超聲波法提取野生蒲公英植株及花中黃酮類化合物的研究

曹麗麗，曲妍，紀德清

（黑龍江八一農墾大學理學院，大慶 163319）

蒲公英是一種非常常見的多年生草本植物，具有抑菌和抗氧化等作用[1-3]，蒲公英植株[4]和蒲公英花中[5]的黃酮類化合物含量都比較高。早在1985 年，WolbisMaria 等[6]就曾對蒲公英花進行過色譜分析，并從中檢出20 種黃酮類化合物。黃酮類化合物具有較強的防止氧化、衰老、預防心腦血管疾病、抗腫瘤、消炎、鎮痛、利膽、保肝等功效[7]，常用于冠心病、心絞痛治療的舒血寧片中就含有黃酮類化合物。研究發現黃酮類化合物對人體健康十分重要，由于人體不能直接合成黃酮類化合物，只能通過食用富含黃酮類化合物的食物來滿足人體對黃酮的需求，野生的蒲公英就是廉價、易得獲取黃酮類化合物的來源之一。蒲公英野生資源極為豐富，對食品、保健品和藥品行業來說具有很高的開發價值[8]。

目前，蒲公英中所含的黃酮類化合物的提取方法主要有回流法、超聲波法、微波法和超臨界流體萃取法等[9]。金京玲等[10]采用傳統熱回流法提取蒲公英中的黃酮類化合物，結果表明堿地蒲公英中黃酮類化合物含量為4.16%。賈娟等[11]采用超聲波和微波法提取蒲公英中的黃酮類化合物，結果表明超聲法得率為1.9121%，微波法得率為2.406 6%，微波法提取效果更好。范萌等[12]利用乙醇浸提法提取蒲公英中的黃酮類化合物，黃酮類化合物提取率為4.86%。朱慶莉等[13]通過超臨界CO2流體萃取工藝對蒲公英中的黃酮類化合物進行提取，初步探討了黃酮類化合物對淀粉液化芽孢桿菌、大腸桿菌和黑曲霉均具有一定程度的抑制效果；史易暖[14]研究發現蒲公英中黃酮類化合物對乳腺癌細胞具有一定的影響。但目前對于蒲公英不同部位（蒲公英植株和蒲公英花）有效成分的含量分析及比較，以及各部位的性質、特點、應用等研究還不多見。

試驗以大慶地區野生蒲公英植株和蒲公英花作為原料，利用超聲波法以乙醇為提取溶劑對其中的黃酮類化合物進行提取，經可見光譜和紅外光譜測試對黃酮類化合物粗提液成分進行了定性分析[15]，以期為蒲公英植株及蒲公英花的成分的進一步研究及其深加工提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蒲公英植株和蒲公英花，黑龍江八一農墾大學校園；無水乙醇，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；硝酸鋁，分析純，天津市福晨化學試劑廠；亞硝酸鈉，分析純，沈陽新興試劑廠；蘆丁標準品，江西佰草源生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

T6-1650E 紫外-可見分光光度儀：北京普析通用儀器有限責任公司；Nicolet iS5 紅外光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；ALC-310.3 電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；KH-500DE 數控超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-1 數顯恒溫水浴鍋：江蘇維納太科儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

采集帶花的蒲公英，將植株和花分離后分別洗凈曬干，粉碎，密封冷藏，備用。

1.3.2 最大吸收波長的測定

黃酮類化合物和蘆丁結構中都含有2-苯基色原酮，具有相同的吸光特性，因此，試驗選用蘆丁作為標準品溶液[16]進行最大吸收波長的測定和標準曲線的建立。參考相峰[17]的方法并稍作修改，具體步驟如下：準確稱取12.5 mg 蘆丁標準品，用60%的乙醇溶劑溶解后定容至50 mL，此時溶液濃度為0.25 mg·mL-1。吸取上述容量瓶中溶液2.00 mL 于25 mL 容量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法進行下一步溶液的配制；首先向容量瓶中加入0.50 mL 的亞硝酸鈉（10%）溶液，搖勻并充分反應5 min；再向其中加入2.00 mL 硝酸鋁溶液（5%）；搖勻并充分反應5 min 后用60%的乙醇定容。在400～700 nm 范圍內進行吸光度的測定，吸光度最大處所對應的波長為蘆丁標準溶液的最大吸收波長。

