畜禽糞便有機肥對黑土農田土壤抗生素抗性基因的影響

姚欽，朱玥晗，宋潔，郭永霞，2，王光華

（1.黑龍江八一農墾大學農學院，大慶 163319；2.農業農村部東北平原農業綠色低碳重點實驗室；3.中國科學院東北地理與農業生態研究所）

東北黑土是我國重要的土壤資源，在維持國家糧食安全和生態安全上具有重要的地位。近年來由于生產過程中過度的開發和粗放的管理，導致土壤肥力下降，黑土退化日益嚴重[1-2]。目前，普遍公認有機肥添加能夠有效提高黑土土壤肥力，改善黑土土壤理化性質[3-6]。然而，施用有機肥也會帶來一些負面效應，其中之一就是在畜禽養殖過程中抗生素的定期使用，直接導致畜禽糞便中蘊藏了大量的抗性細菌和抗性基因[7-8]，從而最大程度驅動了農業土壤中抗性基因的積累[9]。由于抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）具有較高的移動性，它們能通過食物鏈的傳遞到達人類餐桌，進入人類體內，威脅人類身體健康，已被世界衛生組織列為21 世紀威脅公共健康的最重大挑戰之一[10-11]。因此，國內外學者針對生態環境中抗生素抗性基因的積累和傳播已經開展了廣泛研究。

目前，在國際抗生素抗性基因數據庫（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB） 中已經包含了13 293 個基因、933 個物種和124 個屬的耐藥信息，其中常見的抗生素抗性基因主要有四環素類（tetracycline）、β-內酰胺類（beta Lactam）、喹諾酮類（FCA）、大環內酯類（MLSB）、磺胺類（sulfonamide）和整合子類（Integrin-integrase）6 大類[12]。研究發現四環素類是畜禽養殖過程中治療疾病和促進生長普遍常用的抗生素，磺胺類和β-內酰胺類等其他抗生素在家禽、生豬和生牛養殖中也會大量使用，造成了畜禽糞便中不同種類的抗性基因污染[13]。另外，由于不同種類畜禽（如豬、雞、牛）的生理生活特性和養殖習慣不同，導致使用的抗生素種類、頻次及用量不同，使不同畜禽糞便中抗生素抗性基因多樣性和豐度存在著顯著差異[14]。有研究發現，雞糞和豬糞中的抗生素種類和豐度遠高于牛糞，主要是因為我國生產生活對雞肉和豬肉的需求量較高，使得家禽和生豬的養殖密度大且銷售期短，抗生素使用量較高，同時消化功能弱于生牛，導致家禽和生豬糞便中抗生素的殘留量較高，造成ARGs 污染程度較高[13，15]。所以，農業生產中有必要探討分析不同種類畜禽糞便有機肥施用后農田土壤中抗生素抗性基因種類及豐度差異，可以為評價畜禽糞便的生態風險提供參考。

因此，作為農業大省和畜牧業大省的黑龍江省，在關注黑土農田生態系統中施用禽畜糞便有機肥提高土壤肥力和改善黑土退化問題的同時，由其帶來的抗生素抗性基因潛在危險以及對農產品和人類健康的威脅也不容忽視。為明確有機肥施用對黑土農田ARGs 的影響，研究通過熒光定量分析不同畜禽糞便有機肥對黑土農田土壤中AGRs 數量、種類和豐度的影響程度，以期為黑土農田退化管理和土壤肥力提升，以及減緩AGRs 在農黑土農田生態系統中積累策略提供理論依據，為黑土農田生產中有機肥的施用提供指導建議。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣品采集自黑龍江省哈爾濱市雙城區，該區域屬于中溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫4.4 ℃，年均降水量481 mm，土壤類型為典型黑土。

玉米收獲期選擇長期施用（5 年以上）有機肥的農田土壤，分別采集不同類型有機肥（牛糞N、豬糞Z和雞糞J）施用土壤樣品，同時采集施用無機肥農田土壤作為對照（CF）。土樣采集深度為0～20 cm，隨機多點采集玉米根圍土后混勻作為一個重復樣品，每個樣地采集3 次重復，共12 個土壤樣品。所有樣品現場采集后過2 mm 土壤篩，用冰盒帶回實驗室用于DNA 提取。

