基于Cyt b序列分析黃沙鱉和日本鱉及其雜交子一代的遺傳多樣性

肖何威，胡亞洲，秦溱，徐大建，梁藝馨，劉小燕，王曉清

基于序列分析黃沙鱉和日本鱉及其雜交子一代的遺傳多樣性

肖何威，胡亞洲，秦溱，徐大建，梁藝馨，劉小燕，王曉清*

(湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

為了解中華鱉()中黃沙鱉和日本鱉及其雜交子一代的遺傳特性，分別對它們的線粒體基因測序，并進行遺傳多樣性分析。結果表明：PCR擴增測序黃沙鱉和日本鱉及其雜交子一代3個群體共獲得90條序列，18種單倍型；90個個體的基因堿基A、T、C、G平均含量分別為35.4%、26.0%、27.9%、10.7%，表現出明顯的反G偏倚；日本鱉、黃沙鱉和雜交鱉分別有5、6、10種單倍型，日本鱉與雜交子代有共享的單倍型Hap 8、Hap 9和Hap 16；3個群體的變異主要存在于群體內部，變異比例為60.8%；3個群體的單倍型多樣性為0.747～0.867，平均核苷酸差異數為12.922～16.262，核苷酸多樣性為0.009 13～0.011 51；雜交子一代的單倍型數、單倍型多樣性、平均核苷酸差異數、核苷酸多樣性均最高，日本鱉的均最低，黃沙鱉、雜交子一代、日本鱉的多態位點數依次降低?？梢?，雜交子代遺傳多樣性較高，雜交可提高中華鱉的遺傳多樣性。

黃沙鱉；日本鱉；基因；遺傳多樣性；單倍型；多態位點

中華鱉隸屬爬行綱龜鱉目鱉科，是中國的特色水產養殖品種。由于中華鱉分布廣泛，雖無亞種分類，但也形成了各具地理特色的種群[1]。根據水域的不同，大致可將中國養殖的中華鱉分成北方品系、黃河品系、西南品系、洞庭湖品系、鄱陽湖品系、太湖品系、臺灣品系、日本品系[2–3]。隨著養殖業的迅速發展，養殖戶開始進行不同品系間的雜交[4]。廣西種(西南品系)中華鱉被稱為黃沙鱉，抗性強，但產蛋率較低，生長較慢[5–6]。日本鱉是從日本引進并經過5代選育獲得的，具有生長速度快、產蛋率高等特點，但其抗逆性較弱，口感較差[7]。目前，生產上養殖較多的雜交鱉為黃沙鱉(♂)與日本鱉(♀)的雜交一代，其具有日本鱉生長快和黃沙鱉抗病能力強的特點，同時口感比日本鱉的更好。線粒體DNA呈環狀，具有母系遺傳、幾乎不發生重組、進化速度快等特點[8–9]，在生物的群體遺傳多樣性及系統發育研究上應用廣泛，是理想的遺傳分子標記，已廣泛應用于水生生物種群親緣關系研究[10]。中華鱉線粒體長約17 364 bp，包括37個基因，編碼13個蛋白[11]，其中細胞色素b基因()進化速度適中，其變異程度足以說明種間的系統發育關系，同時其具有保守性，適用于一些親緣關系較近群體的遺傳結構研究[12]。筆者基于中華鱉線粒體DNA的序列對黃沙鱉、日本鱉及其雜交子代進行研究分析，了解該雜交種的遺傳特性，旨在為中華鱉的種質保護及將來的雜交育種提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料

供試中華鱉均為稚鱉，黃沙鱉(HS)購自廣西平南縣金田鎮匯源龜鱉養殖場，日本鱉(RB)和雜交鱉(HR)購自江西南豐縣鑫壯漁業服務部。3個群體各30只，取其裙邊組織，保存于無水乙醇中，于–20 ℃冰箱保存，備用。

1.2　方法

采用全式金DNA提取試劑盒提取中華鱉的裙邊DNA，利用中華鱉線粒體通用引物Cyt b–R (ATTCCGGTTTTGGGGATCGG)和Cyt b–F(GTCA ACGCCACAGAATAAGC)[13]對所提DNA進行PCR擴增。反應體系25 μL：包括上游、下游引物各1 μL；DNA模板1 μL；MagicMix3.0為12.5 μL；滅菌水9.5 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，54.9 ℃退火150 s，72 ℃延伸5 min，運行34個循環；最后72 ℃下延伸10 min。擴增后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察到清晰的目的條帶后送北京擎科生物科技股份有限公司進行PCR產物雙向測序。

