擬穴青蟹對急性低鹽脅迫的神經內分泌-免疫響應

張 巖,吳翔宇,陳欽勝,唐賢明,趙 群*,李二超*

(1.海南大學海洋學院,海南 ?？?570228;2.海南省熱帶海水養殖技術重點實驗室,海南省海洋與漁業科學院,海南 ?？?571126)

引 言

鹽度是影響甲殼動物生理代謝的重要環境因子,如滲透調節、免疫防御、呼吸代謝等生理功能,直接影響著甲殼動物的生長發育[1-3]。近年來,由于陰天暴雨和大量換水引起養殖水體鹽度的突變,已經成為甲殼動物病害大規模爆發的重要誘因之一[4]。因此,查明甲殼動物在鹽度脅迫下的神經內分泌-免疫調控機制成為國內外研究的重要課題。研究發現,當感受到鹽度變化后,甲殼動物神經內分泌系統會分泌調控因子(如激素和生物胺等),運輸到鰓中參與滲透調節,由此引起的機體代謝紊亂和能量消耗會造成甲殼動物免疫機能下降,極易促使病害暴發甚至大量死亡[5-7]。另有研究表明,當鹽度發生改變時,甲殼動物血細胞數量、吞噬活力、酚氧化酶原活力、抗菌活力和細菌清除率均顯著降低,且對病原菌易感性提高,機體免疫受到顯著抑制[8]。這些研究在一定程度上揭示了甲殼動物在鹽度脅迫下神經內分泌系統或免疫系統的響應方式與效果,但大部分局限于單一系統層面,其背后的神經內分泌-免疫調控機制還遠未研究清楚。

擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我國重要的海洋經濟蟹類,具有較高的經濟價值,已成為我國東南沿海地區池塘養殖的重要種類,養殖周期集中于5—11月夏、秋季節。夏季驟然增多的降雨帶來鹽度的顯著下降,目前國內外關于低鹽對擬穴青蟹存活、生長[9-10]、滲透調節[11-12]和免疫防御[13-14]等方面的影響已有研究報道,但有關其神經內分泌-免疫調控機制的研究仍較少。因此,本文選取擬穴青蟹為研究對象,探討低鹽脅迫下神經內分泌因子與免疫防御指標之間的調控關系,研究結果將為甲殼動物神經內分泌-免疫網絡研究提供理論基礎,也為擬穴青蟹的健康養殖提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用的擬穴青蟹成蟹(105.0±2.5 g)購自海南省瓊海市水產市場,肢體完整,健康活潑,均處于蛻殼間期。實驗前將青蟹放入鹽度為15(原生水體鹽度)的水體中暫養10 d,溫度為(28±0.5)℃,每日早晚按蟹體重15%投喂新鮮的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum),日換水2次,換水量約為1/2。

1.2 實驗梯度設置

根據擬穴青蟹原生水體鹽度,實驗鹽度梯度設置為15(對照)和5。采用經曝氣的自來水調節水體鹽度,每個實驗梯度設3個平行組。實驗開始時將擬穴青蟹分別移至鹽度為15和5的水槽中,每個水槽隨機放入25只健康的擬穴青蟹。實驗期間的養殖管理與暫養期間完全相同。實驗取樣時間分別為0、6、12、24、48、96、192 h。

1.3 樣品制備

每個平行組中隨機選取3只擬穴青蟹,吸去體表水分。用無菌2 mL注射器從擬穴青蟹第二、三步足基關節軟膜處插入血竇抽取血淋巴,使血淋巴與抗凝劑1∶1混合,一部分用于立即測定血細胞數量和吞噬活性,另一部分經4 ℃,800 g離心10 min后,將所得上清液和血細胞分別存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.4 實驗指標的測定

1.4.1 激素含量

青蟹血細胞中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)和促腎上腺皮質激素(ACTH)含量采用ELISA酶聯免疫試劑盒(上海Lengton生物科學有限公司,中國)測定,實驗方法依據試劑盒使用說明。

