中醫腫瘤基礎實驗模型研究現狀與進展

吳先林， 江海媚， 張錦芳， 黃海福

廣州中醫藥大學深圳醫院（福田），深圳市中醫腫瘤醫學中心，廣東 深圳 518000

當前，惡性腫瘤仍然嚴重威脅人類健康。我國是世界第一人口大國，癌癥新發人數遠超世界其他國家。據統計，全國每日大約有1.25 萬人確診癌癥。近30年來，我國癌癥死亡率增加了80%，發病率與死亡率呈持續上升趨勢，癌癥已成為國人的第一殺手。2020年，中國新發癌癥457萬人，占全球新發人數的23.7%，死亡人數300 萬，占全球癌癥死亡人數的30%，遠超其他國家[1]。

腫瘤屬于中醫“癥瘕”、“積聚”和“巖”等范疇，也有具體部位的腫瘤如“瘰疬”、“噎膈”和“腸蕈”等。中醫學對腫瘤的發病成因認識，不外乎內因和外因。內因最主要是機體正氣不足，外因包括外感六淫、飲食七情所傷，以及氣滯、血瘀、痰凝和毒結等病理產物的長期作用[2]。中醫藥是治療腫瘤的重要手段，在多年的臨床實踐中，中醫藥治療腫瘤已經形成了扶正固本、以毒攻毒、活血化瘀、清熱解毒和軟堅散結等治則治法，在減輕患者痛苦、延緩腫瘤組織擴散、改善生活質量和延長生存期等方面，發揮了重要的作用[3]。

中醫實驗研究在探索腫瘤的中醫病因病機、驗證中藥方劑的有效性和安全性以及闡明中藥的作用機制和藥效規律等方面具有重要的作用。腫瘤實驗模型是中醫腫瘤學的重要研究對象，基于中醫“辨證論治”的獨特性，中醫腫瘤實驗模型具有一定的特殊性。本文結合中醫腫瘤證候動物模型、類器官模型和細胞模型的最新研究現狀，闡述實驗模型在中醫腫瘤學中的應用和前景，希冀為中醫腫瘤研究提供思路與依據。

1 腫瘤的中醫證型相關的實驗動物模型

中醫證型動物模型是指根據中醫證型的特點和臨床表現，在中醫整體觀念及辨證論治思想指導下，結合中醫病因病機理論，依據人類疾病原型制定模型構建方法，最后制作成中醫證候臨床表現相符的動物模型。中醫證候動物模型主要分為病的模型、證的模型和病證結合模型三大類。

1.1 中醫證候模型研究概述

疾病動物模型是研究疾病發生、發展機制和篩選出最有效、最安全的治療方法的動物模型，主要制作方法是采用不同致病因素誘導動物產生相對應的疾病，如化學致癌、病毒感染和手術等。常用的疾病模型動物包括小鼠模型、大鼠模型、兔子模型、狗模型和猴子模型等，它們被廣泛應用于藥物研發、疾病機制研究和毒理學研究等領域[4]。證候動物模型是中醫特有的動物模型，是運用中醫病因病機理論，將“證”形成的內外因直接施加在動物身上所構建的動物模型。如外感六淫證候模型，可模擬高溫、低溫、高濕或低濕等不同飼養環境，閔莉等[5]采用高膽固醇致石飼料結合人工氣候箱模擬濕熱環境，制作小鼠膽固醇結石“濕熱證”模型。內傷七情證候模型，可給予一些應激性的刺激如驚嚇、禁食或觸怒等建立相應的七情內傷證候模型，趙海濱等[6]采用禁食禁水、夾尾、行為固定和電擊足底等方法制造大鼠“肝氣郁結”模型。飲食內傷模型，可給予一些特制的飲食如高脂高糖等建立飲食內傷模型，喻松仁等[7]采用高脂飲食喂養SD 大鼠8周，建立中醫肥胖“痰濕證”動物模型；王玲等[8]利用基因編輯CRISPR/Cas9 技術成功構建了Parkin 基因敲除小鼠，發現小鼠基因敲除之后表現出與“腎虛證”相符的一些特點，如生長發育遲緩、反應遲鈍、自主活動減少、精神倦怠和生育能力下降等，因此認為Parkin 基因敲除小鼠可作為一種理想的“腎虛證”動物模型。此外，中醫的“血瘀證”模型、“肝郁氣滯證”模型和“濕證”模型等運用非常廣泛。其中，“血瘀證”模型已非常成熟，已發展出寒凝血瘀、氣滯血瘀、痰濁血瘀等九種證型的造模方法[9]。通過中醫證候動物模型的研究，可以深入了解疾病的中醫病因病機，并制作出不同證型的實驗動物，篩選和驗證最合適的中藥處方，為中醫“辨證論治”提供進一步的參考和科學依據。