1.3.3 標準曲線的建立

分別準確吸取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL 1.3.2 中的蘆丁標準溶液于7 個25 mL 容量瓶中，采用與上述1.3.2 中相同的比色法進行溶液的配制。以1.3.2 測得的最大吸收波長為入射光波長，分別測定上述7 個不同濃度溶液的吸光度。最后根據計算出的7 個溶液的濃度和測得的吸光度繪制標準曲線。

1.3.4 單因素試驗

（1）用分析天平準確稱取1 g 蒲公英植株和蒲公英花干粉，用60%乙醇溶液浸提，分別改變料液的配比〔1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）〕，于50 ℃下超聲30 min，超聲功率300 W。

（2）用分析天平準確稱取1 g 蒲公英植株和蒲公英花干粉，用60%乙醇溶液浸提，分別改變超聲時間（20、30、40、50、60 min），于50 ℃下及料液比1∶40 的條件下進行提取，超聲功率300 W。

（3）用分析天平準確稱取1 g 蒲公英植株和蒲公英花干粉，用60%乙醇溶液浸提，分別改變超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃），于料液比1∶40 的條件下超聲40 min，超聲功率300 W。

按照上述條件對蒲公英植株和花中的黃酮類化合物進行提取。將過濾后的粗提液用吸量管準確移取2.00 mL 于25 mL 容量瓶中，按照1.3.2 配制標準溶液的試驗步驟進行粗提液的配制，考察各單因素不同水平對蒲公英植株和花中黃酮類化合物的影響。在測得的最大吸收波長處測定上述粗提液的吸光度，根據1.3.3 中所得的標準曲線方程由吸光度計算出蒲公英植株和花的粗提液中黃酮類化合物的得率，從而確定較優的提取條件。黃酮類化合物得率的計算方法為[15]：

式中：C：根據標準曲線方程計算得到的粗提液中黃酮類化合物的濃度（μg·mL-1）；V：粗提液的體積（mL）；N：粗提液的稀釋倍數；M：蒲公英植株或蒲公英花的質量（g）。

1.3.5 正交試驗設計

通過單因素試驗確定每個因素的水平范圍，即選取得率最大處及其前后兩個點作為每個因素的水平值，再結合料液比、超聲時間、溫度三個因素，設計正交試驗，以探尋蒲公英植株和花中黃酮類化合物提取條件的最優組合。表1 和表2 為所設計的正交試驗因素水平表。

表1 蒲公英植株正交試驗因素水平表Table 1 Factor level table of dandelion plant orthogonal test

表2 蒲公英花正交試驗因素水平表Table 2 Factor level table of dandelion flower orthogonal test

1.3.6 黃酮類化合物的定性表征

可見光譜法：取1.3.4 中配制好的蒲公英植株和蒲公英花的粗提液，在400～700 nm 波長范圍內進行光譜掃描，并與1.3.2 中蘆丁標準品溶液的可見吸收光譜進行對比，初步確定粗提液的成分。

紅外光譜法：在波數為4 000～500 cm-1的范圍內，對蘆丁標準品、蒲公英植株、蒲公英花粗提液進行測試，并根據各基團吸收峰范圍，將蒲公英植株、蒲公英花紅外光譜與蘆丁標準品的紅外光譜進行對比，進一步確定粗提液的成分。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

蘆丁標準品溶液在400～700 nm 波長范圍內的最大吸收波長見圖1。

圖1 蘆丁標準溶液的可見吸收光譜Fig.1 Visual absorption spectrum of rutin standard solution

圖1 表明：在測定的可見光波長范圍內，最大吸光度處所對應的波長為510 nm。因此，試驗以510 nm為最大吸收波長確定蒲公英植株和花中的黃酮類化合物。

2.2 標準曲線的繪制

根據1.3.3 測定結果繪制的蘆丁標準品的標準曲線。根據朗伯比爾定律對曲線進行線性擬合，擬合后的標準曲線方程為：y=0.007 91 x，方程的決定系數R2=0.999 6。

2.3 單因素試驗結果分析

2.3.1 蒲公英植株中黃酮類化合物的提取

不同料液比條件下，蒲公英植株中黃酮類化合物的得率變化情況如圖2（a）示。在料液比為1∶40 之前，料液比增大，蒲公英植株中黃酮類化合物的得率增加；在料液比為1∶40 之后，隨著溶劑用量的增大，蒲公英植株中黃酮類化合物的得率稍有下降；得率在料液比為1∶40 處最大。這主要是由于溶劑用量增加的同時，黃酮類化合物與溶劑的接觸空間（或面積）也增加了，此時黃酮類化合物的溶解平衡向溶解方向移動，因此得率也隨之增加。但是當料液比增大到一定程度，乙醇溶劑中黃酮類化合物基本達到飽和狀態而使溶解過程達到平衡而不再發生移動，得率基本不會再增加[18]。