1.4.2 生物胺含量

用熒光分光光度法測定血淋巴生物胺含量,并根據本實驗優化測定條件[9]。使用LS-55型熒光分光光度計(PerkineElmer,Waltham,馬里蘭州,美國)測定。

1.4.3 免疫防御指標

血細胞吞噬活率測定:將哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)接種于2116E液體培養基,置于27 ℃培養箱培養18～24 h,煮沸滅活后制成密度約為108cells/mL的菌懸液。將0.1 mL血細胞懸液和0.1 mL菌懸液放進無菌的塑料凹孔板,在37 ℃條件下孵育30 min,取約為50 μL的混合液制作涂片,干燥后按吉姆薩染液說明書操作染色。曬干后在Olympus光學顯微鏡(10×100油鏡)下觀察。

吞噬率(PR)=(吞噬弧菌血細胞數目/200個血細胞)×100%

酚氧化酶原(proPO)活力測定:參照Hernández-Lópe等[10]的方法測定,proPO活力單位定義為在實驗條件下每分鐘每毫克蛋白使OD490nm增加0.001為1個酶活力單位。

酚氧化酶(PO)活力測定:以L-DOPA為底物,參照Hernández-Lópe等[10]方法進行測定,PO一個酶活力單位定義為在實驗條件下每分鐘每毫升血淋巴OD490nm增加為0.001。

抗菌活力(Ua)和溶菌活力(UL)測定采用Hultmark等[11]改進的方法。分別使用哈維氏弧菌和溶壁微球菌,用0.1mol/L,pH=6.4的磷酸鉀鹽緩沖液將菌粉配成一定濃度的懸濁液(O.D.570 nm=0.3-0.5),置于冰浴中,加入50 μL待測血漿,于570 nm波長處測A0值,然后在37℃水浴中孵育30 min后置于冰浴中10 min使其終止反應,測其A值?？咕盍腿芫盍Π聪率接嬎?

1) 系統定時讀入由生產設備或模型生成的在線數據，此時判斷數據是否采集完畢，即是否已完成了一個批次的生產。若一個批次的檢測已完成未發生故障，將測試數據處理后加入正?？贵w庫更新；將計算在線數據與正?？贵w庫中的抗體差異度，根據計算結果判斷是否發生了故障: 如果沒發生故障，繼續讀取數據進行檢測；如果差異度超出了預定的差異度閾值，則認為對應過程發生了故障，轉入故障類別的診斷。

凝集活性測定:將小鼠血制成2%紅細胞懸浮液,參照戴聰杰等[12]的方法,在96孔V型微量血凝板每孔加入25μL TBS-Ca2+溶液,在第一孔中加入25μL血漿,混勻后吸取25μL第一孔中混合液加入第二孔,以此類推倍比稀釋,然后在每孔中加入25μL小鼠血細胞懸液,室溫孵育1～2h,觀察紅細胞的凝集狀態,檢測凝集活性。以能產生凝集的最大稀釋度的倒數作為C-型凝集素的效價。

1.4.4 免疫關鍵基因表達

提取血細胞總RNA,使用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,操作按試劑盒說明書進行。使用Primier5軟件設計引物。引物合成由廣州天一輝遠基因科技有限公司完成,引物設計結果見表1;qRT-PCR使用ChamQTM Universal SYBR?qPCR Master Mix,操作按照試劑盒說明書進行。每個樣品與內參基因(β-actin)跑三個平行后進行分析,相對表達值(R)的按以下公式進行計算:ratio=(E目的基因)△CP目的基因(對照組-處理組)/(E內參基因)△CP內參基因(對照組-處理組)[13]。PCR擴增效率(E)通過跑標準曲線得到,將cDNA模板呈10倍比稀釋(100×、101×、102×、103×、104×),E=10[-1/斜率][14]。

表2 低鹽脅迫對擬穴青蟹凝集活性的影響

1.5 數據處理與分析

所有實驗數據都用3個平行組數據的平均值±標準誤差(Mean±SE)表示;并采用T-檢驗進行統計分析,Excel進行柱狀圖表繪制。

2 結果

2.1 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹神經內分泌因子的影響

2.1.1 激素含量

由圖1可以看出,各處理組血淋巴CRH和ACTH濃度均在0～48 h內呈峰值的變化,在12 h達到最大值(P<0.05),分別于48 h及24 h后恢復至對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖1 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹激素含量的影響(A:CRH; B:ACTH)

