循環腫瘤DNA 在肝癌中的臨床應用進展

王汝堤，徐浩，劉斌，李嘉興，李偉生，陳秋虹，貝昊洋，李明意（廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524000）

原發性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，在全球范圍內發病率和死亡率均較高[1-3]。原發性肝癌包含肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝細胞癌-膽管癌（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA），其中HCC占75%～85%[4]，是肝癌最主要的病理類型。早發現、早治療是降低肝癌死亡率的有效途徑，目前主要通過聯合腫瘤標志物、影像學檢查、組織活檢等手段檢測腫瘤。1990-2017 年，隨著HCC 診斷靈敏性和治療效果的提高，中國年齡標準化死亡率下降了20.3%[2]。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）作為HCC 目前應用最廣泛的腫瘤標志物，已廣泛應用于肝癌的術前診斷及術后檢測復發，但是AFP 在HCC 的陽性率僅為70%，且部分肝硬化及乙型病毒性肝炎患者上也呈AFP 陽性[5]，以AFP 為代表的生物標志物的靈敏度和特異度已不能滿足當今《“健康中國2030”規劃綱要》對HCC 的防治要求[6]。近年來以循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）為代表的液體活檢技術因其高特異度、高靈敏度、實時性及微創性等優勢開始興起，并在肝癌篩查與治療領域發揮重大的作用。本文對ctDNA 在肝癌術前診斷、預后評估、術后復發預測及用藥指導等臨床應用及挑戰方面的研究進展作一綜述。

1 ctDNA 的研究內容和檢測手段

液態活檢技術是一項微創、主要利用人體血液研究腫瘤生物學特性的技術，包括ctDNA、循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）、循環腫瘤細胞（circulating tumour cell，CTC）、循環微RNA（circu-lating micro RNA，cmiRNA）等[7]。cfDNA 是在人體血液、尿液及其他體液中可以檢測到的高度降解DNA 片段，在正常人中大多數cfDNA 來源于白細胞甚至正常細胞，而血液中cfDNA 一般維持在較低水平，但在懷孕、劇烈運動、創傷、感染、中風、心肌梗死或手術后，cfDNA 含量會明顯升高[8-10]。ctDNA 從cfDNA 中發現，是由腫瘤細胞分泌或在腫瘤細胞壞死或調亡過程中釋放入循環系統中的DNA 片段，半衰期一般小于2 h，DNA 片段長度約為132～145 bp，ctDNA 攜帶來源于腫瘤細胞的遺傳學信息，如點突變、擴增、重排、DNA甲基化等基因突變形式，可作為腫瘤早期診斷、療效評估及預后評估的重要指標[11-12]。目前，肝癌的ctDNA 檢測技術主要有下一代測序（next-generation sequencing，NGS）、實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）、Sanger 法、數字PCR [dPCR，包括微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）和磁珠乳液擴增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）]、擴增阻滯突變系統聚合酶鏈反應（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）、靶向深度測序技術等[8，13-14]。

2 ctDNA 在肝癌中的臨床應用進展

肝癌有著非常高的發病率、復發率及死亡率，早發現、早治療及跟蹤檢測可顯著改善肝癌患者的總生存率（overall survival，OS）[15]。因此，尋找新的肝癌早期診斷生物標志物是近年來的研究熱點。

2.1 ctDNA 作為肝癌早期診斷的生物標志物

目前在肝癌領域常用的腫瘤生物標志物是AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）等，其中在肝癌患者中分別檢測血清AFP、CEA、CA199 的陽性率分別為76.19%、14.20%、45.20%，聯合檢測血清AFP、CEA、CA199 時陽性率為88.09%，而在肝硬化患者中陽性率也有58.33%[5]。傳統的生物標志物在肝癌早期診斷應用中沒有滿意的特異性，ctDNA 因其高特異度及靈敏度成為近期的研究熱點，通過檢測ctDNA 中的點突變、擴增、重排、DNA 甲基化等基因突變形式來早期識別腫瘤。研究表明，檢測血清中的RASSF1A 高甲基化可作為HCC 早期篩查的工具，且比AFP 有更高的檢出率，并且基因突變的拷貝數變異（copy number variation，CNA）與腫瘤大小的增加有相關性[16]。Huang 等[17]通過ddPCR 的方法在27 例HCC 患者術前的外周血中檢測到4 種基因位點突變[TP53（c.747G>T）、CTNNB1（c.121A>G 和c.133T>C）、TERT（c.1-124C>T）]，并排除了這些循環突變體的非腫瘤來源，證明ctDNA 可作為HCC 患者早期診斷的生物標志物。Jiang 等[18]研究發現HCC 患者術前ctDNA 監測中存在DNA 拷貝數變異，84.4% 的HCC 患者在1 號和8 號染色體的任意一條臂上至少有一個CNA，而32 例健康受試者中沒有出現相關的CNA，并存在CNA 陽性的乙肝病毒攜帶者和肝硬化患者在ctDNA 檢測后幾個月被診斷為肝癌案例，突出了其早期發現腫瘤的潛質。Xu 等[19]通過在715 個HCC患者的ctDNA 樣本和560 個正常人的cfDNA 樣本中建模，應用該模型的訓練數據集里，HCC 的靈敏度為85.7%，特異度為94.3%；而在383 例HCC 和275 例正常樣本的驗證數據集里，HCC 的靈敏度為83.3%，特異度為90.5%，顯示了ctDNA 比AFP 有著更高的靈敏度和特異度，ctDNA 作為一種新型生物標志物有著廣泛的前景。

