木霉菌配施有機肥對甜瓜果實糖及代謝酶活性的影響

李春霞，聶佳慧，陳錢廣，高佳怡，肖漫，王雨舒，熊亞男，靳亞忠

（黑龍江八一農墾大學園藝園林學院，大慶 163319）

甜瓜以含豐富的維生素B、維生素C、胡蘿卜素、檸檬酸等營養物質和口感甜脆在水果界享譽盛名，深受廣大消費者青睞[1]。在經濟利益的驅使下，設施甜瓜種植模式單一，農藥化肥的大量使用，造成土壤連作障礙與可續發展農業發展矛盾突出[2]，導致甜瓜產量和品質明顯下降。有研究表明，有機肥可以促進作物對營養的吸收，改善果實的品質，如蘋果、檸檬上均有報道[3-4]。因此，合理配施有機肥，減少化肥施用量，提高甜瓜產量和品質，緩解土壤連作障礙，已成為設施甜瓜生產中亟待解決的重要問題。

國內外研究表明，適當減少氮肥施入量能有效提高番茄、葡萄和辣椒等果蔬產量、可溶性糖和維生素C 含量[5-6]；在減少化肥施用的同時配施有機肥可提升園藝作物的品質，在冬棗[7]、藍莓[8]、葡萄[9]、芒果[10]等作物中均有報道；施用木霉菌會促進植株體內物質的代謝，提高甜瓜抗性和品質[11]。但目前對有機肥與木霉菌配施提高甜瓜果實品質的研究還鮮見報道。因此，研究通過減施化肥配施有機肥和木霉菌，以甜瓜生長發育過程中糖分積累及蔗糖代謝關鍵酶活性的動態指標變化為依據，明確減施化肥配施有機肥和木霉菌對甜瓜品質的影響，也為木霉菌在生產上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甜瓜品種：薄皮甜瓜“CH7”（花后28～30 d成熟），為黑龍江八一農墾大學園藝園林學院設施課題組提供的自交系。供試常規肥料：主要有商品有機肥、商品復合肥、磷酸二銨和硫酸鉀肥，均來自黑龍江田力保生物科技有限公司，其中各肥料氮磷鉀含量占比見表1。供試木霉菌：木霉菌菌劑為棘孢木霉菌，有效孢子量≥109CFU·g-1，由黑龍江八一農墾大學園藝園林學院和黑龍江田力保生物科技有限公司共同研制而成。供試土壤類型為黑鈣土，其基本理化性質為：氨態氮含量為40.88 mg·kg-1，速效磷含量為76 mg·kg-1，速效鉀含量為140 mg·kg-1，pH 值為7.8。

表1 不同供試肥料中氮磷鉀含量占比Table 1 Ration of nitrogen，phosphorus and potassium content in different tested fertilizers

1.2 試驗設計

試驗中共設有5 個處理，以不施肥和常規施用化學肥料為對照組，設置農民常規施肥、有機肥全部替代化肥和半量替代化肥，同時配施木霉菌劑為處理組。各處理肥料施用量見表2。木霉菌施用量為30 kg·hm-2，分別在甜瓜植株定植和甜瓜定果期施用，具體做法是把50 g 木霉菌溶解在25 L 水中，平均施在小區內每個甜瓜的根部。甜瓜在四葉一心期定植，每個小區種植6 行，每行8 株，3 次重復，小區面積約為30 m2。甜瓜按期進行澆水，整枝打叉，采用吊蔓栽培，子蔓結瓜，每株保留第8、9、10 節位的子蔓用于結瓜。在花后第21（成熟前期）、28（成熟期）和35 d（成熟后期）收集甜瓜果實，采取果實赤道部位的果肉，每個樣品2 g，將果實樣本用錫箔紙包裝后迅速放入液氮進行冷凍，置于-40 ℃冰箱中保存，用于果實含糖量及代謝相關酶指標的測定。

表2 各處理肥料施用量Table 2 Fertilizer application amount of different treatments

1.3 測定指標與方法

1.3.1 糖含量的測定

可溶性糖：蔥酮試劑法[12]測定。取0.5 g 甜瓜果肉放入試管中，加入10 mL 蒸餾水后封口，沸水浴30 min，提取液過濾后定容至50 mL。吸取l mL 提取液和l mL 蒸餾水于試管中，加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL 濃硫酸，充分振蕩后沸水浴l min 后取出，自然冷卻，以空白作參比，630 nm 測定吸光度。