1.3　數據分析

將所得的DNA測序結果進行正反鏈校正，引物剪切后用Clustal W和Chromas比對和分析。運用Dnasp 5.0統計樣本的單倍型數()、單倍型多樣性(d)、核苷酸多態位點數()、核苷酸多樣性(i)、平均核苷酸差異數()。運用Popart構建單倍型網絡圖。運用MEGA11計算群體間和群體內的遺傳距離，基于Jukes–Cantor(JC)模型，采用UPGMA法構建單倍型進化樹，并進行1000次的Boot strap檢驗。運用Arlequin 3.5進行分子方差分析(AMOVA)。

2　結果與分析

2.1　3個中華鱉群體Cyt b的序列特征

通過PCR擴增測序獲得90條中華鱉序列，經Clustal W對比剪切后獲得1419 bp的有效片段。經分析，堿基A、G、T、C的平均含量分別為35.4%、10.7%、26.0%、27.9%，堿基G的含量明顯低于其他3種堿基的，表現出明顯的反G偏倚；A+T平均含量為61.4%，C+G平均含量為38.6%(表1)。90條序列共檢測到18種單倍型(圖1)，HR、HS和RB群體分別有10、6和5種單倍型；HS群體與其他群體無共享單倍型，主要單倍型為Hap 1；RB和HR群體共享單倍型為Hap 8、Hap 9和Hap 16，主要單倍型為Hap 8。3種鱉均有不共享的單倍型，可根據特定的單倍型來對它們進行區分。

表1　3個中華鱉群體的Cyt b序列堿基組成

圖1　3個中華鱉群體的Cyt b單倍型分布

2.2　3個中華鱉群體的遺傳多樣性

由表2可知，3個群體中90個個體總的d為0.905，i為0.014 71，為20.749；3個群體中，HS群體的最多，其次為HR群體的，RB群體的最低，分別為54、43、34；3個群體的d為0.747～0.867，為12.922～16.262，i為0.009 13～ 0.011 51，其中HR群體的d(0.867)、(16.262)和i(0.011 51)均最高，表明其遺傳多樣性較高。

表2　3個中華鱉群體的遺傳多樣性參數

2.3　3個中華鱉群體的遺傳差異

從中華鱉3個群體的遺傳距離(表3)來看，群體內遺傳距離為0.009 30～0.011 76，群體間遺傳距離為0.010 47～0.020 82，其中，HR群體與HS群體間的遺傳距離較HR群體與RB群體間的遺傳距離更遠，符合線粒體基因母系遺傳的特點。AMOVA分析結果(表4)顯示，3個中華鱉群體60.80%的變異源于群體內，39.20%的變異源于群體間，群體內遺傳多樣性更豐富。從單倍型網絡圖(圖2)可知，其整體相對較簡單，主要分為2支，其中Hap 4與其他單倍型距離較遠。在UPGMA法構建的中華鱉單倍型系統發育樹(圖3)中，部分HR群體與RB群體聚為1支，其余的HR、HS群體與RB群體聚為1支，2支再聚在一起，跟單倍型網絡圖結果一致?？梢?，日本鱉與雜交鱉的親緣關系更近。

表3　3個中華鱉群體間的遺傳距離和群體內的遺傳距離

表4　3個中華鱉群體的AMOVA分析結果

圖2　3個中華鱉群體的Cyt b單倍型網絡結構

3　結論與討論

遺傳多樣性是衡量生物進化潛力的重要指標。遺傳多樣性越豐富，物種適應環境的能力越強，高遺傳多樣性是維持物種生存和進化的物質基礎[14–15]。群體遺傳多樣性每減少10%，就會對該物種的生存力、適應力和繁殖力等造成巨大影響[16]。線粒體DNA特殊的結構和遺傳特點使其成為研究物種遺傳學的有效工具[17]。NEIGEL等[18]認為，給定群體內線粒體DNA核苷酸多樣性越小，群體的遺傳多樣性越低。GRANT等[19]將不同核苷酸多樣性和單倍型多樣性分為4種組合類型：低i(<0.005)與低d(<0.500)；低i(<0.005)與高d(>0.500)；高i(>0.005)與低d(<0.500)；高i(>0.005)與高d(>0.500)。本研究中，3種中華鱉群體在堿基的組成上基本相同，且A+T的含量明顯高于G+C的含量，這與李璐等[20]的研究結果相似。本研究結果表明，3個中華鱉群體的d與i均較高，屬于第4種類型，表明3個中華鱉群體的遺傳多樣性較豐富，種群可能有一個較大且穩定的群體。