1.2 病證結合模型

中醫“病證結合”動物模型是指在中醫理論指導下，結合實驗動物學相關知識和現代醫學的發病機制，將疾病和中醫證型的構建方式先后或同時施加于動物身上，使動物模型同時具有疾病與證候特征，形成“疾病+證候”的動物模型，即病證結合模型[10]。開展中醫病證結合的動物模型研究，對闡釋中醫病因病機的科學內涵、深入研究中醫基礎理論有重要的學術價值和應用前景[11]。袁俊俊[12]依據“太陰濕土”理論，采用高糖高脂飲食喂養聯合來曲唑混懸液，制備“痰濕型”多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗大鼠模型；趙榮華等[13]采用HCoV-229E 病毒感染小鼠后再置于高濕低溫的環境中飼養，制作肺炎寒濕疫毒襲肺小鼠病證結合模型；陳雋等[14]在左冠狀動脈前降支起點下方結扎大鼠，配合力竭式游泳和禁食法，建立慢性心力衰竭“氣虛血瘀證”模型；孫曉霞等[15]根據“熱盛傷陰”的中醫理論，采用自發性糖尿病小鼠，給予灌胃“傷陰藥”中藥黑順片、肉桂和吳茱萸，建立糖尿病“陰虛證”病證結合小鼠模型；李鑫等[16]根據中醫“怒傷肝”理論，在采用四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的基礎上，加用慢性夾尾激怒大鼠的方式，制作肝纖維化大鼠“肝郁”病證結合模型。

1.3 中醫腫瘤證候實驗模型

中醫腫瘤證候模型，是在腫瘤動物模型的基礎上制作的一種“病證結合”動物模型。目前，腫瘤動物模型的構建主要有以下五種：自發性腫瘤模型、誘發性腫瘤模型、腫瘤細胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型和基因修飾模型等。中醫腫瘤證候動物模型是在中醫學整體觀念及辨證論治思想指導下，把腫瘤發病原型的某些特征在動物身上的一種復制，也是腫瘤患者中醫證候表現的模擬與再現[17]。氣虛肝癌模型是在肝癌動物模型的基礎上，采用控制飲食法、中藥瀉下法、疲勞力竭法和復合法同時構建氣虛證的造模方法。采用此方法，可以造成氣虛證肺癌模型[18]、氣虛證乳腺癌模型[19]等多種氣虛證腫瘤模型。張棟等[20]分別采用甲腺素合利血平制作小鼠“陰虛”動物模型、采用醋酸氫考制作小鼠“陽虛”模型、采用小鼠球后靜脈叢放血制作“血虛”模型后，再接種肝癌H22 細胞株，造成“陰虛”肝癌模型、“陽虛”肝癌模型和“血虛”肝癌模型。彭召云等[21]采用小鼠頸背部皮下注射鹽酸腎上腺素，同時用繃帶細條束縛小鼠四肢，并加籠外木棒敲擊等方式制作“氣滯血瘀”模型，然后在皮下接種肺癌Lewis 細胞株制作“氣滯血瘀”肺癌小鼠模型。左嬌嬌等[22]采用目前公認的胃癌前病變造模方法N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）五因素法，以模擬中醫病因中長期飲食偏嗜或飲食不潔損傷脾胃功能，并配合禁食等制作胃癌前病變“氣虛血瘀證”大鼠模型。

1.4 中醫腫瘤證候模型的現狀

當前，中醫腫瘤證候模型具有一定的不足之處。首先，造模時間長、干擾因素多。在模型制作過程中，腫瘤模型和證候模型往往需要先后進行，先成功制作成證候模型后，再進行腫瘤模型的制作，耗時較長。對證候模型如肝郁氣滯模型，需要對實驗動物進行禁食禁水、夾尾、行為固定和電擊足底等一系列操作[23]，后再進行腫瘤細胞的接種，這對實驗動物實施的干擾過多，使動物難以承受。其次，證候模型缺乏客觀化標準。雖然近來年對中醫證型的客觀化做了大量的研究，如基于胰腺癌的客觀指標與中醫證型相關性研究[24]、原發性肝癌的中醫辨證分型與血清腫瘤標志物水平的相關性[25]以及非小細胞肺癌中醫證型與腫瘤標志物相關性的研究[26]等。但對于證候模型制作的成功與否，仍然缺乏一套客觀化和標準化的指標。最后，受制于當前技術水平，證候模型仍然無法最大化模擬中醫病因和發病過程，比如中醫外感六淫中的“濕邪”，是高濕度、微生物和機體免疫功能和病理產物共同作用的結果，而現今的“濕證”動物模型主要采用濕度來模擬，無法最大化地復制濕邪的致病過程。