圖2 各因素對蒲公英植株中黃酮類化合物得率的影響Fig.2 Effect of various factors on the extraction rate of flavonoids from dandelion plants

蒲公英植株中黃酮類化合物得率隨提取時間的變化如圖2（b）所示。超聲時間從20 min 增加至40 min，得率從2.80%增加到4.50%；當時間從40 min 增加至60 min，得率卻由4.50%降至3.56%，黃酮類化合物的得率在40 min 處達到峰值。這是因為蒲公英植株中的黃酮類化合物溶解到溶劑中的這一過程達到平衡需要時間，時間較短，黃酮類化合物沒有被完全浸提出來，得率較低；而時間過長則會使已經被浸提出來的黃酮類化合物發生氧化，濃度降低，得率也會隨之下降[19]。所以，蒲公英植株中黃酮類化合物的最佳提取時間為40 min。超聲波提取法能夠使溶劑的機械振動加快，從而使溶解速度加快，試驗在40 min的得率可達4.50%，而熱回流提取法90 min 的得率僅為4.16%[10]。

圖2（c）是不同溫度下，蒲公英植株中黃酮類化合物得率的變化情況。溫度在40 ℃至60 ℃區間內得率急劇增大，溫度到達60 ℃時得率最高為4.12%；溫度再升高得率明顯下降。其中一個原因是：溫度升高，分子的運動加劇，從動力學角度來看溶解速度迅速增大，從而使蒲公英植株中的黃酮類化合物快速溶解到溶劑中；但溫度達到某一值后，溶解主要受熱力學控制而達到平衡。另一原因是因為高溫條件加速了黃酮類化合物的氧化反應[20]。因此蒲公英植株中黃酮類化合物的最佳提取溫度為60 ℃。

2.3.2 蒲公英花中黃酮類化合物的提取

不同料液比條件下，蒲公英花中黃酮類化合物的得率情況如圖3（a）所示。當料液比在1∶40 之前，隨著溶劑用量的增大，蒲公英花中黃酮類化合物的得率呈線性增加；在料液比為1∶40 之后，隨著溶劑用量的增大，蒲公英花中黃酮類化合物的得率呈現不明顯的減小趨勢。其原因與蒲公英植株中黃酮類化合物的提取相似，由此可知提取蒲公英花中黃酮類化合物的最佳料液比為1∶40。

圖3 各因素對蒲公英花中黃酮類化合物得率的影響Fig.3 Effect of various factors on the extraction rate of flavonoids from dandelion flowers

圖3（b）為不同提取時間條件下，蒲公英花中黃酮類化合物的得率變化情況。超聲時間在50 min 時，對蒲公英花中黃酮類化合物的提取效果最好，得率最大；在50 min 前，得率隨著超聲時間的增加而增加；在超聲時間超過50 min 之后，得率呈下降趨勢。原因與蒲公英植株中黃酮類化合物的提取相似，提取蒲公英花中黃酮類化合物的最佳超聲時間為50 min。

蒲公英花中黃酮類化合物的得率隨溫度的變化如圖3（c）所示，得率最大出現在溫度60 ℃處。在40～60 ℃之間，黃酮類化合物的得率與溫度呈正相關；60 ℃以后，黃酮類化合物的得率與溫度呈負相關。原因與蒲公英植株中黃酮類化合物的提取相似，蒲公英花中黃酮類化合物的最佳提取溫度為60 ℃。

2.4 正交試驗結果分析

表3、表4 為三因素三水平正交試驗設計表及結果。

表3 L9（33）正交試驗設計及結果（蒲公英植株）Table 3 Orthogonal experimental design and results of L9（33）（dandelion plant）

表4 L9（33）正交試驗設計及結果（蒲公英花）Table 4 Orthogonal experimental design and results of L9（33）（dandelion flowers）

根據表3 中試驗數據，在提取過程中選取的三個影響因素中，影響蒲公英植株中黃酮類化合物得率最為明顯的因素是A，其次為B、C，即主次順序為：料液比＞超聲時間＞溫度。在試驗范圍內提取蒲公英植株中黃酮類化合物的最優組合為A3B2C2，對應表1 中的料液比1∶50（g∶mL），超聲時間40 min，溫度60 ℃。

