芍藥苷對UVB誘導的小鼠色素沉著的改善與調控機制研究

劉曉英，韓萍，太美靈，吳詩穎，杜志云

芍藥苷對UVB誘導的小鼠色素沉著的改善與調控機制研究

劉曉英1，韓萍2，太美靈1，吳詩穎2，杜志云3*

(1.無限極(中國)有限公司，廣東 江門 529000；2.佛山市康伲愛倫生物技術有限公司，廣東 佛山 528231；3.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006)

為探討芍藥苷對皮膚色素沉著的改善作用及調控機制，采用UVB反復誘導方法建立C57小鼠皮膚色素沉著模型，評價芍藥苷抑制皮膚色素沉著的作用及對酪氨酸酶(TYR)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、轉運蛋白RAB27A (RAB27A)、前阿黑皮素(POMC)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)、干細胞因子(SCF)、白介素–1α(IL–1α)的表達水平的調控作用，同時利用分子對接法分析芍藥苷與靶點之間的結合活性。結果表明：外用芍藥苷降低了UVB誘導的C57小鼠的經皮失水率，皮膚組織切片中的表皮厚度和黑色素含量顯著降低，皮膚組織中色素沉著相關的TYR、MITF、RAB27A蛋白的表達均極顯著降低(<0.01)，黑色素細胞受體結合的旁分泌因子POMC、SCF、FGF2和炎癥因子IL–1α的蛋白表達均極顯著降低(<0.01)；分子對接結果顯示，芍藥苷對角質細胞分泌的POMC和SCF有極高的結合活性(活性總分值>7)。表明芍藥苷可通過抑制旁分泌因子來抑制黑色素合成，發揮抑制皮膚色素沉著的作用。

芍藥苷；皮膚色素沉著；旁分泌因子；干細胞因子；前阿黑皮素

皮膚色素沉著是常見的色素異常的疾病，常見的病癥有黃褐斑、雀斑、老年斑等。研究[1]表明，日曬、遺傳、免疫及環境因素會誘發皮膚色素沉著，其中，紫外線輻射是導致皮膚色素沉著的主要因素。黑色素細胞保護皮膚細胞免受太陽輻射的損害，在此過程中，皮膚細胞角質形成細胞、成纖維細胞、內皮細胞通過分泌細胞因子，調節黑色素細胞的應激反應，維持皮膚機體的平衡。皮膚細胞的旁分泌網絡被破壞、黑色素合成異常以及黑色素細胞或基因組穩定性損害均會引起皮膚色素性疾病[2]。常見的皮膚細胞旁分泌因子有前阿黑皮素(POMC)、干細胞因子(SCF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)、內皮素1 (ET–1)和前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2)等[3–5]。目前，皮膚色素沉著的治療以激光治療手段為主，存在費用較高、易于復發等問題。外用治療制劑氫醌也存在安全隱患。近幾年，臨床上使用氨甲環酸治療黃褐斑具有一定的效果[6]。氨甲環酸可調控角質形成細胞的纖溶酶，抑制血管因子內皮生長因子和ET–1的表達，可以通過調控黑色素細胞相鄰的皮膚細胞的旁分泌因子的表達來影響黑色素的合成，可作為治療皮膚色素沉著的有效方法之一。

芍藥苷是中藥赤芍的主要成分之一，具有抗炎、降血糖、解痙、保護神經、免疫調節等多種藥理作用[7]，能抑制自身免疫性疾病，如關節炎、銀屑病和腦脊髓炎等[8]。相關研究發現，芍藥苷通過核因子紅細胞2相關因子2(Nrf2)的抗氧化通路抑制紫外線對成纖維細胞及小鼠皮膚的光損傷[9]，對紫外線致人永生化角質形成細胞(HaCaT)的凋亡也有保護作用[10]；臨床上，芍藥苷作為滋補肝腎藥方的主要成分，具有保護黑色素細胞避免氧化、損傷、凋亡的作用。有研究報道，芍藥苷可通過下調ET–1水平，調節血管平滑肌的張力，起到保護血管內皮的作用[11]；QIU等[12]發現芍藥苷具有去色素潛能，但是芍藥苷調控皮膚色素沉著的機制并不清楚。本研究采用UVB誘導方法建立小鼠皮膚色素沉著模型，研究芍藥苷對皮膚色素沉著的作用機制，同時利用分子對接對調控靶點進行預測分析，旨在為芍藥苷在臨床外科用藥、日常護理產品的應用提供數據支持。

1　材料與方法

1.1　試驗動物

8周齡的SPF級C57雌性小鼠，采購于廣東醫學院實驗動物中心(實驗動物使用許可證為SYXK(粵)2018–0186，實驗動物生產許可證為SCXX(粵)2018–002)。飼養溫度18～24 ℃，相對濕度為50%～70%，自由進食和飲水。

