高遷移率族蛋白B1在牙周炎中作用機制的研究進展*

鄒浩冬，楊 飛，張莞嫣，王 拓，吳 艷

川北醫學院附屬醫院 口腔科（南充 637000）

牙周炎指發生在牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，是導致牙齒缺失的主要原因。我國牙周炎發病率為70%～90%?，F代觀點認為，牙周炎發生的始動因素為菌斑，宿主對菌斑微生物及其產物的免疫應答反應也是牙周支持組織破壞的重要因素[1]。在牙周炎的發生發展過程中，有多種炎癥細胞和炎性介質的參與，其中1 個重要的細胞因子是高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）。HMGB1 在細胞核內含量豐富并參與基因調控，在細胞外作為一種重要的晚期炎性介質和細胞因子，參與了肺炎、胰腺炎、關節炎及膿毒癥等疾病的發生發展[2]。近期有研究[3-4]表明，HMGB1 與牙周炎關系密切。本文對HMGB1 的生物學特性及其與牙周炎的相關性研究作一綜述，以期為HMGB1 與牙周炎作用的相關受體和信號通路的病理機制提供依據，并為牙周炎的臨床診治提供新思路。

1 HMGB1 概述

HMGB1 廣泛表達于有核哺乳動物細胞中，其是一種調節轉錄的高度保守核蛋白，也是一種損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）。在細胞核中，HMGB1 與DNA結合，作為結構因子在基因復制、轉錄和修復過程中發揮重要作用[5]；在細胞外，通過自身或與細胞因子及其他外源性和內源性分子的復合物刺激先天免疫系統，介導炎癥和自身免疫性疾病[6-7]。

人HMGB1 基因位于13q12 染色體，有215 個氨基酸殘基，由2 個帶正電荷的同源DNA結合域（A盒，1～79 氨基酸殘基；B盒，95～163 氨基酸殘基）和c端帶負電荷的酸性尾巴（186～215 氨基酸殘基）組成[8]。HMGB1 的致炎作用主要存在于B盒中，最顯著的促炎功能定位于該結構域的20 個氨基酸殘基片段（殘基89～108），在受到刺激時誘導促炎信號；A盒可特異性拮抗B盒的促炎活性[9]。根據A盒第23、45 位點的半胱氨酸殘基（C23、C45）和B盒第106 位點的半胱氨酸殘基（C106）不同的氧化還原狀態，HMGB1 可分為氧化型HMGB1（oxidized HMGB1，ox-HMGB1）、二硫鍵型HMGB1（disulfide HMGB1，ds-HMGB1）和完全還原型HMGB1（fully reduced HMGB1，fr-HMGB1），這3 種保守半胱氨酸殘基的氧化還原狀態會調節HMGB1的受體結合能力和生物學功能[10-11]。Andersson等[12]研究表明，二硫鍵的亞型對組織有損傷，完全還原的亞型支持組織再生，而完全氧化的亞型缺乏確定的功能。Yang等[13]研究表明，能刺激細胞因子釋放的是ds-HMGB1（C23 和C45 間的二硫鍵，C106 保持其還原硫醇形式），ds-HMGB1 與Toll樣受體4/髓樣分化蛋白-2（Toll-like receptors 4/Myeloid differentiation protein-2，TLR4/MD-2）復合物中的MD-2 結合，并在培養的巨噬細胞中誘導腫瘤壞死因子的釋放和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路的激活。HMGB1 分泌到細胞外主要有兩種方式：1）細胞壞死或凋亡時通過破裂的細胞膜被動釋放HMGB1；2）單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、NK細胞、樹突狀細胞參與的主動分泌HMGB1。HMGB1 的乙?；潭葲Q定釋放方式[14-15]，被動釋放到細胞外的HMGB1 可作為壞死細胞的死亡標記物，而主動分泌的HMGB1 是機體炎癥反應的關鍵分子[16]。

2 HMGB1 與牙周炎相關受體和信號通路

細胞外HMGB1 主要通過與受體結合發揮促炎作用，迄今研究發現的HMGB1 受體已超過15 種[17]，其中與發揮促炎作用關系最密切的是晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced-glycation endproducts，RAGE） 和Toll樣 受 體（Toll-like receptors，TLRs）。HMGB1 與RAGE的結合位點位于殘基150～183，而殘基89～108 和殘基7～74 分別負責結合TLR4 和p53 反式激活結構域[18]。