2 類器官在中醫腫瘤中的應用

2.1 類器官在中醫領域中的運用

類器官，顧名思義類似于組織器官，指的是由干細胞經體外3D 培養產生的“類似”器官樣、具有自我更新和組裝能力以及結構和功能與來源組織或器官高度相似的微型器官[27-28]。自2009年腸道類器官成功“問世”以來，類器官培養技術取得了長足的進步，且逐步發展為生物醫學中最具突破性的領域[29]。中醫藥以整體觀念、辨證論治指導臨床實踐，具有多途徑、多靶點、多通路的作用特點，依賴于傳統動物和細胞模型的基礎研究具有較大局限性，難以精準評價中醫藥治療作用，也缺少直觀動態揭示藥效作用機制的有效方法，使得藥物篩選、中藥安全性評價效率較低。類器官以客觀化、可視化、精準化為特點，應用干細胞技術，在體外構建類似體內的組織器官模型，不僅有效避免了動物模型物種間差異所造成的實驗結果偏差，同時彌補了細胞模型缺少整體性和異質性的不足，在模擬疾病發生發展、藥物有效性篩選及新藥研發[30]、器官移植和再生醫學等多個領域取得了突破[31]。李彥軍等[32]采用結直腸癌患者來源的腫瘤類器官，研究癌基因CUL4B 在調控直腸癌患者miRNAs 的作用；陳豪等[33]通過建立結直腸癌患者來源的類器官生物樣本庫，體內模型結直腸組織的生物學行為，為臨床前模型評估結直腸患者的化療效果，可預判結直腸患者化療效果，從而指導患者的化療方案。類器官平臺在各類腫瘤藥物的篩選中發揮了重要的作用。

中醫將每個病人視為不同的個體，每個個體的異質性決定了每個腫瘤患者的癥狀體征完全不一樣，治法治則和遣方用藥也不一樣，這即是中醫“辨證論治”的治療原則。動物和細胞模型具有非常大的“同質性”，作為中醫的科學研究和臨床前研究的工具具有一定的局限性。類器官可由具體患者的自身的細胞培養而來，體現出患者的“異質性”，使得中醫學研究更加具有說服力，也使中醫藥的臨床前研究更加精確，從而提高中醫治療療效。在中醫的辨證論治臨床實踐中，由于患者的體質不同，同一種病可能采用不同的方劑，不同的病卻采用相同的方劑，即所謂“同病異治，異病同治”，是中醫個體化治療的體現。在臨床上，對于辨證存在模棱兩可或者治療后效果不佳的患者，在遵守相應法律法規條件下，可根據辨證后制定的處方，先進行類器官藥物敏感性檢測，綜合判斷中醫處方的優劣，進一步修正臨床治療方案以提高中醫臨床治療腫瘤的療效[34]。

2.2 類器官在中醫腫瘤中的運用

在臨床實踐用藥中，為了更好地消除腫瘤，大部分患者接受聯合用藥治療或中西醫結合治療。韓毅[35]認為，體外培養的腫瘤類器官具有很好地模型腫瘤組織的體外生長，最關鍵的是和患者具有同樣的遺傳背景和結構，并且在一定程度上保留了來自患者的生物學信息和相同的藥物反應。腫瘤類器官藥物敏感性檢測類似體外培養細胞系的藥物敏感性檢測，既可以進行單純的化療藥物篩選，也可以對藥物組合如化療藥物聯合中醫藥進行篩選，并從中找到最佳的治療方案，極大地擴展了藥效研究和安全性研究[36-37]。