1.2　主要藥品、試劑及設備

TYR、MITF、RAB27A、FGF2、SCF、POMC、IL–1α試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司；BCA試劑盒、4%多聚甲醛固定液購自上海碧云天生物技術有限公司；芍藥苷(純度為98%)購自成都植標化純生物技術有限公司。

酶標儀(1510)，美國Thermo Fisher出品；電子顯微鏡(BX50型)，日本Olympus出品；離心機(Z326K)，德國Hermle出品；皮膚水分流失測試儀(TM300)，德國CK出品。

1.3　方法

1.3.1分組

將40只小鼠隨機分為5組，分別為空白組、模型組、陽性對照組(α–熊果苷組)、芍藥苷低劑量組和高劑量組。每組8只，

1.3.2給藥

參照文獻[13–14]的方法給藥。剃除小鼠背部位置(約為3 cm×3 cm)的毛發，顯露部分皮膚，用體積濃度為6%的硫化鈉涂抹，使絨毛充分脫掉。采用邊照射邊給藥的方式?？瞻捉M不做照射處理，模型組和處理組采用波長280～320 nm的UVB 照射燈管，距離背部15 cm，每次照射總量500 mJ/cm2，隔日1 次?？瞻捉M和模型組涂抹蒸餾水100 μL，陽性組涂抹100 μL質量濃度為3 mg/mL的α熊果苷，芍藥苷低劑量和高劑量組分別涂抹100 μL質量濃度分別為500、1000 μg/mL的芍藥苷。每天涂抹2次，涂抹30 d。

1.3.3小鼠經皮失水率的測定

每周記錄小鼠皮膚的狀態，采用皮膚測試儀隨機檢測小鼠背部受試區3處部位，記錄經皮失水率，每組結果取平均值。

1.3.4小鼠背部皮膚組織的染色檢測

試驗30 d終止后，采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，取受損的皮膚組織，用體積分數4%的多聚甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，切片后分別進行蘇木精–伊紅(HE)染色和Masson–Fontana銀染色，光學顯微鏡下觀察背部皮膚組織的病理變化，測量表皮層的厚度，計算表皮黑色素的積分光密度(IOD)。

1.3.5ELISA 法檢測皮損組織中的細胞因子水平

參照文獻[5, 15]的方法對小鼠背部皮膚的樣品進行處理，稱取各組凍存的小鼠背部受損的皮膚組織0.1 g，加入裂解液，制成勻漿，3000 r/ min離心15 min，吸取上清液，–20 ℃保存。采用BCA 法測定蛋白濃度；采用ELISA試劑盒的給定測試方法測定皮膚組織中的酪氨酸酶(TYR)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、轉運蛋白RAB27A (RAB27A) 、POMC、FGF2、SCF和白介素–1α(IL–1α)的含量。各組平行測試3次。

1.3.6分子對接

通過PubChem數據庫下載芍藥苷的2D分子結構，運用Chem3D軟件將該配體進行結合能結構優化，獲得最穩定的配體小分子的3D結構。

利用Uniport數據平臺，勾選Reviewed、Human篩選條件，進入目標基因靶點蛋白(靶點蛋白TYR、MITF、RAB27A、POMC、FGF2、SCF、IL–1α)詳情頁面，在Structure中優先選擇分辨率高且X–RAY分析、預覽中有配體分子的靶點蛋白受體，利用PDB數據庫下載受體文件。運用Sybyl 2.0軟件對靶點蛋白受體進行去水加氫處理，計算并生成靶點蛋白的活性口袋，導入活性成分芍藥苷的配體分子，進行靶點蛋白的分子對接?；钚钥偡种翟酱?，表明配體與蛋白靶點的結合能力越強，結合活性越高。利用Maestro 13.1軟件導出分子對接結果中的分子–蛋白相互作用關系，采用PyMOL、Discover Studio 4.5對結果進行可視化處理。

1.3.7數據統計與處理

采用Image–Pro Plus 6.0進行組織學測量；采用 SPSS 19.0進行數據處理。各組間進行單因素方差分析。

2　結果與分析

2.1　芍藥苷對皮膚色素沉著小鼠的經皮失水率和病理組織染色情況的影響

小鼠背部皮損部位的經皮失水率見表1。與空白組相比，模型組經皮失水率顯著升高；與模型組相比，α–熊果苷組和芍藥苷的高、低劑量組的經皮失水率顯著降低，其中芍藥苷高劑量組的經皮失水率最低，2個芍藥苷處理組的組間差異不顯著。模型組表皮層黑色素的IOD值顯著增加(<0.01)，表皮厚度顯著高于空白對照組(<0.01)。與模型組相比，處理組表皮層的厚度和表皮層黑色素的IOD值均極顯著降低，其中芍藥苷高、低劑量組2個組間的差異不明顯。