2.1 RAGE

RAGE是一種多配體模式識別受體，與多種慢性炎癥反應相關，在單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、神經元及各種腫瘤細胞上均能檢測到RAGE表達。RAGE是一種跨膜蛋白，分為細胞外、跨膜和細胞內片段[19]；其最初被認為僅是晚期糖基化終產物（advanced glycation endproducts，AGEs）的受體。但Hudson等[19]研究表明，RAGE除了與AGEs特異結合，還可與HMGB1、S100、Aβ等配基相結合，Hori等[20]研究表明，HMGB1 與RAGE的結合能力高于AGEs。RAGE的配體結合可激活兩條主要途徑：CDC42/Rac途徑和經絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）最終激活的NF-κB信號通路[21]。Andersson等[12]研究發現，HMGB1 與RAGE受體相互作用導致炎癥介質產生，HMGB1 能單獨或和其他配體結合形成HMGB1 復合物后與RAGE結合，被內吞進入溶酶體系統；HMGB1能滲透酸性溶酶體的膜，使HMGB1 及HMGB1 運輸的配體避免降解和泄漏，接著配體接近胞質和核膜上的同源受體，相互作用合成增強炎癥的介質，加重炎癥反應。

HMGB1/RAGE軸與多種細胞效應有關，如誘導炎癥反應和血管生成、組織重塑和刺激細胞分化再生[22]。細胞膜上的RAGE在正常生理條件下處于較低水平，當機體的炎癥因子增加或機體受到創傷等異常狀況時，HMGB1 的含量增加，RAGE的表達上調[19]，當RAGE與配體結合時，能促進MAPK p38 蛋白的下游磷酸化，從而增加NF-κB信號通路的表達，NF-κB通過調節靶基因和觸發相關的炎癥及自身免疫反應來促進腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、HMGB1 等炎癥因子和細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等黏附分子的表達，從而導致持續的組織損傷。HMGB1 介導的RAGE刺激可通過上調RAGE表達及促進RAGE與其配體的結合來放大此種反應，形成1 條正反饋炎性環路，因此HMGB1 激活RAGE可以啟動和維持促炎表型[23-24]。Qin等[25]研究表明，HMGB1 蛋白的促炎活性與所含的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平相關，HMGB1與RAGE結合后增強LPS在體內和體外誘導促炎細胞因子的活性。胱天蛋白酶-1 及胱天蛋白酶-11 是介導細胞焦亡的關鍵因子，Lamkanfi等[26]和趙昕等[27]研究發現，對C57BL/6 小鼠使用胱天蛋白酶的泛抑制劑zVAD-fmk抑制胱天蛋白酶-1 及胱天蛋白酶-11介導的細胞焦亡后，其血清中HMGB1 的水平顯著降低。HMGB1 能在細胞外直接與LPS結合，RAGE將HMGB1-LPS復合物內化為內溶酶體，HMGB1 破壞溶酶體膜的穩定性，導致LPS釋放到細胞質基質中以激活胱天蛋白酶-11 獨立組裝成炎癥小體，對Gasdermin D（GSDMD）蛋白的特定位點進行切割，GSDMD活化引發質膜穿孔，進而發生細胞焦亡[28]。

HMGB1 作為一種重要的胞外晚期炎性遞質，參與了牙周炎的發病過程。Ito等[29]研究表明，在炎癥牙齦組織中，HMGB1 和RAGE表達量升高，且人牙齦上皮細胞和成纖維細胞能通過HMGB1/RAGE對IL-1β的刺激產生免疫應答，促炎因子IL-1β釋放到細胞外，在牙周組織中介導一系列炎癥反應，包括誘導白細胞的驅化作用、增加基質金屬蛋白酶的產生、導致結締組織破壞、促進前列腺素E2 的產生使破骨細胞增多和加重破骨性骨吸收等，促進牙周炎的病理進程，最終導致牙齒松動、脫落[30]。在牙周組織中，牙齦上皮細胞、牙齦成纖維細胞及牙周膜干細胞等經過LPS/HMGB1/RAGE激活胱天蛋白酶-11 發生細胞焦亡，直接造成牙周組織和牙齦上皮屏障破壞、附著喪失和牙槽骨吸收等；同時巨噬細胞發生焦亡所釋放的大量促炎因子及趨化因子會引起牙周組織中大量炎癥細胞的聚集，并伴隨基質金屬蛋白酶、膠原酶的分泌，破骨細胞的分化和成熟，引起牙齦和牙周膜組織中的膠原降解，從而間接損傷牙周組織[31]。Plemmenos等[32]研究表明，在炎癥情況下AGEs/RAGE軸在牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞、上皮細胞、內皮細胞中均有高表達，引起以上細胞的焦亡，導致牙周炎癥加重。因此推斷在牙周組織中HMGB1 和RAGE的結合也能觸發牙周組織中的炎癥反應，破壞牙周膜成纖維細胞的活力，并對骨細胞的骨代謝產生負面影響，從而造成牙槽骨的吸收。但有體內外實驗[22]結果顯示，HMGB1 和RAGE通過影響宿主炎癥免疫反應的平衡，包括巨噬細胞遷移和M1/M2 極化、間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）標志物表達，共同調節骨基質沉積。因此筆者推測HMGB1可能通過這種路徑促進牙槽骨成骨過程，參與牙周組織的修復再生。