1.2 樣品DNA 提取

準確稱取0.5 g 土壤樣品，采用Fast DNARSpin Kit for Soil（MP Biomedicals，美國）試劑盒，按照操作說明提取農田土壤總DNA。提取完成后總DNA 用1%瓊脂糖電泳檢測提取結果，并使用NanoDrop 2000核酸分析儀（Thermo Scientific，美國）測定濃度及純度。最后，DNA 保存于-20 ℃備用。

1.3 抗生素抗性基因定性檢測

研究選擇了6 類34 種抗生素抗性基因（ARGs），包括15 種四環素類（tetracycline）抗性基因tetA、tetB1、tetB2、tetC、tetG1、tetG2、tetL1、tetL2、tetM、tetO、tetQ、tetT、tetW、tetX1、tetX2，3 種磺胺類（sulfonamide）抗性基因sul1、sul2、sul3，4 種整合子類（Integrin-integrase）抗性基因intl1、intl2、intl3、intl4，4 種大環內脂類（MLSB） 抗性基因ermB、ermC、ermE、ermF，5 種β-內酰胺類（beta Lactam）抗性基因blaOXA-F、blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaNDM，3 種喹諾酮類（FCA）抗性基因qnrA、qnrB、qnrS。利用各抗性基因常用引物進行普通PCR 擴增[16]，定性檢測不同糞便有機肥施用土壤中不同抗生素抗性基因分布情況。

1.4 抗生素抗性基因定量檢測

在普通PCR 定性檢測結果基礎上，以細菌16S rRNA 基因作為參照標記基因，在LightCycler 480 平臺（Roche Applied Science，瑞士）進行ARGs 熒光定量檢測。20 μL 反應體系包含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，7 μL ddH2O，1 μL 土壤總DNA，上下游引物各1 μL。每個樣本3 次重復，反應基本程序為：初變性95 ℃30 秒；變性95 ℃5 秒，退火延伸60 ℃30 秒，共40 個循環；最后冷卻50 ℃30 秒。根據所得數據對ARGs 進行定量統計分析。

相對定量的統計方法如下[12]：

公式中，ARGs 是所要測定的34 種抗生素抗性基因，16S 是指待測樣品的16S rRNA 基因，CT 是熒光定量所測定的循環閾值，△CT是某樣品的目標基因CT值與16S rRNA 基因CT值的差值，△△CT是指待測（test）樣品的目標基因△CT值與對照（control）樣品的△CT值的差值，FC 值是指待測樣品的目的基因相對于對照樣品的富集倍數，獲得的數據用于后續不同處理間抗性基因分布特征分析。

1.5 數據分析

結合抗性基因定性檢測和定量檢測結果，統計不同畜禽糞便有機肥施用的土壤中不同類型抗生素抗性基因檢出個數、不同抗性機制的檢出比例以及不同種類抗性基因的檢出情況，并采用Excel 2016和SPSS 25.0 進行數據前期處理和統計學分析；采用R 語言v 3.3.1 vegan 數據包和heatmap 數據包分別進行不同有機肥處理下不同種類抗生素抗性基因分布的PCA 分析和熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 施用不同有機肥對抗性基因抗性機制和種類的影響

以不同有機肥施用土壤中提取的DNA 作為模板，分別擴增四環素類（tetracycline）、β-內酰胺類（beta Lactam）、喹諾酮類（FCA）、大環內酯類（MLSB）、磺胺類（sulfonamide）、整合子類（Integrinintegrase）6 大類34 種抗性基因，施用雞糞、豬糞、牛糞不同糞便有機肥和無機肥的土壤中分別檢測到9、10、5 和9 種抗生素抗性基因。

