3D生物打印角膜組織的研究進展

袁正 周春陽

角膜在眼球光學系統中起著至關重要的作用,角膜疾病是導致失明的主要原因之一。目前,治療角膜盲的主要方法是角膜移植,而用于移植的角膜主要來源是器官捐獻,不足以滿足臨床需求。供體角膜的嚴重短缺推動了角膜替代物的研究。隨著3D打印技術的迅速發展和進步,目前在眼科和眼科護理等領域發揮著重要的作用,如制造眼眶植入物、眼球假體等定制產品。3D生物打印技術(3D bio-printing technology)是一項廣泛應用于再生醫學的新興技術。該技術使用由活細胞、生物材料或活性生物分子組成的生物墨水,通過計算機輔助控制在空間逐層精確排列來制造具有生物活性的組織或器官替代物。3D生物打印的出現,使獲得個性化的角膜植入物和具有可控結構與設計的單層或多層角膜等效物成為可能,是一種很有前景的角膜替代方法。預計在不久的將來,將有更多的眼科醫生和其他臨床醫生使用這項技術。

1 用于3D生物打印的材料

由于天然組織微環境的復雜性,精確構建仿生微環境仍然是一個挑戰。3D生物打印系統能夠產生微米級仿生微結構和微環境。水凝膠、纖維素等材料作為構建仿生微環境的關鍵構件,需要滿足印刷適宜性好、印刷過程變形小以及對細胞友好和快速凝膠化的要求。最重要的是,水凝膠應該提供引導細胞構建自然微環境的平臺,并且以精確和近生理的方式調節細胞的增殖和分化。

1.1 藻酸鹽水凝膠

藻酸鹽水凝膠是一種天然多糖,通常來自各種藻類。具有成本低、生物相容性好、離子凝膠化速度快等優點,已成為3D生物打印的理想生物墨水來源,目前已應用于血管組織、骨和軟骨的打印。然而,缺乏細胞粘附性、生物降解性不穩定以及印刷適宜性差限制了藻酸鹽水凝膠生物墨水的應用。這種水凝膠中的細胞不能降解周圍的藻酸鹽凝膠基質,導致它們始終保持在低增殖和未分化狀態。Wu等[1]通過添加檸檬酸鈉并搭載人角膜上皮細胞獲得了可降解的細胞負載組織結構。該結構穩定性好,細胞可表現出更高的增殖率且存活率高達90%以上。Tabriz等[2]開發了一種新的3D生物打印技術,以生產更復雜的藻酸鹽水凝膠結構。通過將藻酸鹽水凝膠的交聯過程分為三個階段來實現:一次鈣離子交聯劑用于凝膠的印刷適宜性;二次鈣離子交聯劑用于藻酸鹽水凝膠在印刷后的剛性;三次鋇離子交聯劑用于藻酸鹽水凝膠在培養介質中的長期穩定性。為了確保該生物打印技術的可行性,首先打印了簡單的3D結構,然后成功打印了分支血管結構等復雜3D結構。

Olate-Moya等[3]通過微擠壓工藝開發了用于3D打印的生物共軛水凝膠納米復合油墨,提高了生物相容性和印刷性。這種水凝膠是基于與明膠和硫酸軟骨素生物結合的可光交聯性藻酸鹽,以模擬軟骨細胞外基質;而納米填料是基于氧化石墨烯,以增強印刷性和細胞增殖。結果表明,在水凝膠墨水中加入氧化石墨烯顯著提高了3D打印支架的形狀保真度和分辨率。此外,由于氧化石墨烯液晶的模板作用,納米復合油墨在3D打印過程中還會產生各向異性的線條。人脂肪組織來源的間充質干細胞(human adipose tissue derived stem cells,hASCs)的體外增殖實驗表明,生物偶聯支架的細胞增殖率高于純藻酸鹽,其中納米復合材料的細胞增殖率最高。第7天hASCs在不同支架上完全存活。值得注意的是,用納米復合水凝膠墨水制備的支架能夠引導細胞沿著3D打印線的方向增殖。28天后的免疫染色顯示,生物結合的藻酸鹽水凝膠基質可在不含外源性促軟骨生成因子的情況下誘導成軟骨細胞分化。