表1　小鼠皮膚的經皮失水率、表皮層厚度和黑色素積分光密度

“##”示模型組與空白組的差異有統計學意義(<0.01)； “**”示處理組與模型組的差異有統計學意義(<0.01)。

從圖1可以看出，空白組(圖1–a)小鼠的背部皮膚組織無明顯改變，皮膚各層結構完整，真皮與表皮分界清楚，表皮層沒有黑色素顆粒的分布，僅在毛囊的部位有黑色素顆粒分布。模型組(圖1–b)背部皮膚可見嚴重的角化過度及角化不全現象，棘層明顯肥厚，黑色素顆粒除了在毛囊處分布外，在表皮層的各層均有分布，主要分布在基底層及附近區域，符合UVB照射后皮膚色素沉著的組織病理的表征。相對于模型組，α–熊果苷組和芍藥苷高、低劑量組的黑色素的分泌減少，表皮角化過度的現象減輕(圖1–c、圖1–d、圖1–e)。

a　空白組；b　模型組；c　α–熊果苷組；d　芍藥苷低劑量組；e　芍藥苷高劑量組。

2.2　芍藥苷對色素沉著調控因子的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組的黑色素合成相關靶點TYR、MITF和黑色素轉運蛋白RAB27A的含量均顯著提升；與模型組相比，芍藥苷高、低劑量組的含量均極顯著降低(<0.01)，說明芍藥苷對皮膚黑色素的合成和轉運有抑制作用。

表2　各組小鼠皮膚組織中TYR、MITF和RAB27A的含量

“#” “##”分別示模型組與空白組的差異有統計學意義(<0.05，<0.01)；“*” “**”分別示處理組與模型組的差異有統計學意義(<0.05，<0.01)。

由表3可知，與空白組相比，模型組中的皮膚細胞旁分泌因子POMC、SCF和炎癥因子IL–1α的表達顯著提升；與模型組相比，芍藥苷低劑量組極顯著降低了小鼠皮膚中旁分泌因子POMC、FGF2、SCF和IL–1α的水平，芍藥苷高劑量組顯著降低了小鼠皮膚中旁分泌因子POMC、FGF2、SCF的水平，極顯著降低了炎癥因子IL–1α的表達水平，說明芍藥苷可能參與細胞的旁分泌和免疫調控，抑制皮膚色素沉著。

表3　各組小鼠皮膚組織中POMC、FGF2、SCF 和IL–1α的含量

“##”示模型組與空白組的差異有統計學意義(<0.01)；“*” “**”分別示處理組與模型組的差異有統計學意義(<0.05，<0.01)。

2.3　芍藥苷與黑色素合成靶點的結合度分析

采用分子對接分析芍藥苷與黑色素合成靶點的結合度。從表4可知，芍藥苷與POMC和SCF蛋白的結合活性較高，活性總分值分別為9.19和8.85，表明芍藥苷對角質形成細胞的旁分泌因子POMC和SCF具有較強的結合作用。其中芍藥苷能穩定對接到POMC的蛋白結構，通過氨基酸殘基LYSB:80、LYSA:429、LYSA:457產生H鍵作用(圖2–a)。同時芍藥苷能夠對接SCF的蛋白結構，通過氨基酸殘基LYSA:136、GLYA:60、GLNA:140、ASPD:766、GLYB:152產生H鍵作用(圖2–b)。

表4　關鍵成分與核心靶點分子對接結合活性

活性總分值≥7代表具有極高的結合活性。

圖2　芍藥苷與POMC、SCF分子對接結果

3　結論與討論

色素沉著是色素代謝異常的一種頑固性皮膚病，其發病機制復雜多樣[1]。在多種外界環境因素和生理因素，如紫外線輻射、炎癥反應、皮膚老化的影響下，細胞會產生自分泌和旁分泌激素或細胞因子，局部形成自分泌、旁分泌網絡，起到調節皮膚色素沉著的作用。UVB照射后會引起角質形成細胞的DNA損傷，介導POMC表達，促進α–黑色素細胞刺激激素(a–MSH)的釋放，進而與黑色素皮質激素受體 1(MC–1R)結合，調控MITF的轉錄，導致黑色素的異常合成[2]。角質形成細胞分泌的SCF與黑色素細胞表面的 C–KIT 受體結合后，激活MAPK 通路，刺激MITF的表達，促進黑色素的合成[16]。研究[17]發現，黃褐斑、日光性雀斑樣痣和雀斑中均有SCF的陽性表達，且在皮損區的表達強度明顯高于非皮損區。IL–1α的增加可以間接刺激角質形成細胞中ET–1的產生[18]。角質形成細胞分泌的FGF2可通過信號轉導轉錄激活因子3調節黑色素細胞的活力，有助于調節黑色素細胞的數量和黑色素水平[19]。以上研究表明，皮膚細胞的旁分泌因子POMC、SCF、ET–1、FGF2可通過黑色素細胞相關受體對黑色素的合成、轉運和黑色素細胞的活性進行調控，影響皮膚的色素沉著。