所有土壤樣品中檢測到了4 種抗性機制的抗性基因，包括轉座子移動原件（transposon）、細胞核糖體保護（protection）、抗生素失活（deactivate）和抗生素外排泵（efflux），各自檢出個數占總檢出個數的比例分別為13.33%、73.33%、6.67%和6.67%（圖1 A）。由此表明，細胞核糖體保護為4 種不同施肥措施土壤中ARGs 的主要抗性機制，其次轉座子移動原件，最后是抗生素失活和抗生素外排泵。將不同種類有機肥施用的土壤中抗生素抗性基因檢出結果按抗性基因種類分析看出（圖1 B），四環素類（tetracycline）、磺胺類（sulfonamide）、大環內酯類（MLSB）、β-內酰胺類（beat Lactam）分別占總檢出個數的50%、11.54%、15.38%和11.54%，其中檢出種類最多的為四環素類，其次為大環內酯類。喹諾酮類（FCA）和整合子類（Integrin-integrase）檢出比例較小，合并記為other efflux，檢出比例合計11.54%。

圖1 不同抗性機制抗性基因檢出比例（A）和不同種類抗性基因檢出比例（B）Fig.1 Proportion of resistance genes with different resistance mechanisms（A）and different types of resistance genes（B）

各類抗性基因所占百分比如圖2 所示，在檢測的6 大類抗性基因中，施加不同類型糞便有機肥土壤中均檢測到四環素類、磺胺類以及遺傳元件類的抗生素抗性基因。其中，各個處理中四環素類（tetracycline）抗生素抗性基因檢出比例均為最高，高達55.6%以上。施加豬糞Z、牛糞N 與無機肥CF 土壤抗性基因的分布類型基本沒有區別，而施加雞糞的土壤中（J）檢測到了兩大類新的抗生素抗性基因，即大環內酯類（MLSB）和β-內酰胺類（beta Lactam），并且比例和磺胺類（sulfonamide）抗性基因基本一致，約11.1%。

圖2 不同類型肥料施用土壤中各類抗性基因檢出比例Fig.2 The proportion of various resistance genes detected in soils applied with different fertilizers

2.2 不同施肥措施下抗生素抗性基因的分布特征

如圖3 所示，施用不同畜禽糞便有機肥和無機肥土壤的抗生素抗性基因豐度和多樣性均發生了明顯變化。施加牛糞（N）的土壤中抗性基因類型較少，豐度較低，與施用無機肥土壤樣品類似，而施用雞糞（J）和豬糞（Z）土壤中的抗生素抗性基因的種類和豐度顯著增加。其中，施用豬糞有機肥顯著增加了土壤中β-內酰胺類抗生素抗性基因blaTEM和四環素類抗生素抗性基因tetG2豐度，四環素類抗生素tetG1和tetM豐度增加幅度較小，但也均有別于施用無機肥土壤。施用雞糞有機肥對土壤中抗生素抗性基因類型和豐度影響最大，尤其是四環素類抗生素抗性基因tetX1的豐度顯著高于所有土壤樣品中檢測到的其他抗性基因；其次是整合子類Integrin-integrase抗性基因intl1。并且，由熱圖分析發現施用雞糞有機肥土壤中除tetX2外，檢測到的其他四環素類抗性基因豐度均較高，如tetC、tetL1、tetG2、tetG1和tetM，說明施用雞糞有機肥的土壤中四環素類抗生素抗性基因污染嚴重。而施用雞糞有機肥土壤中β-內酰胺類抗生素抗性基因blaTEM豐度較低，與施用豬糞有機肥結果相反?？傊?，由抗性基因類型和豐度熱圖的UPGMA cluster 顯示四種不同施肥制度分別形成四個簇，施用牛糞有機肥土壤和無機肥距離較近，施用雞糞和豬糞的土壤中形成了新的抗生素抗性基因分布格局，明顯區別于施用牛糞有機肥和無機肥土壤，說明施用不同糞肥有機肥明顯影響了土壤中抗生素抗性基因分布特征。

圖3 不同類型肥料施用土壤中ARGs 分布熱圖Fig 3 Heatmap of ARGs distribution in soils applied with different fertilizers

