基于網絡藥理學及分子對接探討馬齒莧治療腹瀉型腸易激綜合征靶點分析

楊陽，曹俊陽，周協琛，李濤，李炎，趙蕊

（黑龍江八一農墾大學，大慶 163319）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一中常見的功能性胃腸道疾病，其臨床特征為慢性間歇性腹痛并伴有排便習慣改變或排便性狀的改變[1]。根據羅馬Ⅲ標準以及患者疼痛部位、糞便稠度的不同，IBS 主要分為腹瀉型腸易激綜合征（IBS with diarrhea，IBS-D）、便秘型腸易激綜合征（IBS with constipation，IBS-C）、腹瀉和便秘交替型腸易激綜合征（IBS with mixed symptomology，IBS-M）及未分類型腸易激綜合征（IBS-unclassified）四種亞型[2]。IBS-D 作為IBS 的主要亞型，占據IBS 病例的23.3%～65%[3]。IBS-D 在中、青年中多見，但近年來IBS-D 老年患者數量也在攀升。反復發作的IBS-D 可誘發多種慢性疾病，并嚴重影響患者情緒健康和生理功能，對生活質量產生負面影響。

中醫有“無濕不成泄”之說。歷代醫者多認為IBS-D 的病發主要與濕熱、肝郁、脾瀉相關。馬齒莧（Portulaca oleracea Linn，POL）形似馬齒，全草可入藥，由清熱祛濕、健脾止瀉、涼血止血之功[4]。作為一種傳統治療腸炎及腹瀉的中藥材，馬齒莧早在北宋時期就已被發現并得到運用?！妒セ莘健吩鴳民R齒莧煮粥以治血痢，馬齒莧治紅痢癥也早記載于《生草藥性備要》中[5]?，F代醫學研究表明，馬齒莧可通過抑制腸粘膜的氧化應激及腸上皮細胞的凋亡發揮對腸道的保護作用[6-7]。馬齒莧因其富含黃酮、有機酸、多糖等多種抗菌成分而被譽為“天然抗生素”[8-10]?，F代藥理學研究表明馬齒莧具有抗氧化、抗腫瘤、調節血糖等生物學功能[11-13]。目前，馬齒莧已成為治療急、慢性細菌性痢疾的要藥，但其治療IBS-D 的作用機制研究還不深入。

網絡藥理學是一個融合了生物學、藥學、數學和計算機科學的新興學科。因為集目標化合物篩選、多靶點預測、網絡構建于一體，網絡藥理學已成為探究中藥潛在活性成分及防治疾病作用機制的綜合工具[14]。研究以馬齒莧為對象，通過網絡藥理學手段探究馬齒莧治療IBS-D 潛在的作用機制，為馬齒莧治療IBS-D 提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 馬齒莧化學成分的收集與篩選

利用中藥系統藥理學分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索中草藥馬齒莧的有效化學成分。設置口服利用度（OBioaval，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）為篩選條件。以“馬齒莧”為關鍵詞，篩選出OB≥30%及DL≥0.18 的化學成分即為馬齒莧的有效成分。

1.2 IBS-D 靶點的收集與篩選

以“Diarrhea irritable bowel syndrome”“Diarrheairritable bowel syndrome”“D -irritable bowel syndrome”“irritable bowel syndrome-Diarrhea”“irritable bowel syndrome-D”“IBS-D”“D-IBS”為關鍵詞在GeneCard 數據庫（https：//www.genecards.org/）中查找腹瀉型腸易激綜合征的相關靶點，匯總并刪除重復靶點。以IBS 為關鍵詞在CTD 數據庫中查找腸易激綜合征相關的靶點。CTD 數據庫與GeneCard 數據庫的交集靶點即為IBS-D 對應的疾病靶點。

1.3 馬齒莧治療IBS-D 靶點互作用網絡的構建

借助Venny 分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）獲取馬齒莧與IBS-D 的交集靶點。將交集靶點蛋白導入STRING（https：//string-db.org/）數據庫，在參數欄中設定置信分數高于0.9，去掉游離節點后導出PPI（Protein-protein interaction，PPI）蛋白互作網絡圖。將網絡導入Cytoscape 3.7.2，根據度值對網絡進行拓撲學分析并利用cytoscape 中cytohubba 插件篩選核心治療靶點，根據篩選結果繪制POL 治療IBS-D 核心靶點的PPI 網絡圖。