1.2 甲基丙烯酸酯明膠

基于甲基丙烯酸酯明膠(gelatin methacrylate,GelMA)的水凝膠在組織工程中作為潛在的可植入材料受到了極大的關注。由于不同的自然組織對機械力的反應不同,理想的植入材料需要與靶組織的機械性能非常匹配。研究表明,GelMA水凝膠有助于緩解角膜基質纖維化現象,減少纖維化導致的角膜屈光力損失。但目前GelMA水凝膠的應用仍受到GelMA低機械強度和物理性質的限制。許多研究詳細描述了將各種生物材料加入到GelMA水凝膠中,以調整其各種性能,例如物理強度、化學性質、導電性,并促進細胞負載和加速組織修復。

Farasatkia等[4]開發了基于絲素納米纖維(silk nanofibrils,SNF)和GelMA的透明薄膜用于角膜組織工程。通過改變SNF與GelMA的體積比,可以調節薄膜的力學性能、透明度、降解速率和溶脹比。其中,SNF/GelMA的最佳配比為3:7,可具有較高的透明性,透光率可達85%以上,親水性和力學性能接近天然角膜基質。細胞培養研究還證明了SNF/GelMA膜支持基質細胞附著、擴散和增殖的能力。Yin等[5]使用3D生物打印將5%(w/v)細胞負載的GelMA生物墨水精確沉積到具有高細胞活性的受控微結構中。通過在GelMA生物墨水中加入明膠,實現了明膠快速可逆熱交聯和GelMA不可逆光交聯的兩步交聯法。成功地將5%(w/v)的GelMA和8%(w/v)的明膠打印成3D結構,提高了生物打印后的形狀逼真度。通過骨髓干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的體外培養和細胞打印,證明了5/8%(w/v)的GelMA/明膠生物墨水的細胞活性。BMSCs在5/8%(w/v)的GelMA/明膠支架上的鋪展面積較大,打印后BMSCs的存活率達90%以上。

1.3 其他材料

許多基于天然聚合物的生物墨水均可用于3D生物打印,如多糖甲基纖維素、瓊脂、脫細胞基質等。Kim等[6]以部分氧化透明質酸鹽(oxidized hyaluronate,OHA)和乙二醇殼聚糖(glycol chitosan,GC)為原料,在己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)存在下,設計了一種自愈合水凝膠,具有再生軟骨的潛力。OHA/GC/ADH水凝膠的自愈合能力歸因于凝膠中兩個動態可逆的共價交聯鍵,包括OHA與GC之間通過席夫堿反應得到的亞胺鍵,以及OHA與ADH反應形成的酰肼鍵。OHA/GC/ADH水凝膠用于打印3D結構時不需要任何凝膠后或額外的交聯化過程,聚合物的濃度和相對分子質量是影響自愈合水凝膠流動性和力學性能的關鍵參數。Ji等[7]以1,4-丁二醇和碳酸二甲酯為原料,通過本體縮聚反應成功地制備了聚1,4-碳酸丁酯(poly 1,4-butylene carbonate,PBC),并評估了PBC在熔融沉積成型(fused deposition modeling,FDM)中的適用性。該研究將PBC在150℃以上的加熱室中熔化,然后施加壓力從打印噴嘴流出并在室溫下固化,形成3D支架結構。通過控制FDM機的溫度和壓力,可以得到與程序設計完全匹配的3D支架,且PBC支架具有良好的生物相容性。

2 載干細胞打印角膜組織

脂肪干細胞是間充質干細胞的一種亞型,具有低侵入性、易獲得的重要優勢。其具備分化為多種細胞系的潛能,可表現出免疫調節特性,并通過分泌營養因子促進組織再生。研究表明,hASCs可用于再生人類角膜的上皮層、基質層和內皮層[8]。