2.2 ctDNA 對肝癌預后的評估

ctDNA 有微創性及標本易取等優勢，因此可對肝癌治療的全程進行跟蹤監測，也可以實時對肝癌治療效果及預后進行評估。Yu 等[20]對485 例經肝切除術的乙肝表面抗原陽性患者的XRCC1 rs25487 多態性和249 號密碼子TP53 突變進行直接測序，發現rs25487的A 等位基因（AA/AG）可能與不良預后相關，實時檢測肝癌的腫瘤負荷對腫瘤的預后評估及治療選擇有積極意義。Cai 等[21]整合了ctDNA 突變譜以評估HCC患者的腫瘤負荷，提前檢測微小殘留病變（minimal residual disease，MRD），并預測患者的無復發生存期（relapse free survival，RFS）（P=0.001）和OS（P=0.001）的預后結局。已有研究發現ctDNA 陰性的HCC 患者比ctDNA 陽性患者有更長的RFS[22]。Liao 等[23]應用MiSeqTM系統分析41 例HCC 患者的血漿和相關腫瘤DNA 樣本3 個常見基因突變，包括TERT、CTNNB1和TP53 基因，研究顯示在血漿ctDNA 中檢測到與腫瘤相關突變的患者的中位RFS 是89 d（34～299 d），而在血漿ctDNA 中未檢測到腫瘤相關突變的患者的中位RFS 是365 d（36～600 d）。這些研究結果表明ctDNA 陽性預示著不良的預后。

2.3 ctDNA 監測肝癌術后復發

已有研究表明ctDNA 可以監測肝癌術后復發，ctDNA 的半衰期較短，一般小于2 h，而傳統的蛋白質生物標志物半衰期卻要數天至數周，ctDNA 不僅能實時動態監測腫瘤術后復發，而且能更早提示MRD 的出現，術后ctDNA 陽性的HCC 患者比術后ctDNA 陰性者更容易出現早期復發或轉移[11，21]。Ono 等[24]分析了46 例接受肝切除術或肝移植的HCC 患者的全基因組測序數據，其中7 例在術前100 mL 血清樣本中檢測到ctDNA，且隨著疾病進展而增加，ctDNA 陽性組的累計復發和肝外轉移發生率明顯高于ctDNA 陰性組，多因素分析發現ctDNA 可作為門靜脈微血管浸潤（vascular invasion of the portal vein，VP）的獨立預測因子，ctDNA 的存在反映了腫瘤的進展，檢測ctDNA可以預測VP 和肝癌術后復發，特別是2 a 內的肝外轉移。DNA 甲基化等表觀遺傳修飾在調節癌細胞和正常細胞的基因活性方面起著關鍵作用[25]。Wong 等[26]在調查p15 和p16 甲基化在HCC 中的臨床相關性研究中發現，并發腫瘤甲基化與復發或轉移的發展之間存在顯著關聯，p15 和p16 甲基化異?？勺鳛镠CC 的診斷和預后標志。Cai 等[21]通過對34 例HCC 患者ctDNA 的SNVs 和CNVs 信息進行了綜合譜分析，評估各類變異與患者臨床病程的相關性，發現ctDNA可提前4.6 個月發現腫瘤，明顯優于血清生物標志物DCP、AFP 和AFP-l3%。Xia 等[22]在回顧性研究中發現，在肝切除術后無主要病理緩解（major pathological response，MPR）的患者中更容易出現ctDNA 陽性，其中突變最多的3 個基因是TP53（75%）、CTNNB1（33%）、TERT（33%），顯示了ctDNA 對HCC 術后復發的預測價值。Liao 等[23]在血漿ctDNA 中檢測到腫瘤相關突變的患者比那些未檢測到的患者更容易復發，且14 例隨訪期腫瘤未復發的患者的ctDNA 為陰性。