果糖、葡萄糖、蔗糖含量的測定：參照楊樂[13]的方法。稱取2 g 甜瓜果肉于液氮條件下研磨，加入5 mL 80%乙醇溶液，80 ℃水浴30 min，冷卻后3 000 g條件下離心10 min，取上清液定容至50 mL，以備果糖、葡萄糖和蔗糖的測定，采用蒽酮-硫酸比色法測定。

1.3.2 酶活性的測定

取1 g 甜瓜果肉于研缽中，加入少量的石英砂和10 mL HEPES 緩沖液，冰浴研磨成勻漿，4 ℃12 000 g離心20 min，收集上清液。上清液逐漸加硫酸銨至80%溶解度，冰上放置15 min，4 ℃12 000 g 離心30 min，棄上清液，用提取緩沖液3 mL 溶解沉淀，轉移到透析袋中，置于4 ℃冰箱中，20 小時后取出即為酶提取液。果實糖代謝相關酶活性的測定方法〔酸性轉化酶（AI），中性轉化酶（NI），蔗糖合成酶分解方向酶（SS-d），蔗糖磷酸合成酶（SPS），蔗糖合成酶合成方向酶（SS-s）〕，參照李合生[14]的方法。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0（ANOVA）進行數據處理與統計分析，利用origin 9.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 甜瓜果實生長發育過程中糖分積累的動態變化

2.1.1 化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施對甜瓜果實可溶性糖含量的影響

由圖1 可以看出，隨著甜瓜果實生長發育，果實中可溶性糖含量呈現上升的趨勢，且在同一時期，各處理的甜瓜果實可溶性糖含量之間存在明顯差異。在甜瓜果實發育的各個時期，各處理的甜瓜果實可溶性糖含量顯著高于CK（P＜0.05），而化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施處理的甜瓜果實可溶性糖含量則顯著高于CK1 處理，且T3 處理甜瓜果實中可溶性糖含量始終高于T2 和T1 處理（P＜0.05）。

圖1 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實可溶性糖含量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on soluble sugar content of muskmelon fruits

2.1.2 化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施對甜瓜果實果糖、葡萄糖、蔗糖的影響

圖2 結果表明，隨著果實發育，果糖含量呈升高趨勢，且在甜瓜果實生長發育的各個階段，各處理甜瓜果實中的果糖含量變化不盡相同。在花后21 d 的薄皮甜瓜果實中，CK1 處理的甜瓜果實中果糖含量最高，顯著高于其它處理，而T1 和T2 處理之間無明顯差異，但果實的果糖含量顯著低于T3 處理（P＜0.05）。在花后28 d 時，T3 處理的甜瓜果實果糖含量最高，顯著高于其它處理，而T1 和T2 處理之間無明顯差異，但顯著低于CK1 和CK 處理（P＜0.05）。在花后35 d 時，T2 和T3 處理的甜瓜果實果糖的含量顯著高于CK1、CK 和T1 處理（P＜0.05），而T1 處理果糖含量最低，顯著低于CK 和CK1 處理，但T2和T3 處理之間無明顯差異（P＜0.05）。

圖2 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實果糖含量的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments on fructose content of muskmelon fruits

由圖3 可以看出，隨著薄皮甜瓜果實生長發育，果實中葡萄糖含量呈現逐漸升高的趨勢，在同一時期，各處理之間甜瓜果實葡萄糖含量存在明顯差異。在花后21 d 時，CK 甜瓜果實中葡萄糖含量最高，顯著高于其它處理，CK1、T1 和T2 處理間無差異，而T3 處理的葡萄糖含量最低，顯著低于其它處理（P＜0.05）；在花后28 d 時，T3 處理的甜瓜果實葡萄糖含量最高，顯著高于其它處理，與CK 相比，CK1、T1和T2 處理甜瓜果實葡萄糖含量顯著下降（P＜0.05）；在花后35 d 時，與CK 和CK1 處理相比，化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施處理（T1、T2 和T3）的甜瓜果實中葡萄糖含量顯著升高，CK1 和CK 處理之間無顯著性差異（P＜0.05），且T3 處理果實中葡萄糖含量最高，達6.61 mg·g-1。

圖3 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實葡萄糖含量的影響Fig.3 Effects of different fertilization treatments on glucose content of muskmelon fruits

圖4表明，隨著甜瓜果實生長的發育，果實中蔗糖含量呈逐漸升高的趨勢；在花后21 d 的薄皮甜瓜果實中，T1 處理的甜瓜果實蔗糖含量最高，顯著高于其它處理，T3 處理的甜瓜果實中蔗糖含量最低，顯著低于其它處理，CK1、T1 和T2 處理的蔗糖含量顯著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 時，與CK 和CK1 相比，T1、T2 和T3 處理的蔗糖含量顯著升高，且T3 處理蔗糖的含量最高，高達2.98 mg·g-1，而CK1 中果實蔗糖含量則顯著低于CK 處理（P＜0.05）；在花后35 d時，與CK 相比較，各施肥處理果實蔗糖含量顯著升高，且T1、T2 和T3 處理果實的蔗糖含量顯著高于CK1處理，且T3 處理果實蔗糖含量最高，達4.04 mg·g-1。