Sorkio等[9]使用人類干細胞和激光輔助3D生物打印來制造模擬角膜組織。人胚胎干細胞來源的角膜緣上皮干細胞(human embryonic stem cell derived limbal epithelial stem cells,hESC-LESCs)作為打印上皮樣結構的細胞源,而hASCs用于構建層狀基質樣結構。重組人層粘連蛋白和人源性I型膠原蛋白作為功能性生物墨水的基質。共打印了三種類型的角膜結構:包括使用hESC-LESCs的層狀角膜上皮;使用無細胞生物墨水和hASCs交替的角膜基質層;最后是具有基質和上皮的雙層結構。兩種細胞在打印后都保持了良好的活性。打印后的hESC-LESCs顯示上皮細胞形態、Ki67增殖標記物的表達以及角膜前體標記物p63α和p40的共同表達。重要的是,打印的hESC-LESCs形成了一層復層上皮,頂端表達CK3,基礎表達祖細胞標志物。3D生物打印的基質結構與天然角膜基質組織一致,并顯示I型膠原陽性標記。3D打印的基質構建物植入豬角膜器官中7天后,植入物附著在宿主組織上,并有hASCs從打印結構遷移的跡象。該研究表明使用人類干細胞,可以成功地制造出與天然角膜組織結構相似的3D生物打印組織。

Arnalich-Montiel等[10]測試了人脂肪干細胞移植到兔角膜基質中的生物安全性和免疫原性。脂肪干細胞在移植后10周,仍可保持其形狀,并在不破壞其組織學模式的情況下混合在基質中,沒有引起免疫反應。此外,即使脂肪干細胞在基質中形成一層不連續層時,透明度仍然保持不變。 Espandar等[11]研究表明,人脂肪干細胞可在兔角膜基質內成功生長,并能表達人角膜特異性蛋白。Alio等[12]將hASCs注入脫細胞人角膜基質中進行再細胞化,然后植入兔角膜基質內,評估了移植物的生物整合、干細胞活性和特異性蛋白的表達。結果表明,hASCs體外具有良好的再細胞能力,可在移植物內存活,并向有功能的角質形成細胞分化。植入后3個月移植物仍保持透明,且沒有任何排斥跡象。除此之外,還有研究團隊[13]提出了將hASCs定向分化為人角膜內皮細胞(human corneal endothelial cells,hCECs)的方案。進一步拓寬了自體眼外來源的細胞類型,可用于臨床治療角膜內皮缺乏癥。

3 載上皮細胞打印角膜組織

角膜神經、上皮和基質之間的相互作用對于維持健康的角膜是必不可少的。Wang等[14]構建了一個包括上皮、基質和神經的3D角膜組織模型。使用絲蛋白薄膜作為支架支撐角膜上皮和基質層,而周圍的絲質多孔海綿則支持神經元的生長。神經元支配上皮層和基質層,并改善組織的功能和生存能力。在體外模擬出角膜組織的氣液界面環境,對上皮成熟度產生了積極的影響。Gosselin等[15]設計了一個以絲蛋白生物材料為支架的共培養系統,研究了人角膜上皮細胞和人角膜基質干細胞在該培養體系中向角膜上皮細胞和基質細胞的生長和分化。結果表明,絲質支架與細胞兼容,可以形成透明的3D組織系統。此外,還研究了體外培養體系中人臍靜脈內皮細胞和人胚胎干細胞的增殖分化作用。與單純的角膜上皮細胞和角膜基質細胞相比,這兩種細胞類型在共培養體系中表現出更完整的分化和生長。角膜上皮絲膜結合了大量的IV型膠原,角膜上皮和基質蛋白表達和轉錄水平的增加,表明每種細胞類型的分化明顯。