2.4 ctDNA 在肝癌治療中用藥的指導作用

靶向免疫治療在治療肝癌的一大挑戰就是腫瘤的異質性。腫瘤的異質性是指同一原發腫瘤內的不同腫瘤細胞群的遺傳和表觀遺傳譜不同，或同一患者的腫瘤轉移情況不同。腫瘤異質性使得普通的靶向免疫治療無法對肝癌進行針對性治療，而ctDNA 檢測可以全面分析患者腫瘤細胞釋放的DNA，且在遺傳和表觀遺傳改變方面保持腫瘤異質性，在靶向免疫治療上克服腫瘤異質性帶來的挑戰，揭示耐藥機制，提供更好的靶向免疫治療方案[12，27]。ctDNA 監測可以為HCC 患者提供基因組圖譜從而指導用藥并及時評估藥物療效。Ikeda 等[28]研究發現，1 例CDKN2A 失活及CTNNB1 激活突變患者在接受帕博西尼（CDK4/6抑制劑）和塞來昔布（COX-2/Wnt 抑制劑）2 個月的治療后發現AFP 基線水平較低，且脫-γ-羧基凝血酶原（des-gamma-carboxy prothrombin，DCP）水平較治療前下降了84%；另1 例PETN 失活及MET 激活突變的患者在接受西羅莫司（雷帕霉素抑制劑的機制靶點）和卡博替尼（MET 抑制劑）治療后，AFP 水平下降63%。靶向免疫治療的原發性耐藥也是當前肝癌治療的一大難點，ctDNA 可以識別原發性耐藥的預測因子。研究發現在使用酪氨酸激酶抑制劑后，PI3K/MTOR 通路未發生突變的HCC 患者的PFS 明顯比有這些突變的患者長[29]。HCC 患者產生耐藥性時，ctDNA 會檢測到不同的遺傳或表觀遺傳特征，可通過監測ctDNA 來設計及調整治療方案[12]。侖伐替尼（lenvatinib，LEN）治療4 周后可降低變異等位基因頻率（variant allele frequencies，VAFs）和獲得更長的PFS，ctDNA 譜分析是LEN 治療期間了解疾病進展的有效標志[30]。

3 ctDNA 在肝癌應用方面面臨的挑戰

目前，ctDNA 未能在臨床肝癌應用推廣的主要因素有以下幾點：其一，ctDNA 的成本高昂，讓本就經濟壓力較大的肝癌患者難以承擔。但隨著技術的進步，ctDNA 的檢測成本正在逐步下降，這將有助于這項技術的臨床推廣應用[14，31]。其二，ctDNA 目前最常用的方法是NGS、ddPCR 等，不同方法甚至不同基因公司所檢測ctDNA 的特異度及靈敏度都有所差異，目前監測ctDNA 尚未有統一的標準，我國已有基于NGS檢測ctDNA 的專家共識[11]。此外ctDNA 結果會受不同的提取樣本量、采血保存時間以及是否為原發性腫瘤等差異而受影響，因此我們仍需更加統一的檢測標準對ctDNA 的樣本收集和處理、檢測技術標準、結果報告解析和臨床實踐應用進行規范[32-33]。其三，ctDNA在肝癌血液中的含量較低，即使在腫瘤晚期含量也不高，要在肝癌早期檢測到ctDNA 需要更高靈敏度的ctDNA 檢測技術。近年來分離ctDNA 的技術進步使得DNA 甲基化作為HCC 生物標志物得到更好的發展應用，ctDNA 聯合AFP 等生物標志物共同進行肝癌的早期診斷、評估預后及術后復發可獲得更高的靈敏度及特異度[12，21，34]。

4 小結與展望

目前，肝癌的治療仍是以手術為主的綜合治療。隨著精準醫療時代的來臨，靶向和免疫治療逐漸嶄露頭角，并發揮著越來越重要的作用，讓原來不可能治愈的肝癌變得可控，通過術前新輔助治療可以縮小腫瘤病灶甚至減少腫瘤數量，從而達到手術可切除的標準，術后輔助治療可讓患者獲得長PFS。靶向免疫治療有著高度特異性，而肝癌又有著高度的腫瘤異質性，這就需要更精準且實時的基因檢測。ctDNA 高特異度、微創、易采集的特性讓其成為靶向免疫治療可靠的配套監測。與其他蛋白質生物標志物相比較，ctDNA 表現出更好的靈敏度和特異度，可作為肝癌早期診斷的生物標志物，評估預后及預測術后復發，同時通過實時監測ctDNA 可以同步指導臨床用藥及評估用藥療效。ctDNA 的高成本仍然限制了其在臨床的應用，檢測技術的進步讓其成本不斷下降，有望在未來成為一項在經濟上能夠為普通患者所接受的檢查。目前ctDNA 在非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌等領域研究較為成熟[35]，而在肝癌領域應用的研究較少且樣本量不夠大，仍需更多前瞻性研究來發掘ctDNA 這個寶庫，從而為肝癌的精準醫療奠定更堅實的理論基礎。