圖4 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實蔗糖含量的影響Fig.4 Effects of different fertilization treatments on sucrose content of muskmelon fruits

2.2 甜瓜果實生長發育過程中糖代謝相關酶活性的動態變化

2.2.1 化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施對果實蔗糖合成酶活性的影響

由圖5 可以看出，隨著甜瓜果實生長發育，果實中蔗糖合成酶-合成方向的酶活性（SS-s）存在顯著差異，呈現逐漸增長趨勢。在花后21 d，與CK 相比，各處理的甜瓜果實SS-s 酶活性顯著提高，且T1、T2和T3 處理SS-s 酶活性明顯高于CK1 處理，T2 處理酶活性最高（P＜0.05）；在花后28 d 時，與CK 和CK1處理相比較，T1、T2 和T3 處理SS-s 酶活性顯著升高，T2 和T3 處理顯著高于T1，但二者之間無差異，CK 與CK1 處理間則無差異（P＜0.05）。在花后35 d，各處理間SS-s 酶活性無顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實蔗糖合成酶（合成方向）活性的影響Fig.5 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（synthesis direction）in muskmelon fruits

從圖6 可以看出，隨著甜瓜果實生長發育，果實中蔗糖合成酶-分解方向酶活性（SS-d）呈現逐漸下降的趨勢。在花后21 d 時，T1 處SS-d 酶活性顯著高于其它處理，而CK1、T2 和T3 處理之間無明顯差異，但顯著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 時，CK 處理SS-d 酶活性顯著高于其它處理，CK1、T2 和T3 處理之間無明顯差異，且低于T1 處理（P＜0.05）；在花后35 d，各處理間SS-d 酶活性無顯著性差異（P＜0.05）。

圖6 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實蔗糖合成酶（分解方向）活性的影響Fig.6 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（decomposition direction）of muskmelon fruits

2.2.2 化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施對果實蔗糖磷酸合成酶活性的影響

從圖7 中可以看出，在甜瓜果實生長發育的不同時期，各處理的甜瓜果實中蔗糖磷酸合成酶活性（SPS）存在明顯差異。在花后21 d 時，與CK1 和CK處理相比，各處理的甜瓜果實SPS 酶活性顯著升高，而T1 與T3 處理間無明顯差異，但都高于T2 處理，CK處理SPS 酶活性最低（P＜0.05）；在花后28 d 時，與CK 相比，T1 和T2 處理SPS 酶活性顯著升高，CK1處理的酶活性顯著下降，T3 則無顯著差異（P＜0.05）；在花后35 d 時，與CK 和CK1 處理相比較，T1、T2 及T3 處理SPS 酶活性顯著升高，而T1 和T3 處理之間無明顯差異（P＜0.05）。

圖7 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實蔗糖磷酸合成酶活性的影響Fig.7 Effects of different fertilization treatments on sucrose phosphate synthase activity of muskmelon fruits

2.2.3 化肥減施與有機肥及木霉菌劑配施對果實酸性和中性轉化酶活性的影響

由圖8 可以看出，隨著甜瓜果實生長發育，甜瓜果實中酸性轉化酶活性（AI）呈現逐漸下降趨勢，且在同一時期，各處理之間AI 活性差異明顯。在花后21 d 時，T3 和CK1 處理的果實的AI 活性顯著高于CK 和T1、T2 處理，且T3 處理酶活性最大，而CK 和T1 處理之間無明顯差異，但明顯高于T2 處理（P＜0.05）；在花后28 d 時，T1 處理AI 活性顯著高于其它處理，CK1、T2 與T3 處理之間無明顯差異，且顯著低于CK 處理（P＜0.05）；在花后35 d 時，CK1 處理AI活性顯著高于其它處理，CK、T1 與T3 處理之間無明顯差異，且低于T2 處理（P＜0.05）。

圖8 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實酸性轉化酶的影響Fig.8 Effects of different fertilization treatments on acid invertase of muskmelon fruits