2.1.2 生物胺含量

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖2 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹生物胺含量的影響(A: DA; B: NE; C: 5-HT)

2.2 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血細胞數量的影響

由圖3可見,處理組血細胞數量在0-192 h內呈峰值變化,12 h達到最小值(P<0.05),隨后略有回升,但仍顯著低于對照組水平(P<0.05)。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖3 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血細胞數量的影響Fig.3 Effects of acute low salinity stress on total hemocyte count of Scylla paramamosain

2.3 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹酚氧化酶系統的影響

圖4表明,鹽度脅迫對擬穴青蟹血細胞酚氧化酶原激活因子(PPAF)和proPO基因表達量及proPO和PO活性均具有顯著影響,處理組中PPAF、proPO基因表達及proPO活性均在0-48 h內呈峰值變化,12 h至最小值,48 h時逐漸恢復至對照組水平;PO活性則逐步上升,12 h升至最大值且與對照組呈顯著差異(P<0.05),后隨時間變化下降,48 h基本恢復至對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖4 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹酚氧化酶原激活系統的影響(A:PAFF基因表達量;B:proPO基因表達量;C:proPO活性;D:PO活性)

2.4 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹表觀免疫指標的影響

由圖5可知,各處理組青蟹血細胞吞噬率在實驗時間內呈峰值變化,至12 h達到最小值(P<0.05),48 h后恢復至對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖5 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血細胞吞噬率的影響

圖6表明,鹽度脅迫下,對擬穴額青蟹血細胞類甲殼肽(crustin-like)基因表達量和血漿的抗菌活性均在0～96 h內呈峰值變化,至12 h達到最小值(P<0.05),48 h恢復至對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖6 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血細胞類甲殼肽基因表達量及血漿溶菌的影響(A:血細胞crustin-like基因表達量;B:血漿抗菌活性)

圖7表明,鹽度脅迫對擬穴青蟹血漿溶菌活性有顯著影響(P<0.05),處理組活性在0～96 h內呈峰值變化,至12 h達到最小值,96 h恢復對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖7 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血漿溶菌活性的影響Fig.7 Effects of acute low salinity on serum bacteriolytic activity of Scylla paramamosain

由圖8可知,鹽度脅迫下青蟹血細胞C-型凝集素(C-type lectin)基因表達和血漿凝集活性均在0～48 h內呈峰值變化,12 h達至最小值(P<0.05),48 h時逐漸恢復至對照組水平。