1.4 GO 富集分析

利用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點進行基因本體（Gene ontology，GO）富集分析。將核心靶點導入DAVID 數據庫，設置物種為“Homo sapiens”，運行并保留核心靶點生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）及分子功能（Molecular Function，MF）三方面的分析結果。將分析結果上傳至Bioinformatics 平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/），以基因數為縱坐標繪制BP、CC、MF 三合一條形圖。

1.5 KEGG 富集分析

使用Cytoscape 中的clueGO 插件對核心靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析。上傳馬齒莧治療IBS-D 的核心靶點，將物種設為“Homo sapiens”，以p-value＜0.01 為篩選條件進行KEGG 富集分析并利用CluePedia 插件調整ClueGO分析網絡圖。

1.6 分子對接

在TCMSP 數據庫下載馬齒莧活性成分mol2 格式的結構。從PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）獲取核心蛋白的3D 結構。利用分子對接軟件AMDock 計算分子對接的結合能并借助Pymol 軟件將對接結果可視化。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧活性化合物篩選

以OB≥30%、DL≥0.18 為條件在TCMSP 數據庫對馬齒莧活性成分進行篩選。如表1 所示，篩選后共得到10 個馬齒莧活性化合物，包括花生四烯酸（Arachidonicacid）、環阿喬醇（Cycloartenol）、β-胡蘿卜素（Beta-carotene）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、山柰酚（Kaempfero）、木犀草素（Luteolin）、異甜菜素（Isobetanidin）、脫糖苷異豆素（Isobetanin_qt）、槲皮素（Quercetin）等。馬齒莧活性化合物對應化學結構見圖1。

2.2 IBS-D 疾病靶點獲取

如圖2 所示，從GeneCard 數據庫中共搜集到IBS-D 相關靶點2 344 個，從CTD 數據庫中共搜集到IBS 相關靶點464 個。將GeneCard 數據庫與CTD數據庫的靶點取交集，共得到222 個IBS-D 疾病靶點。

圖2 馬齒莧與IBS-D 交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn Diagram of intersection target of POL and IBS-D

2.3 馬齒莧治療IBS-D 的潛在靶點

通過TCMSP 數據庫獲取馬齒莧的靶點，并利用UniProt 數據庫（https：//www.Uniprot.org/）將馬齒莧靶點名稱標準化。利用韋恩圖分析工具對馬齒莧靶點與IBS-D 靶點取交集。如圖2 所示，馬齒莧活性成分靶點共194 個，其中與IBS-D 相關的有68 個，包括IL10、MAPK8、VEGFA 等。

2.4 馬齒莧治療IBS-D 潛在靶點PPI 網絡分析

將馬齒莧治療IBS-D 的68 個潛在靶點導入String 數據庫進行分析。如圖3 所示，PPI 網絡由68個節點和219 條邊構成，其中有6 個靶點與其他靶點無交集。將互作網絡導入Cytoscape 軟件，刪除無交集靶點后依據度值對剩余靶點進行排序。度值越高的靶點表示與該靶點相互作用的蛋白數量越多。由圖4 可知，JUN、RELA、IL6、TNF、IL10 度值較高，在網絡中起主導作用。

圖3 馬齒莧治療IBS-D 潛在靶點PPI 網絡圖Fig.3 PPI network of potential target of POL in the treatment of IBS-D

圖4 潛在靶點蛋白互作拓撲學分析圖Fig.4 Topology analysis results of potential targets interaction

2.5 馬齒莧治療IBS-D 核心靶點PPI 網絡分析

利用Cytoscape 軟件中CyoHubba 插件進行網絡拓撲分析，獲取馬齒莧治療IBS-D 的核心靶點。如圖5 所示，馬齒莧治療IBS-D 的核心靶點包括白細胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-8（Interleukin-8，CXCL8/IL-8）、單核細胞趨化蛋白1（Monocyte chemotactic protein-1，CCL2/MCP-1）、白細胞介素-1B（Interleukin-1B，IL-1B）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1A（Interleukin-1A，IL-1A）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、核轉錄因子（NF-κB p65，RELA）等。

圖5 馬齒莧治療IBS-D 核心靶點PPI 網絡圖Fig.5 PPI network of POL core target in the treatment of IBS-D

2.6 馬齒莧治療IBS-D 核心靶點GO 富集分析

GO 富集分析涵蓋BP、CC、MF 三方面。設定閾值為P＜0.05，在此條件下共獲取123 個GO 條目，其中BP 111 個，CC 4 個，MF 8 個。如圖6 所示，前10 條BP 涉及炎癥反應、免疫應答、轉錄的正調控、細胞對脂多糖的反應、細胞因子介導的信號通路、衰老及對藥物的反應等。CC 分析結果表明這些靶蛋白多分布在細胞外間隙、胞外區及質膜外側上。MF 分析結果表明：這些靶蛋白的分子功能主要為細胞因子活性、生長因子活性、趨化因子活性等。