由表4 試驗結果可知，三個影響因素中，對蒲公英花中黃酮類化合物的提取效果影響最大的為C，其次為A、B，即主次順序為：溫度＞料液比＞超聲時間。在試驗范圍內提取蒲公英花中黃酮類化合物的最優組合為A2B2C3，對應表2 中的料液比1∶40（g∶mL），超聲時間50 min，溫度70 ℃。

2.5 驗證試驗

在蒲公英植株和蒲公英花的最佳提取工藝條件下，即蒲公英植株∶料液比1∶50（g∶mL），超聲時間40 min，溫度60 ℃；蒲公英花∶料液比1∶40，超聲時間50 min，溫度70 ℃，對蒲公英植株與蒲公英花中的黃酮類化合物進行了提取，得率分別為，蒲公英植株：4.86%、蒲公英花：3.95%。與范萌等[12]通過Design-Expert 軟件設計的響應面優化實驗所得的蒲公英植株中黃酮類化合物的得率相當。

2.6 黃酮類化合物的表征與定量檢測

2.6.1 粗提液的可見吸收光譜

如圖4 所示，蒲公英植株和花的可見吸收光譜與標準品的可見吸收光譜基本一致，最大吸收峰所對應的波長都是510 nm。由此得知，蒲公英植株和花的粗提液成分與蘆丁標準溶液成分基本一致。

圖4 蘆丁標準品、蒲公英植株和蒲公英花提取液的可見吸收光譜圖Fig.4 Visual absorption spectrum of rutin standards Dandelion plant and Dandelion flower extracts

圖5 蘆丁標準品、蒲公英植株和蒲公英花提取液的紅外吸收光譜圖Fig.5 Infrared absorption spectrum of rutin standards，Dandelion plant and Dandelion flower extracts

2.6.2 紅外吸收光譜

圖4 為蘆丁標準品、蒲公英植株和蒲公英花的紅外吸收光譜。

羥基、烷氧基和異戊烯氧基等基團是天然黃酮類化合物中常有的取代基，波數在3 100～3 460、1 600～1 640 cm-1，以及1 372、1 242、1 058 cm-1的紅外光譜振動峰是黃酮類化合物的特征峰[21]。

如圖4 蒲公英植株和花的紅外光譜在3 426 cm-1處出現的寬而強的峰為O-H 基的吸收峰，說明存在大量締合的-OH 基團；在2 926、2 850、1 387 cm-1附近有較強的表征CH2-和CH3-的吸收峰出現，證明飽和碳上的氫較多；1 635 cm-1處的吸收峰為羰基的伸縮振動峰；1 518～1 322 cm-1范圍內的吸收峰為苯環的吸收峰，證明苯環的存在；1 320～1 158 cm-1范圍內的吸收峰是羥基的彎曲振動吸收峰；在1 271 和1 045 cm-1兩處的吸收峰分別為C-O-C 鍵的反對稱和對稱伸縮振動峰；890～700 cm-1范圍內的吸收峰為苯環上取代基引起的吸收峰。上述特征峰與標準品特征峰基本一致，說明蒲公英植株和花的粗提液是典型的黃酮類化合物。

3 結論

（1）蒲公英植株與蒲公英花的粗提液中含有黃酮類化合物。

（2）結合單因素試驗所確定的因素水平范圍，選取料液比、超聲時間、溫度三個因素，設計三因素三水平的正交試驗并得出：影響蒲公英植株中黃酮類化合物得率的三個主要因素，影響作用由大到小依次為：超聲時間＞料液比＞溫度；影響蒲公英花中黃酮類化合物得率的三個主要因素，影響作用由大到小依次為：溫度＞料液比＞超聲時間。

（3）蒲公英植株中黃酮類化合物的最佳提取條件為：料液比1∶50（g∶mL），超聲時間40 min，溫度60 ℃；蒲公英花中黃酮類化合物的最佳提取條件為：料液比1∶40（g∶mL），超聲時間50 min，溫度70 ℃。應用上述條件，對蒲公英植株和花中的黃酮類化合物進行提取并驗證，得到蒲公英植株的得率為4.86%，蒲公英花為3.95%。試驗結果表明，蒲公英植株中黃酮類化合物的含量高于蒲公英花中黃酮類化合物的含量。

（4）試驗為蒲公英及蒲公英花中黃酮類化合物的研究，及其深加工提供了有益的參考。