注:*表示與同一時間點對照組有顯著性差異(P<0.05)圖8 急性低鹽脅迫對擬穴青蟹血細胞C-type lectin基因表達的影響

3 討論

3.1 低鹽脅迫對擬穴青蟹神經內分泌的影響

下丘腦-垂體-腎間組織軸(Hypothalamic-pituitary-interrenal axis,HPI)是魚類神經內分泌反應典型的應激軸[15]。神經系統感受器感知應激后,首先將應激刺激傳遞至神經內分泌系統,下丘腦立即分泌CRH,隨后導致ACTH釋放,并使神經元釋放生物胺[16]。有研究表明虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)在鹽度脅迫下的CRH和ACTH基因表達水平顯著升高;在注射水通道蛋白3(rAQP3)后,虹鱒魚能夠在適應環境鹽分變化的過程中通過與CRH和ACTH相互作用來調節鹽分的適應性[17]。在甲殼動物中,雖然沒有HPI調節結構,但其X器官-竇腺復合體擁有類似的神經內分泌功能,通過分泌生物胺等神經遞質調節機體免疫反應,可被視為甲殼動物在環境脅迫下的神經內分泌-免疫調控中樞。Wang等[18]發現,鹽度變化后24 h,三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)血淋巴中的DA和5-HT濃度達到峰值。另有研究發現,低鹽脅迫下,凡納濱對蝦(LitopenaeusVannamei)血淋巴中NE的濃度在12 h時顯著增加至最高水平[5]。在本研究中,擬穴青蟹的CRH和ACTH濃度在12 h內顯著增加,并在48 h后恢復至對照水平;DA和NE濃度在6 h時顯著升高并且在12 h時升高至最高水平;5-HT濃度的變化在6 h時呈升高趨勢,在12 h時顯著升高至最高水平,隨后逐漸下降并在48 h后恢復至對照組水平。本研究結果與上述研究結果基本一致,由此可以推測,在低鹽脅迫下,激素CRH和ACTH首先被分泌到循環系統中,并隨后誘導生物胺的釋放,以此作為對低鹽脅迫的應激反應。此外,我們發現三種生物胺含量數量級不同,5-HT的含量遠低于DA和NE,Zhao等[5]報道了類似的結果。研究表明,在鹽度變化下,甲殼類動物需要消耗額外的能量進行滲透調節和維持體內的離子穩態,而5-HT相比于其他生物胺能夠有效提升葡萄糖水平[19-20],但是相比于其他脅迫因素,5-HT對鹽度脅迫的響應并不強[21];同時有研究發現,凡納濱對蝦在鹽度脅迫下,DA可在短期調節機體離子穩態,而5-HT對鹽度適應有長期的調節作用[22]。因此我們推測5-HT的含量遠低于DA和NE是激素顯著刺激神經內分泌細胞在低鹽度下分泌生物胺,而DA,NE和5-HT在維持體內離子穩態和能量代謝中起不同的作用導致的,它們共同為機體免疫響應提供重要的物質和能量調控基礎。

3.2 低鹽脅迫對擬穴青蟹表觀免疫防御指標的影響

跟其他的無脊椎動物一樣,對蝦也缺少特異性免疫系統,只能依靠各種非特異性免疫反應,分為細胞免疫和體液免疫,其中血細胞既是體液免疫的提供者,也是細胞免疫的承擔者,在對蝦非特異性免疫反應中發揮著重要作用[23]。細胞免疫包括吞噬作用、包囊和結節作用[24]。一般而言,吞噬作用是通過識別外來目標顆粒并將其與被吞噬的細胞相結合,隨后通過細胞骨架修飾以及細胞內的囊泡運輸的方式使目標顆粒被吞噬和內化,最終導致顆粒被破壞后排出體外[25]。據Gopikrishna等[26]的報道,斑節對蝦(Penaeusmonodon)在鹽度下降時,其血細胞數量下降。Wang等[27]發現當凡納濱對蝦從鹽度25轉移到低鹽度水平時,其吞噬活性降低。在本研究中,低鹽脅迫下血細胞數量顯著下降并在12 h達到最低水平,然后趨于穩定,但仍顯著低于對照組水平。在5鹽度下,血細胞吞噬活性在12 h內顯著下降,并在48 h后恢復至對照組水平。上述所列舉的研究結果與本研究結果相似,表明環境鹽度可以影響血淋巴滲透調節,并誘導血細胞膜降解,從而導致血細胞數量下降,并抑制了其吞噬功能。