圖9表明，隨著薄皮甜瓜果實生長發育，甜瓜果實中中性轉化酶活性（NI）呈現逐漸下降的趨勢，且在同一時期，各處理NI 活性存在明顯的差異。在花后21 d 時，與CK 相比，CK1、T1，T3 處理NI 活性顯著升高，T2 無顯著差異；T3 處理顯著高于CK1 和T1，CK1 與T1 處理之間無明顯差異（P＜0.05）。在花后28 d 時，T2 處理NI 活性顯著高于其它處理，且T1 與T3 處理之間無明顯差異，但顯著高于CK 和CK1 處理（P＜0.05）。在花后35 d 時，與CK、CK1 相比，T2 和T3 處理NI 活性顯著升高，而T1 處理無明顯差異（P＜0.05）。

圖9 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中性轉化酶的影響Fig.9 Effects of different fertilization treatments on neutral invertase in muskmelon fruits

3 結論與討論

甜瓜因其口感清脆，香甜可口而被廣大消費者所青睞。香甜是衡量甜瓜品質的重要指標，果實中糖分的含量及其組成種類是影響果實品質的重要因素之一[15]。研究發現，隨著甜瓜果實生育期的增長，甜瓜果實中可溶性糖、葡萄糖、果糖和蔗糖含量逐漸增加，尤其在花后35 d 達到最高，而且各處理的可溶性糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的糖含量在花后28 d 和35 d積累較多，這可能與研究中所用的甜瓜品種有關，“CH7”品種在花后28～30 d 內成熟。研究發現，配施木霉菌后，農民常規施用化肥+木霉菌（T1）較農民常規施用化肥處理（CK1）顯著增加了甜瓜各個時期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖含量，可能是由于木霉菌通過調控根系分泌物和土壤微生物的多樣性來提高植株的可溶性含糖量，這與前人的研究結果一致[16]。有機肥配施木霉菌（T2）和減施化肥配施木霉菌和有機肥處理（T3）各個時期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖的含量顯著高于CK1 和T1 處理，說明木霉菌和有機肥是改善甜瓜品質的有效途經之一，這與前人在其它作物上研究結果一致[17-18]，尤其減施化肥配施有機肥和木霉菌效果更顯著，說明減施化肥條件下配施木霉菌和有機肥是提高甜瓜品質，促進甜瓜可持續發展的有效手段之一。

國內外研究表明，植物果實中糖分的變化與蔗糖代謝的關鍵酶活性有關[19-20]，主要包括蔗糖合成酶（合成與分解兩方向）、蔗糖磷酸合成酶和轉化酶（酸性轉化酶和中性轉化酶）[17]。研究發現各處理甜瓜果實的蔗糖、葡萄糖和可溶性總糖含量隨著生育期的生長而增長，SS-s 和SPS 酶活性相應隨之升高，而AI 和NI 隨著蔗糖含量的增加而降低，這與刁倩楠[21]對甜瓜的研究結果一致。大量的試驗結果表明，配施有機肥是改善土壤環境，提高作物品質和產量的有效手段[22-23]。在研究中，配施木霉菌和有機肥的T1、T2和T3 處理都顯著增加了果實可溶性糖和蔗糖的含量，同時提高了果實成熟前期的SS-s 和SPS 活性，降低了果實成熟后期的SS-d、AI 和NI 酶活性，這與前人在甜菜和梨中的研究結果相類似[24-25]。但是甜瓜果實中果糖含量較低且AI 和NI 活性逐漸下降，這與枸杞研究結果正好相反[26]，可能的原因是甜瓜果實以蔗糖為主，而枸杞則以果糖和葡萄糖為主，主要是因為它們的發揮合成和積累的酶之間的協調關系可能存在差異。大量的研究提出配施有機肥和木霉菌可以通過土壤微生物多樣性的調控、根際有益微生物的定殖以及激素信號的傳導等方式調控植物-微生物互作以及植株體內糖的積累與運輸以改變源-庫關系，進而影響植物體內的糖代謝[27-28]，從而導致各類糖組成和含量的差異，達到調控果實品質的目的。木霉菌和有機肥配施調控甜瓜糖代謝的微生物學和分子生物學機理還不清楚，需要進一步分析研究。

綜上所述，與CK（不施肥處理）和CK1（農民常規施肥）相比較，配合施用木霉菌或者木霉菌-化肥-有機肥配施（T1、T2、T3）處理通過促進果實中SS-S酶、SPS 酶和成熟前期NI 酶的活性，抑制成熟和成熟后期甜瓜果實的SS-d 酶和AI 酶的活性，從而不同程度地提高了薄皮甜瓜果實中可溶性糖含量以及成熟果實中果糖、葡萄糖、蔗糖含量，尤其是T3 處理效果明顯。因此，減施化肥配施木霉菌和有機肥，通過調節糖代謝酶之間的協調性，進而促進成熟果實糖分合成和積累，從而達到提升甜瓜品質和減肥的目的。