2.2 TLRs

TLRs是I型跨膜超家族成員，是一種模式識別受體，能檢測病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），并 感 知DAMPs模 式，引發機體的先天免疫反應[33]。TLRs的信號傳導通常分為兩種不同的途徑，即基于髓樣分化因子88（myeloid differentiation protein，MyD88）及TIR結構域銜 接 蛋 白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）對下游信號級聯的募集[34]。HMGB1能夠與TLR2、TLR4 和TLR9 結合，結合后激活MyD88以激活干擾素調節和NF-κB通路，產生炎癥和免疫應答的細胞因子和趨化因子[35]。TLR4/MD-2是巨噬細胞中HMGB1 誘導產生的受體復合物，He等[36]和Sun等[37]研究結果表明，HMGB1/TLR4/MD-2的相互作用通過HMGB1/TLR4 結合A盒結構域啟動；且一旦靠近，HMGB1 B盒結構域與MD-2 結合，誘導TLR4/MD-2 復合物的二聚化，引起細胞內下游炎癥通路的激活和炎性細胞因子的釋放。在靜息狀態下，NF-κB與抑制劑分子NF-κB抑制物（inhibitor of NF-κB，IκB）結合，并以非活性復合體的形式存在于細胞質中。HMGB1 與TLR4 或RAGE結合后，快速將信號傳導至IκB激酶復合物（IκBkinase complex，IKK）上，隨后IκB蛋白磷酸化成為蛋白酶體并被快速降解，導致NF-κB二聚體釋放并易位到細胞核中，在核易位之后，與特定的DNA位點結合，激活NF-κB調節的靶基因轉錄，通過調節靶基因和觸發相關炎癥、自身免疫反應來促進炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、HMGB1等）的表達，從而導致持續的組織損傷。當NF-κB被激活時，其可促進RAGE與其配體的結合，并進一步促進細胞因子和組織因子的持續表達，形成1條正反饋炎癥環路[38-39]。同時在白細胞中，HMGB1 可與TLR2 結合進行信號傳導激活ICAM-1 受體CD11b/CD18，CD11b/CD18 和ICAM-1 之間的相互作用也能導致NF-κB激活[21]。除TLR2外，RAGE還有助于CD11b/CD18在嗜中性粒細胞上的激活。因此，HMGB1 與RAGE和TLRs結合激活的信號通路間的相互作用可能發生在不同水平上，且均對NF-κB起著至關重要的作用，共同維持著自分泌或旁分泌正反饋炎癥通路。巨噬細胞是主要的防御細胞，炎癥微環境下，被激活的巨噬細胞不僅能向細胞外環境分泌HMGB1，還表達多種能與HMGB1 結合的表面受體。Li等[40]通過體內外實驗觀察到，重組HMGB1 的刺激增加了M1 型巨噬細胞來源的炎癥因子（TNF-α、IL-6 和MCP-1）水平和M1 型相關mRNA的表達，引起M2 型相關細胞因子（IL-10）水平和M2 型相關mRNA的表達降低；抗HMGB1 刺激則產生相反的結果。同時他們還證明了HMGB1 介導巨噬細胞中雙鏈RNA活化蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）的激活，并通過TLR2 和TLR4 介導的NF-κB信號通路作用于巨噬細胞，誘導巨噬細胞向M1 型極化，產生大量的炎癥因子，促進炎癥發展。

在牙周組織存在炎癥的情況下，牙齦上皮細胞受LPS、丁酸等刺激釋放HMGB1，隨后HMGB1 結合RAGE、TLR4/MD2、TLR2 等受體，促進自分泌/旁分泌信號傳導，通過激活NF-κB信號通路刺激巨噬細胞、中性粒細胞等產生IL-1β、IL-6、TNF-α和HMGB1 等細胞因子；同時LPS與HMGB1 結合后通過TLR2、TLR4途徑可促進M1 型巨噬細胞極化，極化的巨噬細胞通過MyD88 進行上游信號的傳遞，使NF-κB信號通路激活。因此HMGB1 處在炎癥環路中，其是刺激TNF-α和IL-1β等炎癥因子分泌的有效刺激因子；這些促炎細胞因子又會誘導其他牙周組織（如牙齦成纖維細胞、牙周韌帶等）進一步產生HMGB1[29]，炎癥進一步加重導致牙周組織的進行性破壞。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是存在于牙周膜中一種具有未分化間充質細胞特性的干細胞，能維持牙周膜的穩定性，且能分化成具有不同功能的成熟細胞，具有修復和再生受損牙周骨組織的成骨潛力。TLR4 是內毒素的主要受體，Wang等[41]研究結果顯示，LPS通過LPS/TLR4 信號傳導下調腎上腺素B2，抑制PDLSCs的成骨分化，因此HMGB1 可能與LPS結合通過此途徑影響牙周組織的再生修復。Kim等[42]研究發現，HMGB1處理人PDLSCs后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-11 和IL-17 mRNA的表達增加，它們被稱為細胞破骨因子，對PDLSCs的成骨分化具有抑制作用，有助于破骨細胞分化/活化，與牙周炎相關的骨質流失密切相關，由此推斷HMGB1 可通過結合TLRs或RAGE參與牙槽骨的破壞過程，但具體機制尚未明確。