體液免疫包括存在于血淋巴中的免疫活性因子如模式識別蛋白、酚氧化酶原(proPO)激活系統、凝集素、抗菌肽、溶菌酶、蛋白酶抑制劑等參與和完成的免疫防御反應[28]。其中酚氧化酶原激活系統在甲殼動物的免疫系統中占據非常重要的地位,它是一個復雜的酶級聯系統,其中包括絲氨酸蛋白酶、proPO、酚氧化酶(PO)和其他的相關因子。酚氧化酶原激活因子(PPAF)是一種絲氨酸蛋白酶,可以活化proPO,使其轉變成為具有活性的PO,從促使黑色素形成,抵御病原體入侵[29]。有研究表明,細角濱對蝦(Litopenaeusstylirostris)在低溫或低氧條件下,血細胞數量降低,PO活性升高,這可能由于低氧降低了對proPO系統的抑制作用,導致PO活性進一步增強[30];此外,也有學者報道了三疣梭子蟹在低鹽度脅迫下proPO活性降低、PO活性升高的結果[18,31]。在本研究中,低鹽處理組中擬穴青蟹血細胞的proPO活性在12 h達到最低水平,而血漿PO活性在12 h達到峰值,然后在24～72 h后逐漸恢復至對照組水平,與以上研究結果相似。此外,低鹽脅迫6 h后,擬穴青蟹血細胞的proPO和PPAF基因表達量都顯著下調。結合我們血細胞數量指標可以推測,在低鹽脅迫下,一方面總血細胞數量降低直接導致血細胞破碎液中測得的PPAF和proPO基因的轉錄水平下降,另一方面由低鹽脅迫帶來的能量代謝紊亂可能也會間接導致免疫基因轉錄活性降低。同時,低鹽脅迫刺激原本存在于血細胞內的proPO被胞吐至血漿中并活化為PO,從而使PO含量升高。

除此之外,有學者研究發現,當鹽度迅速下降時,6 h內凡納濱對蝦crustin-like基因表達和抗菌活性顯著下降,同時C-type lectin基因表達量和血細胞凝集活性也顯著降低,隨著時間的推移最終恢復到對照組水平[5]。以上結果與我們的研究相似,在本研究中,在低鹽脅迫下,擬穴青蟹crustin-like抗菌肽基因表達和抗菌活性、溶菌活性在24 h內顯著下調,并逐漸恢復至對照組水平;同時發現,低鹽脅迫下擬穴青蟹血細胞C-type lectin基因表達和血漿凝集活性在6 h時顯著降低,然后逐漸恢復至對照組水平。據此我們推測,低鹽脅迫可能通過抑制擬穴青蟹的crustin-like基因和C-type lectin基因表達從而抑制其抗菌活性和凝集活性。綜合上述免疫防御指標變化,我們推測在低鹽度脅迫下,甲殼類動物的免疫機能受到顯著影響。

3.3 低鹽脅迫下擬穴青蟹神經內分泌對其免疫機制的影響

大量研究表明,應激導致的激素或生物胺含量變化可能是引起甲殼動物免疫抑制的重要原因[32-33],其中,CRH和ACTH在脊椎動物和無脊椎動物應激反應中扮演重要角色[34]。已經有研究通過免疫細胞化學和放射免疫分析法進行實驗,證實了在平角卷螺(Planorbariuscorneus)的免疫細胞(血細胞)中存在CRH和ACTH的免疫性反應[35];軟體動物中ACTH能夠對血細胞吞噬作用或細胞遷移產生影響從而調控機體免疫反應[36];另據報道,凡納濱對蝦在注射生物胺后顯示出短暫的免疫抑制作用,其中血細胞數量、吞噬活性、呼吸爆發、PO活性等顯著降低,對溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)的易感性暫時升高[37-38]。在本研究中,我們發現激素(CRH,ACTH)和生物胺(DA,NE)的濃度顯著增加,而免疫參數明顯降低,包括血細胞數量、吞噬活性、抗菌活性、溶菌活性、凝集活性和相關免疫基因表達;此外,除血細胞數量外,所有免疫參數隨著時間變化逐漸恢復至對照組水平。從而可以推測,在低鹽度脅迫下,擬穴青蟹的免疫功能受到神經內分泌反應調節而受到抑制,但是,這種免疫抑制作用是暫時的,通過一段時間的適應,甲殼動物免疫機能能夠逐漸恢復到正常水平。

綜上所述,結合本實驗神經內分泌指標與免疫防御指標,可以推測低鹽脅迫下,擬穴青蟹通過激素、生物胺等神經內分泌因子調控機體免疫響應,造成短時間內的免疫抑制,調控路徑為CRH→ACTH→生物胺→血細胞免疫響應。這在一定程度上可以解釋大規模換水或大雨引起的鹽度降低經常會導致甲殼動物養殖疾病暴發的原因,然而本實驗中涉及的相關免疫調控通路還有待進一步研究。