本研究中，分子對接的結果顯示芍藥苷對POMC和SCF具有較強的結合性，說明芍藥苷可能是通過結合POMC，減少了a–MSH的釋放，抑制了MITF的轉錄，同時芍藥苷通過與SCF作用，調控cAMP通路，抑制MITF的表達，起到調節皮膚色素沉著的作用。本研究結果還顯示，芍藥苷高、低劑量組均顯著抑制UVB誘導的色素沉著小鼠皮膚中黑色素的沉積；對調控因子的研究發現，芍藥苷可調控旁分泌因子POMC、SCF、FGF2和IL–1α的表達，并抑制黑色素合成相關靶點TYR和MITF的表達。

皮膚色素沉著的形成機制復雜，皮膚角質形成細胞與黑色素細胞接觸，參與黑色素的合成和轉運，通過分泌細胞因子等參與黑色素調控。傳統抑制黑色素細胞活性或單純抑制酪氨酸酶的方式，往往會引起皮膚干燥、敏感等。本研究結果顯示，芍藥苷參與調控黑色素細胞受體結合的旁分泌因子，抑制了黑色素合成，從而減緩小鼠背部皮膚色素沉著，說明芍藥苷可望用于配制治療和改善皮膚色素沉著的配方和制劑。

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Enhancement and regulatory mechanism of paeoniflorin on UVB-induced pigmentation mice

LIU Xiaoying1，HAN Ping2，TAI Meiling1，WU Shiying2，DU Zhiyun3*

(1.In?nitus (China) Company Ltd, Jiangmen, Guangdong 529000, China; 2.Allan Conney Biotechnology Company Ltd, Foshan, Guangdong 528231, China; 3.School of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Guangdong University of Technology, Guangzhou, Guangdong 510006, China)

This study aimed to investigate the enhancement effect of paeoniflorin on skin pigmentation and its potential mechanism through molecular docking and UVB-induced animal models. A UVB-induced pigmentation model was established in C57 mice using repeated UVB exposure. Throughout the experiment, the expression level of TYR, MITF, RAB27A, POMC, FGF2, SCF, IL-1α in the skin lesions were determined. The molecular docking software Sybyl-x2.0 was used to analyze the total score binding activity of paeoniflorin to the pigmentation regulatory targets. The findings indicated that topical application of paeoniflorin effectively mitigated UVB-induced skin pigmentation symptoms in mice, leading to reduce transdermal water loss rate, the epidermal layer thickness and melanin content. The paeoniflorin group significantly reduced expression levels of key targets in melanin synthesis and transport pathways TYR, MITF and RAB27A(0.01). At the same time, the protein expressions of paracrine factor POMC, FGF2, SCF and inflammatory factor IL-1α(<0.01) were significantly decreased. Molecular docking results showed that paeoniflorin had extremely high binding activity to POMC and SCF secreted by keratinocytes(Total score>7). Theoutcomes demonstrated that paeoniflorin significantly inhibit UVB-induced skin pigmentation, potentially through suppression of paracrine factors’ expression in keratinocytes, thereby inhibiting melanin synthesis.

paeoniflorin; skin pigmentation; paracrine; stem cell factor; pro-opiomelanocortin

R285.5

A

1007–1032(2023)04–0479–07

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.016

2022–09–23

2023–07–27

廣東省重點領域研發計劃項目(2022B1111080003)

劉曉英(1977—)，女，廣東廣州人，碩士，主要從事活性物護膚應用研究，Cindy.Liu@infinitus-int.com；*通信作者，杜志云，博士，教授，主要從事藥食同源物活性成分調控機制研究，892008284@qq.com

劉曉英，韓萍，太美靈，吳詩穎，杜志云．芍藥苷對UVB誘導的小鼠色素沉著的改善與調控機制研究[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：479–485．

LIU X Y，HAN P，TAI M L，WU S Y，DU Z Y．Enhancement and regulatory mechanism of paeoniflorin on UVB-induced pigmentation mice[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：479–485．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正