2.3 負性受體

CD24 和TIM-3 是與HMGB1 結合的負性受體，負向調節HMGB1 激活的各項機體反應[18]。CD24 又稱熱穩定抗原，是一種高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇錨定表面蛋白，1987 年被發現，并與幾種損傷相關模式分子相關，如HMGB1、熱休克蛋白70 和熱休克蛋白90。Chen等[43]研究數據也揭示了CD24 能負向調節其刺激活動，并抑制NF-κB的激活，參與抑制感染、敗血癥和肝損傷等破壞性炎癥反應。Chiba等[44]研究證明，TIM-3 是HMGB1 的受體，TIM-3 可能通過調節核酸內切酶（如TREX1、FEN1）的活性來影響HMGB1 介導的核酸識別，這對于介導宿主DNA的降解至關重要。同時TIM-3 可抑制核內體中其他HMGB1 受體（如RAGE和TLR4）的活性。除在核酸介導的先天免疫系統中的作用外，TIM-3 還可調節HMGB1 的基因轉錄、自噬和氧化應激等其他功能。

CD24 是重要的副調節因子，在健康牙齦組織的結合上皮和溝內上皮中存在特征性高表達。研究[7，45]表明，CD24 抗體滴度與牙周病的嚴重程度呈負相關，CD24 與先天性免疫細胞上Siglec-10 相互作用，可抑制HMGB1 誘導的NF-κB信號通路的激活及下游促炎細胞因子的釋放，從而降低對牙周組織的破壞。

3 HMGB1 在牙周炎治療中的研究

部分研究[29-32]證實，HMGB1 參與了牙周炎的發生發展，通過抑制HMGB1 的功能以治療牙周炎成為目前研究的熱點。二甲雙胍是臨床治療2 型糖尿病的一線降糖藥物，除能降血糖外，還具有抗炎作用，可與HMGB1 結合并抑制HMGB1 的促炎活性。Araújo等[46]研究表明，二甲雙胍在結扎誘導的牙周炎大鼠中表現出抗炎、抗氧化活性，并能減少骨質的流失。Mollica等[47]研究發現，甘草酸能抑制HMGB1 的趨化能力及有絲分裂活性，對細胞核內DNA結合功能具有抑制作用，還對全身炎癥性疾病起抗炎作用。Ideguchi等[48]建立實驗性牙周炎小鼠模型以觀察甘草酸對牙周炎癥的影響，發現甘草酸以劑量依賴性方式抑制髓過氧化物酶的活性，減少破骨細胞和中性粒細胞的數量，從而抑制牙周炎癥的發展。因此甘草酸也是各種牙膏和漱口水的成分。Yoshihara-Hirata等[4]采用牙齦卟啉單胞菌浸泡的結扎物在小鼠中誘導實驗性牙周炎，通過免疫熒光分析，在牙周炎模型小鼠的牙齦上皮中證實了HMGB1 的細胞外移位，全身注射抗HMGB1 中和抗體可顯著抑制HMGB1 移位，抗HMGB1 抗體可抑制牙周炎癥、IL1β和C-X-C基序趨化因子配體1 的表達、中性粒細胞的遷移等。因此認為HMGB1 是牙周炎發生和發展的關鍵調節因子，并且對將來牙周炎的治療提供了新的思路。

4 小結與展望

HMGB1 作為一種炎癥因子，通過不同形式與不同的受體、配體結合激活不同的信號通路，可形成正反饋炎癥促進環路，與牙周組織的病理化過程密切相關；同時可能參與了牙周組織的修復，但其在牙周炎中的釋放模式及具體作用機制尚需行進一步探索。HMGB1 阻斷劑的使用可降低炎癥反應的級聯放大效應，進而緩解牙周炎癥的進展。因此HMGB1 的表達量有可能作為牙周炎的臨床檢測指標來判斷患者的病變程度及治療效果，可能是牙周炎潛在的治療靶點。未來仍需進一步研究HMGB1 相關信號通路及其參與牙周炎的具體作用機制，以期研制HMGB1 相關抑制劑或調控因子，為牙周炎的精準靶向治療開辟新思路。