He等[16]將GelMA和長鏈聚乙二醇二丙烯酸酯(poly ethylene glycol diacrylate,PEGDA)混合形成雙組分油墨,利用光引發共聚后的長鏈PEGDA結晶交聯對GelMA水凝膠起到增韌作用,結合數字光處理印刷技術,可打印不同機械強度的程序化PEGDA-GelMA物件。印制的PEGDA-GelMA水凝膠支持細胞的黏附、增殖、遷移,同時表現出較高的透光率,以及適當的溶脹度、營養物質的滲透率和降解率。由負載兔角膜上皮細胞的上皮層和兔脂肪間充質干細胞的纖維基質層組成的雙層穹頂狀角膜支架具備高精確度和可處理性。這種雙層細胞負載的角膜支架被應用于兔角膜移植。術后顯示角膜缺損區有效封閉、再上皮化和基質再生。3D打印角膜支架的微結構與上皮和基質層中細胞的精確定位相結合,為角膜再生提供了最佳的地形學和生物學微環境。

4 載基質細胞打印角膜組織

使用載角膜基質細胞(corneal stromal keratocytes,CSK)的膠原基生物墨水和合適的支撐結構可3D打印出與自然角膜基質類似的結構,CSK在打印后第7天仍可顯示出較高的細胞活力,并保持其天然的基質細胞表型。經光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)證實,3D生物打印的角膜基質等效物光學性質與天然角膜基質相似。Park等[17]將3D生物打印的脫細胞膠原片植入五只兔的角膜基質層,使用OCT對植入膠原片后的兔角膜進行了體內無創監測。術后1個月,通過對深度-強度的圖像分析和蘇木精-伊紅染色,證實了其具備生物相容性。

為了模擬角膜基質的自然形態和功能,有研究團隊制備了具有高透明度(約90%)的載基質細胞GelMA水凝膠[18]。穩定性研究表明,GelMA水凝膠在磷酸緩沖鹽溶液放置21天后仍有87%的保存率。凝膠中負載的CSK在48 h的細胞存活率超過90%;培養3周后,熒光圖像和掃描電子顯微鏡觀察到水凝膠中細胞拉長并相互連接,細胞均勻分布。此外,該團隊還制備了GelMA和聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly hydroxyethyl methacrylate,pHEMA)互穿網絡水凝膠作為角膜基質替代物,并進行了體內和體外實驗。隨著pHEMA的加入,凝膠的壓縮模數顯著增加。超過90%的CSK可在GelMA和GelMA-HEMA水凝膠中存活,同時合成了具有代表性的膠原蛋白和蛋白多糖,保留了細胞的功能和表型。并且細胞負載的GelMA-HEMA水凝膠在培育3周后,透明度與天然角膜相當。Mahdavi等[19]以GelMA與CSK混合作為生物墨水,利用3D生物打印出與人角膜解剖形態相似的穹頂狀結構。同時對兩種不同濃度的GelMA大分子聚合物(7.5%和12.5%)進行了角膜基質生物印跡試驗。結果表明,12.5%濃度GelMA支架的機械強度更高,更容易處理;含水率和透光率更接近天然角膜基質組織。7天后,12.5%濃度GelMA樣品中可見細長的CSK,表明細胞在支架內附著、生長和整合,細胞相容性更高?？傊?負載CSK的3D打印GelMA水凝膠具有極好的透明度、足夠的機械強度和高細胞存活率,模擬了角膜基質的生物和物理特性,是一種很有前景的角膜基質組織生物制造方法。

Ghezzi等[20]將基于多孔、光學透明的絲蛋白薄膜與人角膜基質干細胞(human corneal stromal stem cells,hCSSCs)相結合,通過將單層多孔絲膜堆積成正交的多層結構,制備了具有3D功能的角膜基質組織等效物。組織學切片顯示,接種hCSSCs的3D組織系統中產生了細胞外基質。與2D單層絲膜系統相比,3D組織系統中的hCSSCs基因表達上調。初始基質的重塑顯著提高了構建物的粘聚力和機械性能,同時在9周后保持了透明度。Kutlehria等[21]設計了高通量3D生物打印角膜等效物。將人CSK加入到優化的生物墨水中,打印出負載CSK的角膜基質等效物。結果顯示,CSK在2周內保持了較高的存活率(>95%),打印的角膜結構能夠保持其穩定性、完整性和透明度,且在打印的角膜中有纖維連接蛋白和肌動蛋白的表達。表明3D打印角膜基質等效物的高通量制造已經實現。

