miR-1271-5p靶向F13A1基因對口腔鱗狀細胞癌的調控作用

徐培 王佳 陶冶 張晨 夏巖

摘 要：目的：探討miR-1271-5p靶向F13A1基因對口腔鱗狀細胞癌增殖和凋亡的調控作用。方法：培養OSCC細胞系SCC154細胞和人正?？谇唤琴|形成細胞NHOK，檢測miR-1271-5p、F13A1的表達。將細胞分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組，MTT檢測細胞增殖，流式檢測細胞凋亡，RT-qPCR 和WB檢測F13A1的表達。雙熒光素酶報告驗證miR-1271-5p與F13A1的靶向關系。將細胞分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1組，MTT檢測細胞增殖，流式檢測細胞凋亡。結果：與人正?？谇唤琴|形成細胞NHOK比，OSCC細胞miR-1271-5p表達降低，F13A1表達升高。相比于mimics NC組，mimics miR-1271-5p組細胞活力降低，細胞凋亡率增加，F13A1表達顯著降低（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p組F13A1表達顯著升高（P<0.05）。相對于mimics miR-1271-5p組，過表達F13A1逆轉miR-1271-5p對OSCC的抗增殖和促凋亡作用（P<0.05）。結論：miR-1271-5p靶向F13A1基因抑制OSCC細胞增殖，促進細胞凋亡。

關鍵詞：口腔鱗狀細胞癌；miR-1271-5p；F13A1；增殖；凋亡

中圖分類號：R739.8 ?文獻標識碼：A ?文章編號：1673-260X（2023）07-0024-05

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔癌的主要類型，口腔癌90%由鱗狀細胞癌構成[1，2]。microRNA已被廣泛認為與癌細胞抵抗化療干預的能力有關，研究發現microRNA與OSCC的發生發展緊密相關[3]。近年來對microRNA在OSCC中的作用逐漸被發現[4，5]。據報道，miR-1271-5p參與許多人類癌癥的進展，如miR-1271-5p被證實在卵巢癌[6]、子宮內膜癌[7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]等疾病發揮關鍵調控作用。如研究表明miR-1271-5p在卵巢癌中抑制腫瘤發生[10]。此外，龍健等[11]發現miR-1271-5p靶向負調控FSCN1的表達，miR-1271-5p通過對FSCN1的調控從而抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，有望成為肺癌的關鍵治療靶點。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F13）是一種異酶原四聚體，參與凝血、傷口愈合、血管生成、腫瘤生長和細胞凋亡等過程。研究表明F13A1可能與OSCC的轉移有關[12]，血栓形成相關的基因F13A1編碼因子的功能性DNA多態性與口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的風險增加相關[13]。miR-1271-5p在OSCC中的作用尚未明確，且miR-1271-5p對F13A1的作用也未見報道。生物信息學分析發現miR-1271-5p與F13A1具有潛在靶向關系，但miR-1271-5p是否通過靶向F13A1調控口腔鱗狀細胞癌尚未可知。本研究將探討miR-1271-5p靶向F13A1基因對口腔鱗狀細胞癌的調控作用，旨在為發現新的口腔癌治療方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

OSCC細胞系（Tca8113、SNU899、SCC154）和正常人類口腔角質形成細胞株（NHOK）購買于美國典型培養物保藏中心（ATCC， Rockville， Maryland， USA）；Eagle培養基、10%胎牛血清均購自美國Gibco公司；轉染載體購自genchemhem（上海，中國）；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TRIzol、MTT試劑盒購自賽默飛生物科技公司；雙熒光素酶試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；一抗、二抗均購自Abcam公司；流式細胞儀（FACSCalibur）購自美國BD公司；qRT-PCR基因檢測試劑盒（QPG-023）購自Takara；熒光定量PCR儀（ABI7500）購自上海派克生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染

OSCC細胞系Tca8113、SNU899、SCC154和正常人類口腔角質形成細胞（NHOK）在37°C的Dulbecco改良Eagle培養基中培養，添加10%胎牛血清，在5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞提前1天以3.0×105細胞/皿的密度播種到60mm的培養皿中培養24小時。分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組、inhibitors miR-1271-5p、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1組，依照Lipofectamine 2000說明書進行細胞轉染。

1.2.2 RT-qPCR檢測SCC154中miR-1271-5p、F13A1 mRNA相對表達量

取復蘇后的SCC154，加入1ml TRIzol提取RNA，根據cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，依照Premix Ex TaqTMII試劑盒進行反應體系設置。參照ABI7500型定量PCR儀進行RT-qPCR反應，基因引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖

取上述各組細胞，以1×103個/ml的密度接種于96孔板，每組3個重復。分別在不同時間段24h、48h、72h加入20μl的MTT溶液，細胞培養48小時后振蕩混勻置于酶標儀，檢測490nm處吸光度值，并計算細胞增殖率。

1.2.4 流式檢測細胞凋亡

細胞濃度為1×106時，用75%乙醇固定細胞；用預冷PBS洗滌2次，懸浮在1×Annexin緩沖液中，加入5μl Annexin V-FITC以及15μL PI染液，室溫下黑暗保存15分鐘。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 Western免疫印跡實驗檢測蛋白表達

用RIPA裂解緩沖液裂解細胞，用雙二酚酸蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。采用12% SDS PAGE分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜，用5%（w/v）脫脂奶粉室溫封閉1小時。洗膜后，加入一抗孵育4℃過夜，TBST沖洗，加入二抗室溫下孵育1小時。TBST沖洗后利用ECL試劑顯色并拍照儲存。Imagel J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶驗證miR-1271-5p和F13A1的靶向關系

StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測miR-1271-5p和F13A1之間的結合位點，并利用雙熒光素酶報告實驗驗證靶向關系。根據預測結果設計并合成野生型序列（WT-F13A1）和突變型序列（MT-F13A1），然后分別與mimics NC或mimics miR-1271-5p共轉染到OSCC細胞中。同時將mimics NC、mimics miR-1271-5p、inhibitors miR-1271-5p共轉染至OSCC細胞中。孵育48h后，根據雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.2.7 統計分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，所有符合正態分布的定量數據均表示為x±s，兩組間比較采用t檢驗，三組及以上組間數據分析采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OSCC細胞系中miR-1271-5p低表達，F13A1高表達

與正常細胞系NHOK相比，OSCC細胞系Tca8113、SNU899中miR-1271-5p表達水平明顯增加（P<0.05），而SCC25的表達水平顯著降低（P<0.05）。qRT-PCR和WB檢測SCC25細胞中F13A1表達，與對照組相比，SCC25細胞中F13A1表達明顯升高（P<0.05）。后續選擇SCC154進行實驗。

2.2 過表達miR-1271-5p抑制OSCC細胞增殖，促進細胞凋亡

與mimics NC組相比，mimics miR-1271-5p組細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡顯著增強（P<0.05）。

2.3 miR-1271-5p靶向負調控F13A1的表達

Starbase數據庫預測到miR-1271-5p與F13A1之間存在直接結合位點。相對于共轉染MT-F13A1與mimic-NC，共轉染WT-F13A1與miR-1271-5p mimic時熒光素酶活性明顯降低（P<0.05）。與mimic-NC組相比，mimics miR-1271-5p組F13A1表達被抑制（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p組F13A1表達顯著升高（P<0.05）。

2.4 過表達F13A1逆轉miR-1271-5p對OSCC的抗增殖和促凋亡作用

與對照組相比，mimics miR-1271-5p顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡（P<0.05），mimics miR-1271-5p+OE-F13A1和對照組相比無統計學意義（P>0.05），表明F13A1可以逆轉miR-1271-5p過表達對OSCC的抗增殖和促凋亡影響。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是頭頸部癌癥中最常見的一種，在中南亞人群中發病率最高，近年來發病率持續上升，全球5年生存率保持在50%左右[14]。本研究檢測了OSCC細胞系SCC154細胞和人正?？谇唤琴|形成細胞NHOK中miR-1271-5p、F13A1的表達，并驗證了miR-1271-5p與F13A1之間的靶向關系，發現過表達miR-1271-5p抑制OSCC細胞增殖，促進細胞凋亡，過表達F13A1逆轉miR-1271-5p對OSCC的抗增殖和促凋亡作用。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F13）是一種異酶原四聚體，也稱纖維蛋白穩定因子，是轉谷氨酞胺酶（TGases）家族其中一員[15]。FXIII-A基因（F13A1）在骨髓和間充質系細胞中表達，尤其是巨核細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、計時細胞、成骨細胞和前脂肪細胞[16]。王淮等[17]利用生物信息學方法對F13A1的CpG島、啟動子及轉錄因子結合位點進行分析，發現F13A1存在多個啟動子區域和轉錄因子結合位點，參與細胞內多種細胞成分組成。Li等[18]在血清外泌體（SE）中鑒定出F13A1的表達與陽性淋巴結數量顯著相關，預測可以幫助OSCC轉移的診斷。Vylliotis等[13]研究血栓形成相關的基因編碼因子F13A1等的功能性DNA多態性，發現與OSCC的風險增加有關。研究證明F13A1可作為肺癌患者潛在的新的診斷和治療靶點[19]。此外，有報道F13A1還可作為結直腸癌篩查的新生物標志物[20]。本研究證實F13A1在OSCC中高表達，且與miR-1271-5p表達呈負相關。雙熒光素酶報告顯示miR-1271-5p與F13A1具有直接靶向關系，過表達miR-1271-5p顯示F13A1表達下降，表明miR-1271-5p可能靶向調節F13A1的表達。

miR-1271-5p近年來被發現在多種癌癥調控中具有關鍵作用，Han等[21]研究表明miR-1271-5p通過調控下游靶基因TIAM1抑制卵巢癌細胞的增殖。根據Zhang等[22]研究，LncRNA ZFAS1/miR-12 71-5p/HK2通過調節細胞增殖和凋亡促進膠質瘤的發展。王勇等[23]研究表明miR-1271-5p通過干擾DOCK1基因明顯抑制腎癌細胞增殖，促進凋亡，有望成為未來RCC治療的分子靶標。為了研究miR-1271-5p在OSCC中的作用，本研究過表達miR-1271-5p后，OSCC細胞增殖能力下降，細胞凋亡增強。繼續過表達F13A1后，逆轉miR-1271-5p對OSCC的抗增殖和促凋亡作用。表明miR-1271-5p可以通過靶向負調節F13A1的表達進而抑制癌細胞的增殖，促進凋亡。這與龍健等[11]研究miR-1271-5p對肺癌細胞的作用結果一致。表明miR-1271-5p對口腔癌的調控具有關鍵作用。

綜上所述，過表達miR-1271-5p具有抑制OSCC細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。miR-1271-5p可以靶向負調節F13A1的表達，過表達F13A1逆轉miR-1271-5p對OSCC的抗增殖和促凋亡作用。因此，我們推測miR-1271-5p通過靶向負調節F13A1的表達促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。但本實驗僅涉及體外細胞實驗，沒有做近一步的動物實驗，具有一定的局限性，有待深入的研究證實。

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