圖6 GO 富集分析結果Fig.6 Analysis results of GO enrichment

2.7 馬齒莧治療IBS-D 核心靶點KEGG 富集分析

利用Cytoscape 軟件中ClueGO 插件對馬齒莧治療IBS-D 的核心靶點進行KEGG 富集分析。以P＜0.01 為條件進行篩選，共篩選出40 條POL-IBS-D潛在信號通路。ClueGO 網絡圖中每一個節點代表一個term，同種顏色則表示相近的term 聚類。由圖7 所示，馬齒莧治療IBS-D 的機制主要涉及NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptors signaling pathway）、NF-κB 信號通路（Nuclear factor-kappa B signaling pathway）、白細胞介素-17 信號通路（Interleukin-17 signaling pathway）等。這些信號通路與細胞因子-細胞因子受體的作用、造血細胞系、產IgA 的腸道免疫網絡調控等密切相關。此外，這些信號通路也參與了脂質動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、炎癥性腸病、哮喘等疾病。

圖7 KEGG 信號通路富集分析結果Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis results

2.8 分子對接結果

將馬齒莧活性化合物分別與RELA、CCL2、CXCL8、IL-1A 等核心靶點蛋白進行分子對接驗證。對接得分越小，表明受體蛋白與配體分子結合的越穩定。如表2 所示，馬齒莧活性化合物與大部分核心靶點均有較好的結合。其中，花生四烯酸與IL-1A蛋白結合較好；環阿喬醇和β-胡蘿卜素與RELA蛋白結合效果較好；β-谷甾醇與TNF 蛋白結合較好；山奈酚、橙皮苷、木犀草素及槲皮素均與JUN 蛋白結合較好，異甜菜素及脫糖苷異豆素與IL-10 蛋白結合較好，這表明IL-1A、RELA、TNF、JUN 及IL-10 可能是馬齒莧治療IBS-D 的關鍵靶點。將對接結果用Pymol 進行可視化分析并繪制分子對接模式圖。由圖8 可知，馬齒莧活性化合物多通過氫鍵作用力與核心蛋白氨基酸殘基發生相互作并結合至蛋白活性位點。

圖8 分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking diagram

表2 核心靶點與馬齒莧化合物的分子對接結果Table 2 Molecular docking results of core active ingredients of POL

3 討論

IBS-D 是一種慢性復發性胃腸道疾病，發病機制尚未明確。國外有學者指出，IBS-D 常見于細菌性胃腸炎癥后，并多伴隨腸粘膜持續的免疫激活[15]。目前，治療IBS-D 的藥物主要包括止痛類藥物及止瀉類藥物，如硝苯吡啶、苯乙哌啶等，但這些藥物均存在一定的毒副作用，不適宜長期服用。傳統中藥因其高效低毒的特性而被廣泛應用于治療多種疾病[16]。馬齒莧是一種民間傳統中草藥，多用于治療腹瀉、腹痛等癥。然而，馬齒莧的活性成分及其治療IBS-D 的作用機制目前仍不清楚。在研究中，利用網絡藥理學手段篩選了馬齒莧的活性成分并探究了馬齒莧治療IBSD 的分子靶點和機制。

通過TCSMP 數據庫檢索馬齒莧的成分并以類藥性及口服利用度為條件進行篩選，最終得出10 種馬齒莧主要活性成分，包括β-胡蘿卜素、橙皮苷、山柰酚、木犀草素、槲皮素等。作為維生素A 的前體，β-胡蘿卜素具有明顯的自由基清除特性。臨床研究表明，服用β-胡蘿卜素可以緩解IBS-D 的炎癥狀態，改善IBS-D 患者的腹痛強度和排便頻率[17]。Yosuke等[18]研究發現，20 mg·kg-1木犀草素可以保護葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎并顯著抑制巨噬細胞和CD4T 細胞向結腸粘膜的浸潤，說明木犀草素具有腸道抗炎活性。此外，槲皮素、橙皮苷、山柰酚等成分也可通過抑制氧化應激、調節腸粘膜功能、平衡腸道微生物等途徑維持腸道穩態[19-20]。以上結果表明，這些成分可以作為馬齒莧的活性成分并進行后續抗IBSD 相關機制的探究。