5 載內皮細胞打印角膜組織

有研究團隊將培養的hCECs懸液接種于脫細胞人角膜基質層上,構建組織工程角膜內皮移植物[22]。在兔角膜內皮損傷的模型中,分別植入和不植入含hCECs的脫細胞薄層(實驗組和對照組),并檢測了這些移植物的功能和存活率。結果顯示,hCECs在脫細胞薄層上提供了最佳且一致的內皮細胞計數密度和多邊形形態,并具備主動泵送功能。術后實驗組的角膜透明度逐漸恢復,而對照組的角膜混濁和水腫持續長達4周。組織學檢查顯示,實驗組的移植物表面覆蓋著人類來源的內皮細胞。表明脫細胞基質載體與hCECs體外復合移植治療角膜內皮疾病具備可行性,可提高角膜內皮疾病患者的視覺質量。

Kim等[23]將核糖核酸酶5(ribonuclease5,RNase5)表達載體導入培養的人臍靜脈內皮細胞中,獲得了高表達RNase5的hCECs。作為R5-hCECs促進細胞增殖和存活的候選靶點,程序性細胞死亡蛋白4被抑制,細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E1被激活。將培養的R5-HCECs和對照的hCECs分別沉積在凍干羊膜(amniotic membrane,AM)上,采用3D生物打印技術制備RNase5載體攜帶hCECs的可移植羊膜移植物(R5-Graft)和僅攜帶hCECs的對照AM移植物(Ct-Graft)。植入兔角膜后2周開始,R5-Graft和Ct-Graft兩組兔角膜的透明性都逐漸恢復;第3～4周時,R5-Graft組的角膜中央水腫明顯輕于Ct-Graft組,且角膜內皮表型標志物的體外表達明顯高于Ct-Graft組。該研究表明使用培養的人臍靜脈內皮細胞構建的角膜內皮細胞在體內容易存活并可作為角膜內皮細胞發揮作用。此外,使用高表達RNase5的hCECs可能是獲得更高的移植物細胞密度和增強移植物功能的一種選擇。

6 總結與展望

3D生物打印基于數學模型和計算機斷層掃描技術,可以設計并制作個性化角膜替代物。利用快速、簡單、低成本、高重復性和高質量的制造工藝,根據生物力學分析、重量、結構完整性和生物相容性等方面對打印的角膜替代物進行評估,可以制作出符合自然人體角膜結構特征的高透光性的曲面薄膜。目前的研究主要使用搭載干細胞、上皮細胞、基質細胞和內皮細胞的生物墨水3D打印出具備不同生理特點的角膜組織,并已經證明了個性化設計、分析和制造角膜替代物具備可行性。隨著研究的不斷深入,3D生物打印的角膜替代物能夠應用于臨床,解決角膜供體稀缺的難題。

除此之外,3D生物打印的個性化角膜替代物有望應用于角膜屈光手術領域,矯治目前普遍存在的近視、遠視和散光。傳統的激光角膜屈光手術通過切削角膜組織來矯正屈光不正,受角膜厚度、角膜形態等因素的限制。而角膜透鏡植入可以突破該限制,使角膜屈光手術不消融角膜組織成為可能。通過3D生物打印技術體外構建個性化的角膜基質透鏡,將透鏡植入受體角膜基質層間改變角膜的曲率以矯正屈光不正。當植入角膜基質層間的透鏡為凹透鏡時,可降低角膜的屈光力,達到矯正近視的效果。