基于中藥抗腫瘤作用通過多組分、多靶標和多途徑的特點，對中藥的有效成分物質篩選及中藥安全性評價研究，現有動物模型和細胞系并不能準確預測中藥在人體的不良反應，使得進行中藥研究所投入的時間和精力遠超于化學藥物研究。且二維細胞培養缺乏細胞和胞外基質的相互作用，細胞在缺少一個整體相互作用的情況下，與實際中人體內的藥物反應和表達相差甚遠，因此研究模式體系的選擇也成為中藥新藥研發中的弊端，而類器官的無疑為標準化藥物篩選和安全性評價提供了新的思路[38]。王璐等[39]通過收集結直腸癌患者腫瘤組織樣本，并以正常癌旁組織樣本為對照，構建了結直腸癌類器官模型和正常組織類器官模型，并通過此模型，評價幾種有毒中藥單體成分如雷公藤甲素、斑蝥素和蟾毒靈對結直腸癌類器官活性的影響，并在正常組織類器官中測試其毒性，為有毒中藥在結直腸癌患者中用藥的有效性和安全性提供臨床參考；朱方圓等[40]將8 周齡C57 小鼠胃幽門部分離之后，體外培養成胃類器官，72 小時后體外出芽形成胃類器官，并采用南蛇藤提取物對胃類器官進行干預觀察其生長和形成情況。此外，類器官芯片等新型的體外研究模型已經用于中藥等天然藥物的毒性評價[41-42]。

3 腫瘤細胞模型在中醫腫瘤學中的研究

腫瘤細胞系是經首次傳代成功后的腫瘤細胞，具有連續傳代的“永生化”特征。腫瘤細胞系在形態學、遺傳學和生物化學上都保持著腫瘤細胞的原有特征，可以用來研究腫瘤的生長分化規律、腫瘤細胞的代謝和腫瘤藥物的作用機制。目前，大多數腫瘤都有相應的腫瘤細胞系模型，如小鼠肝癌細胞系、人肝癌細胞系、人肺癌細胞系、小鼠乳腺癌細胞系、人胰腺癌細胞系和人白血病細胞系等。腫瘤細胞模型是研究中醫復方、單味藥和單體抗腫瘤作用的重要研究手段。中醫利用腫瘤細胞模型進行實驗研究，一般是采用中藥復方或主要有效成分直接或間接作用于細胞模型。直接作用于細胞模型的研究方法主要是采用中藥或復方水煎劑、膏劑、中藥凍干粉和中藥單體等，間接作用是采用中藥復方的大鼠含藥血清。

3.1 中藥復方水煎劑或膏劑作用于腫瘤細胞模型

早期中醫腫瘤細胞研究主要采用水煎劑直接作用于腫瘤細胞并沿用至今，如劉金虎等[43]采用中藥全蝎、白術、白頭翁組合品發酵前后水提液，截留不同分子量段的活性成分，觀察其于乳腺癌細胞株MCF-7 細胞的抑制作用；黃松麗等[44]采用牽正散合大補陰丸水煎劑作用于大鼠嗜鉻瘤細胞PC12 細胞，觀察其增殖和凋亡的影響；張秋艷等[45]采用黃芪注射液合天花粉水煎劑對小鼠惡性黑色素瘤B16細胞增殖、遷移的作用，以及對遷移相關蛋白表達的影響；張天怡等[46]采用槐耳清膏作用于人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 和MDAMB-453 細胞，觀察其對腫瘤增殖和遷移的作用和機制。

3.2 中藥復方凍干粉作用于腫瘤細胞模型

中藥凍干粉是將中藥提取液中的有效成分凍干而形成的粉末制劑，它是一種穩定劑的干燥制劑，能夠保持中藥的天然活性成分不被破壞，并具有較高的生物利用度和穩定性。李永盛等[47]采用中藥槐耳有效部位凍干粉，作用于結腸癌HCT-116 細胞株，觀察細胞遷移和侵襲作用；王雪純等[48]采用中藥落地生根凍干粉，作用于人肝癌細胞株HepG2 細胞，觀察凍干粉對人肝癌細胞的增殖和凋亡影響；呂鵬等[49]采用龍貝逍遙散凍干粉，觀察其于通過調節細胞自噬功能增強對乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/ADR 細胞的增殖、遷移抑制作用；文秀華等[50]采用補肺湯凍干粉作用于人非小細胞肺癌細胞A549 細胞，觀察其對肺癌細胞的抑制作用和相關機制。

3.3 中藥含藥血清作用于腫瘤細胞模型

中藥含藥血清是指用于中藥制劑給予動物灌胃后，經動物體內的吸收后進入血液循環，并在一定時間內采取血液，分離所得血清，血清內含有一定量的藥物有效成分和代謝產物。中藥含藥血清作用于中醫腫瘤細胞模型是目前較為常用的中醫腫瘤體外研究方法。羅燕等[51]采用肝喜合劑含藥血清作用于人肝癌細胞株HepG2 細胞，觀察肝癌細胞的增殖作用；于丹等[52]采用補中益氣湯含藥血清，觀察其對被轉化生長因子TGF-β1 介導的DDP 細胞（人非小細胞肺癌細胞順鉑耐藥株）間充質轉化的作用；魏征等[53]采用化瘀解毒方含藥血清，作用于人肺部細胞A549 細胞，觀察其對肺癌細胞的凋亡作用和機制。鄭蓮等[54]采用半夏瀉心湯含藥血清，作用于幽門螺桿菌感染的人胃黏膜上皮細胞GES-1 細胞，觀察其對胃癌細胞的凋亡作用及對凋亡蛋白表達的影響。

