2種不同細菌的生物變化之間明顯關聯。在NaClO處理后,E.coli(R2>0.9)和E.hirae(R2>0.8)的對數失活與生物變化關系可以用線性模型擬合,而在H2O2或UV處理后,用二次函數(R2>0.8)擬合對數失活與生物變化的關系更合適。

圖5 消毒能力與生物變化的回歸分析

2.4 消毒效果分析

本研究表明3種消毒劑的細菌滅活能力不同,并得出了個體的生物大分子變化概況?？偟膩碚f,NaClO的消毒效率最高,其次是H2O2和UV。3種消毒劑對革蘭氏陰性菌的消毒效果均優于對革蘭氏陽性菌的消毒效果。細菌滅活與生物大分子變化信息之間的良好關聯意味著基于FTIR光譜技術可用于快速評估消毒劑的消毒能力。

用NaClO處理不同的細菌可獲得相似的失活效果,但其生物大分子水平的變化情況不同。在革蘭氏陰性菌中,它主要影響蛋白質二級結構的β-轉角,β-轉角含量的增加會導致蛋白質結構穩定性的降低。研究表明,β-轉角結構與酶活性和功能密切相關[17-18]。NaClO暴露可影響DNA的合成[19],A1030/A1080的降低也表明其對DNA的損傷作用。此外,作為膜損傷的第一步,脂質過氧化可能導致膜通透性和流動性的變化[20-22],這與本文觀察到的脂質C=O的振動一致。在革蘭氏陽性菌中,被歸因于蛋白質乙?；腁1624/A1658的降低[23-24],可能與酶活性和蛋白質之間的相互作用有關,導致糖酵解過程中酶活性降低[25]。這與NaClO處理后碳水化合物振動和細胞ATP耗竭相一致[19]。此外,RNA相關振動的減少表明生物效應與核酸的合成有關[26]。研究表明ClO-不僅能與外膜反應,而且能穿透細胞攻擊大分子,導致膜脂質過氧化、改變膜透性和細胞內物質釋放、ATP耗竭、酶的結構和功能的變化以及核酸的合成[20,27]。BAKER等[28]系統地研究了NaClO與蛋白質的反應,結果表明:氯化和氧化同時發生,導致蛋白質中氨基酸和氨基酸殘基的斷裂,以及蛋白質中肽鍵以外的基團斷裂。也有研究發現,當蛋白質與稀釋的NaClO孵育時,蛋白質會變成碎片[29-30]。本研究進一步表明,暴露于NaClO的細菌會導致膜脂質結構的改變和過氧化,進而可能引起蛋白質二級結構的改變,并對DNA和其他細胞間物質造成損傷。

經過H2O2處理后,2種細菌的失活能力明顯不同(圖1)。對于革蘭氏陰性菌,其基本的生物學機制包括A1608/A1670的降低,這歸因于蛋白質二級結構的β-轉角和β-折疊。β-折疊和β-轉角在蛋白質穩定性和分子識別中起著重要作用[31]。它還誘導了脂質變化,這與膜脂質結構、磷脂雙分子層的流動性和通透性相關[27,32]。在革蘭氏陽性菌中,H2O2處理后的生物學機制主要與能量代謝振動、蛋白質β-轉角結構以及DNA/RNA損傷有關。H2O2作為最強的氧化劑,很容易打破E.coli的細胞壁保護屏障,與蛋白質、膜脂質等細胞間物質相互作用,破壞酶和功能蛋白,改變能量代謝[33]。E.hirae的細胞壁保護屏障更強[17],H2O2光解產生的自由基主要與大分子反應,破壞細胞壁上的交聯網狀結構,然后進入細胞內環境誘導抗氧化反應,并產生ROS氧化蛋白和脂質[34]。

由于不同的生物學機制,紫外線輻射對革蘭氏陰性菌比對革蘭氏陽性菌具有更好的失活能力[35]。對于革蘭氏陰性菌,紫外線照射引起的主要變化與蛋白質二級結構α-螺旋的減少有關,這可能導致蛋白質結構的松動[36]。紫外線照射還會導致蛋白質磷酸化的變化,這可能會影響蛋白質的活性和功能[37],并導致信號轉導受阻,從而影響細胞生長[38]。本研究觀察到的紅外振動中也觀察到核酸的改變,其他研究中表明的對DNA合成的影響為這一現象提供了有力支持[32,39]。然而,對于革蘭氏陽性菌,紫外線處理的重要影響是β-折疊含量增加和脂質減少,同時還觀察到核酸和能量代謝的改變。因此,紫外線輻射的主要機制被認為是對核酸的損傷、蛋白質、脂質和其他細胞間物質的改變[36,40]。

3 結論

采用紅外光譜和化學計量學相結合的方法,探討了3種消毒劑的生物效應。研究結果為分子水平上的消毒機制提供了新的見解。主要得出以下結論:

(1)經不同消毒劑處理后,革蘭氏陰性E.coli和革蘭氏陽性E.hirae都有明顯的改變,且革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更易受消毒劑的影響。

(2)NaClO、H2O2以及紫外線消毒3類消毒劑中,NaClO對2種細菌均表現出較好的殺滅效果;而H2O2處理以及紫外線處理對E.coli的失活能力均大于對E.hirae的失活能力。