2.3 不同施肥措施下抗生素抗性基因的主成分分析

不同畜禽糞便有機肥施用土壤中抗生素抗性基因主成分分析如圖4 所示，施用豬糞、雞糞、牛糞有機肥和無機肥四個處理的土壤樣品分別位于四個不同的象限，說明施加不同糞便有機肥顯著改變了土壤中抗生素抗性基因的結構。主成分PC1 和PC2 分別解釋了抗性基因結構變化56.6%和16.9%，施用不同糞便有機肥和無機肥的土壤樣品各自的3 個重復聚集在一起，四個處理沿橫軸PC1 分為四個簇，牛糞有機肥處理與無機肥處理距離較近，而施用雞糞有機肥的樣點獨成一簇，與其他三個處理明顯區分，同樣說明抗生素抗性基因在施用豬糞、牛糞、雞糞和無機肥土壤中存在不同的結構特征。另外，施加畜禽糞便有機肥的土壤相對于施用無機肥土壤具有更復雜的抗生素抗性基因多樣性，施用牛糞有機肥樣點與四環素類抗生素抗性基因tetX2結合緊密，與其他抗性基因距離較遠；同樣，豬糞有機肥樣點與β-內酰胺類抗生素抗性基因blaTEM密切相關；而施用雞糞有機肥的土壤樣點與大部分豐度較高的被測抗性基因緊密結合，尤其與四環素類抗生素抗性基因tetX1密切相關，與上述熱圖結果基本一致，說明農業生產施加禽畜糞便有機肥顯著改變了環境土壤中的抗性基因種類組成。

圖4 不同類型肥料施用土壤中ARGs 主成分分析Fig.4 Principal component analysis of ARGs in soils applied with different fertilizers

3 討論

農田生態系統中，添加有機肥能夠有效提高土壤有機質含量和土壤微生物多樣性，對維持農田土壤質量有著至關重要的作用[17-18]。然而，畜禽生產中抗生素的使用，增加了對農田土壤環境中微生物的選擇壓力，導致攜帶抗生素抗性基因的細菌大量出現[19-20]。因此，作為一種土壤改良措施，畜禽糞便有機肥在施用的同時也會成為ARGs 進入到農田生態系統中的主要媒介之一[7，21]。研究結果表明，施用有機肥的黑土農田土壤中ARGs 的多樣性和豐度顯著增加，與他人研究結果較為一致。Zheng 等[9]基于宏基因組學報道的全球首張土壤抗生素抗性基因空間與豐度分布圖研究結果顯示全球農業土壤的ARGs 豐度顯著高于非農業土壤，并且畜禽養殖是最主要的驅動因素。這可能是由于有機肥的添加，一方面引入大量ARGs 的同時，也增加了土壤有機碳的含量，促進了土壤中耐藥菌和有機肥攜帶耐藥菌的生長繁殖[22]，也有可能是有機肥中的抗性細菌遷移定殖到土壤中，抗性基因通過水平轉運作用機制轉移到土壤微生物中[23]，導致有機肥施用后土壤中AGRs 多樣性和豐度的提高。

有機肥施用土壤中抗生素抗性基因的豐度和多樣性也會因畜禽種類的不同而存在差異[14]。研究中不同畜禽糞便有機肥施用形成了不同的抗生素抗性基因分布格局，由AGRs 分布熱圖看出，施用雞糞的土壤中AGRs 豐度和種類高于施用豬糞的土壤樣品，而施用牛糞有機肥的土壤樣品中抗性基因積累最少。這可能與不同畜禽動物的生活習性和養殖習慣有關，一方面，相對于生牛養殖，雞和豬的養殖密度大，出欄期短，養殖過程中需要頻繁使用抗生素（如多肽類的桿菌肽鋅、恩拉霉素；多粘菌素類的硫酸粘桿菌素）來防治疾病和促進生長，導致雞糞和豬糞中抗生素殘留量大，施入土壤中后AGRs 種類多且豐度相對較高[15，24]。另一方面，生豬和家禽養殖多采用圈養方式，動物流動性較差，封閉式環境不利于堆積糞便中抗生素的降解，且它們的消化功能差，導致生豬和家禽糞便有機肥中抗生素抗性基因積累較多[14]。此外，除了不同糞便有機肥土壤樣品間抗性基因特征存在差異之外，研究還發現施用無機肥的土壤中也檢測到一定數量的抗生素抗性基因，并且AGRs 多樣性分布特征類似于施用牛糞有機肥土壤樣品，這一結果與他人研究報道基本相符。Su 等[25]在未施糞肥和堆肥的水稻土樣品中檢測到了豐度較低的抗性基因，說明土壤本身是一個豐富的抗性基因儲藏庫，在未受畜禽糞便污染的土壤環境中也能檢測到具有內在抗性的抗生素抗性基因。