3.4 中藥單體和有效成分作用于腫瘤細胞模型

中藥單體是指中藥中的活性成分，為具有特定化學式的化合物。研究中藥單體抗腫瘤作用，對于篩選更有效的抗腫瘤藥物、提高藥物療效、降低毒副作用和促進中藥現代化具有重要的意義。目前，中藥單體抗腫瘤的篩選和藥效研究，已經成為中醫藥體外細胞研究的主流。周珊珊等[55]采用決明蒽醌、木犀草素和去氧紫草素三種中藥單體，分別作用于人非小細胞肺癌A549 和NCIH460 細胞，觀察三種中藥單體對于肺癌細胞株的存活率和毒性。楊晶瑩等[56]采用靈芝主要成分靈芝菌絲多糖，分別作用于人口腔鱗癌細系HSC-3、人肺癌細胞系A549和人肝癌轉移癌細胞系HCCLM細胞，觀察其于三種不同類細胞系的體外抗腫瘤活性；陳良等[57]對中藥分心木的16 種有效成份進行抗黑色素瘤Hela細胞活性篩選，篩選出胡桃寧B等兩種具有抗腫瘤活性的中藥單體；龍國清等[58]從中藥苦參中篩選出11 個中藥單體化合物，觀察其對人乳腺鱗狀癌HCC1806 細胞、人乳腺癌MCF-7細胞和肺癌H1299細胞等6種腫瘤細胞系的體外抑制活性，篩選出苦參酮、胡椒酸等多種具有抗腫瘤活性的中藥單體；周夢楠等[59]通過從中藥玄參分離出23 個中藥單體化合物，觀察中藥單體體外抗肝癌HepG2 細胞、肺癌A549 細胞和結腸癌4T1 細胞的抗腫瘤活性，篩選出反式-咖啡酸甲酯等兩種具有抗腫瘤活性的中藥單體。

4 當前研究現狀的不足與展望

“證候”是中醫辨證論治的主要依據，而“證候動物模型”是中醫特有的動物模型。當前，諸如“血瘀證”“肝郁氣滯證”和“濕證”等證候動物模型在中醫研究中已受到廣泛的運用。對于中醫證候動物模型的驗證，陳小野等[60]學者很早就提出，應該從癥狀、病因和治療等方面進行。中醫的腫瘤證候模型是在證候模型的基礎上，進一步制作腫瘤模型，為典型的“病證結合”動物模型。中醫腫瘤證候模型，對于腫瘤的證候形成機理、方藥驗證和安全性評價具有重要的意義。由于證候的復雜性和客觀化原因，中醫腫瘤的證候動物模型，對于模擬中醫腫瘤的發病病因、病機和不同證型的特點，仍然有很大的不足，中醫腫瘤證候模型需要在中醫證候因素不斷標準化的基礎上，繼續深入研究和改進。

類器官平臺是在實驗動物和細胞實驗的一種延伸，可以模擬人體器官的形態結構和生物學功能，同樣可以在中醫腫瘤證候研究中發揮重要作用。類器官可用以研究中醫證候的特征和機制，從而為中醫的“辨證論治”提供科學的依據。此外，類器官還可以用于中藥有效組分或方劑的篩選、藥效學研究和安全性評價。通過直接從患者腫瘤細胞構建的類器官，可以更加準確地模擬人體內的腫瘤生長和發展，并為中藥的選方和辨證論治提供更加客觀的依據。然而，類器官平臺模擬的僅僅是人體腫瘤或器官在體外的一種形態結構和某些生物學功能，無法代表人體的整體，而腫瘤的中醫證候是腫瘤發展到某個階段病因、病位、病勢、邪正關系等一系列病理變化的總稱，是在中醫“整體觀念”指導下的一種概括，兩者在本質上存在差異。對于中藥改善免疫功能的研究，單獨的類器官構建無法模擬機體的免疫反應，必須借助于類器官共培養技術[61]，限制了類器官在中醫科研中的運用。類器官及器官芯片模式體系建立和相關平臺的出現，為我們從整體評價中醫藥的科學性提供了可能，也是對動物和細胞實驗的一種補充和延伸。