基于馬齒莧活性化合物篩選得到與IBS-D 相關靶點共68 個。對68 個靶點進行蛋白互作網絡分析后發現，JUN、RELA、TNF、IL-10、IL-1B、IL-1A 等靶點度值較高，與其他靶點相互作用較為密切，為馬齒莧治療IBS-D 的核心靶點。富集分析結果表明核心靶點參與的生物學過程主要與炎癥反應、免疫應答、衰老、細胞增殖以及細胞因子的調節相關。有研究表明，腸粘膜持續的低度炎癥可能是IBS-D 發病的重要原因[21]。在馬齒莧調節IBS-D 的核心靶點中，與調節炎癥反應相關的靶點蛋白數量占據80%，主要包括IL-1A、IL-1B、TNF、CXCL8、RELA、IL-10 等。IL-1A 和IL-1B 是IL-1 家族的重要成員。作為有效的炎癥細胞因子，IL-1A 和IL-1B 可激活炎癥過程并引發局部和全身炎癥反應[22]。然而與健康人群相比，IBSD 患者體內IL-1A、IL-1B 水平顯著升高。腸內穩態的紊亂被證明是IBS-D 患者腸道炎癥的基礎。作為一種強大的炎癥誘導劑，TNF 可通過破壞緊密連接蛋白、誘導上皮細胞分泌炎性因子、激活NF-κB 等方式廣泛參與細胞分化、凋亡并誘發炎癥反應[23]。有研究表明，小檗堿能夠下調IBS-D 小鼠模型中TNF-α/NF-κB/MLCK 通路的異常激活，從而保護腸上皮緊密連接并修復IBS-D 對腸上皮屏障造成的損傷[24]。Chu Hao-Ran 等[25]在探究艾灸對IBS-D 大鼠結腸TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的影響時也發現，艾灸治療后血清中的TNF-α 水平顯著降低，炎癥情況明顯緩解。此外，從富集分析結果中可知，大部分核心靶點也與衰老密切相關。由此可見，馬齒莧可通過作用于炎癥相關靶點并抑制衰老相關基因表達從而對ISB-D 老年患者起到保護作用。

KEGG 通路分析結果顯示馬齒莧治療IBS-D 的關鍵通路主要包括NOD 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、白細胞介素-17 信號通路、TNF 信號通路、TLR 信號通路等。目前，已知宿主NOD 樣受體蛋白6（NOD-like receptor family pyrin domain containing 6，NLRP6）炎癥信號通路與IBS 密切相關。有研究結果表明，溫和灸可以通過控制NLRP6 炎性體信號傳導來緩解IBS 的炎癥和內臟超敏反應[26]。NF-κB 由一系列轉錄因子組成，可參與調節炎癥、先天免疫等多種生物反應。通瀉藥方已被證明對IBS-D 患者有效。研究表明，通瀉藥方可增強腸黏膜屏障功能，其機制與抑制炎癥級聯反應及抑制NF-κB 信號通路有關[27]。由KEGG 結果可知，馬齒莧主要通過影響炎癥信號通路、天然免疫信號通路等抵抗IBS-D。此外，可以看出同一靶點可參與調控多條信號通路，這也印證了中藥同病異治的治療特點。

將馬齒莧活性化合物與關鍵靶點進行分子對接并計算結合能。結合能分值≥－4.00，則表明配體與靶點無法自發結合；結合能分值小于－4.00 且大于－7.00，則認為配體與靶點的結合活性較好；≤－7.00，則認為配體與靶點結合活性更為良好。研究分子對接結合能結果表明，馬齒莧活性化合物均可與關鍵靶點蛋白自發結合，且結合活性較好。從分子對接結合模式圖可知，馬齒莧活性化合物多通過氫鍵作用力與靶蛋白相互作用。由于β-胡蘿卜素不存在H 供體及受體，無法形成氫鍵，因此其主要通過范德華力、疏水結合Pi-Alkyl 作用等方式與靶蛋白結合。分子對接結果進一步說明馬齒莧主要活性成分可通過調控上述核心靶點對IBS-D 發揮治療作用，驗證了上述網絡藥理學結果的可靠性。馬齒莧活性成分對核心蛋白良好的結合能力也表明馬齒莧具有多靶點、多途徑的治療特點。

綜上所述，通過網絡藥理學方法預測了馬齒莧主要的活性成分、治療IBS-D 的潛在作用靶點及通路并利用分子對接手段進行了驗證，一定程度上揭示了馬齒莧治療IBS-D 的作用機制。研究后續將進一步通過體內、外實驗對所得的馬齒莧成分及IBS-D靶點加以驗證，為馬齒莧防治ISB-D 的臨床應用奠定基礎。