畜禽養殖業中四環素類、β-內酰胺類、喹諾酮類、大環內酯類、磺胺類和整合子類是主要的抗生素類型。研究發現所有土壤樣品中均檢測到高達55%的四環素類抗生素抗性基因，并且檢出的抗性基因種類也較多，由熱圖也看出豐度較高且變化明顯的大部分抗性基因屬于四環素類，這與他人研究結果一致[26]，主要原因可能是因為四環素類抗生素是畜禽養殖業中使用量最大的一類抗生素，并且它們容易被吸附在土壤顆粒上造成在土壤中殘留積累。對于AGRs 的傳播來說，雖然在自然條件下本來就存在少量的AGRs，但是人類活動仍然被認識是AGRs 的主要傳播方式[27]。ARGs 的水平傳播方式下，主要是借助整合子、轉座子、基金盒、質粒和噬菌體等可移動遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）的水平轉移機制，通過接合、轉化、轉導等過程來實現ARGs 在不同微生物之間的水平傳遞[28-29]。研究結果顯示，長期施用雞糞的農田土壤（J）中轉座子類（intl1）數量顯著高于檢測到的其他抗生素抗性基因（P＜0.05），說明長期施加雞糞可以增加土壤中轉座子水平遺傳元件的富集倍數，容易造成周邊土壤進行抗生素抗性基因水平傳播。這種基因的水平傳播，可能對施用有機肥后土壤中的抗生素濃度以及對土壤中耐藥菌的生長速度和衰亡速度都存在影響[30-31]。同時，土壤中抗生素抗性基因的水平轉移對于ARGs 在微生物間的傳遞起著重要作用，也是導致農田土壤中ARGs 豐度改變的關鍵因素[32]。

東北黑土區是我國重要的糧食生產基地，有機肥施用是黑土區土壤肥力提升，緩解黑土退化常用的有效措施。但有機肥中禽畜糞便是農田土壤中抗生素抗性基因的重要來源，由于其對抗生素和耐藥菌的引入，給人類和動物帶來的健康安全問題不容忽視。研究初步明確了有機肥施用對黑土農田土壤抗生素抗性基因的影響，雞糞、牛糞和豬糞均能明顯增加土壤中抗生素抗性基因，尤其施用雞糞有機肥帶來的污染威脅最嚴重。今后在黑土農田有機肥施用過程中，要充分考慮農田土壤中施用不同種類有機肥導致ARGs 積累的影響因素，可以通過堆肥、日曬或高溫處理等方法降低有機肥中抗生素和抗性基因的數量和豐度。未來針對黑土農田由于有機肥施用導致的抗生素及ARGs 的影響機制，以及根據目前東北黑土農田抗生素抗性基因的污染現狀及調控措施和ARGs 消減技術的應用開發也有待進一步研究。

4 結論

（1）研究施用不同糞肥的所有土壤中主要的抗性基因為四環素類、大環內酯類、β-內酰胺類和磺胺類，其中四環素類檢出率最高（55%以上）。

（2）農業生產施用畜禽糞便有機肥明顯增加了土壤中抗性基因的種類和豐度，并且顯著改變了土壤中抗生素抗性基因的結構，施用雞糞有機肥污染風險更大。