KARTAVTSEV等[21]指出基因一般在種群內的遺傳距離為0.005～0.015。本研究中，黃沙鱉與日本鱉的遺傳距離為0.020 82，說明黃沙鱉種群與日本鱉種群具有較大差異，可能已分化為2個相對獨立的群體。物種遺傳多樣性的豐富程度與該物種的生存能力相關，遺傳多樣性越豐富，適應環境的能力越強[22]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評價物種多樣性的標準[23]。本研究結果顯示，黃沙鱉群體遺傳多樣性較日本鱉遺傳多樣性更豐富，這與劉陽等[24]的研究結果相似?？赡苁怯捎趶娜毡疽肴后w較少且經過長期人工選育[25]所致。本研究共獲得18個單倍型，黃沙鱉、日本鱉和雜交鱉分別有6、5和10個，其中日本鱉和雜交鱉共享3個單倍型，可能與線粒體基因隨母本遺傳有關[26]。龐廣昌等[27]認為群體內的變異影響群體的穩定性，群體間的變異反應群體在不同環境中的適應情況。3個中華鱉群體內的變異占比為60.80%，群體間的變異占比為39.20%，表明各群體之間相對穩定，群體間差異不大。

中華鱉在長期的地理隔離中形成了適應不同環境的地理種，在形態、生長和抗病能力上都有所差異[28–29]，利用不同地理種的鱉進行雜交已培育出具有生長快、抗逆性強、營養價值高等特點的雜交鱉，如綠卡鱉[30]、英明中華鱉[31]、浙新花鱉[32–33]等。雜交優勢大小與親本群體之間的遺傳差異有關，在一定范圍內遺傳距離越大，雜交優勢就越明顯[34]。本研究中，雜交鱉遺傳多樣性高于黃沙鱉和日本鱉，表明雜交會提高中華鱉的遺傳多樣性，進而提高其環境適應力。在養殖生產過程中，雜交鱉的生長及抗病能力表現均優于純種中華鱉，說明雜交優勢在地理種之間的雜交是存在的：因此，對于中華鱉的雜交選育需要弄清其遺傳背景，對不同地理群體進行遺傳距離的測定，科學選育，避免近親繁育，同時保證親本群體數量，以確保群體的遺傳多樣性。

[1] 張振東，劉夕姿，肖友紅．我國中華鱉種苗產業調查與發展戰略[J]．漁業信息與戰略，2016，31(2)：98–104．

[2] 金晶，劉子明，呂耀平，等．松陽花鱉與中華鱉四個地理種群形態差異比較研究[J]．生態科學，2018，37(2)：131–137．

[3] 張林，周劍光，張濤，等．3個不同品系中華鱉間外形、核型以及乳酸脫氫酶同工酶表達的差異[J]．中國漁業質量與標準，2020，10(6)：59–67．

[4] 闕江龍，付輝云，張燕萍，等．中華鱉鄱陽湖品系和黃沙品系及其雜交后代的主成分分析和判別分析[J]．安徽農業科學，2022，50(8)：77–80．

[5] 何金釗，馮鵬霏，周大顏，等．稻鱉生態種養對黃沙鱉肌肉品質的影響[J]．水產養殖，2022，43(2)：24–30．

[6] 馬夢嬌，荊慧娟，符安衛，等．中華鱉腿肉蛋白的理化性質[J]．食品與發酵工業，2019，45(22)：110–116．

[7] 梁宏偉，曹力歡，羅相忠，等．基于線粒體基因的中華鱉3個品系遺傳多樣性分析[J]．基因組學與應用生物學，2021，40(Z3)：2908–2915．

[8] 程磊，何蘋萍，韋嬪媛，等．基于線粒體D–loop區和基因分析廣西禾花鯉三個群體遺傳結構[J]．水生生物學報，2021，45(1)：54–59．

[9] 彭敏，肖珊，陳曉漢，等．基于線粒體基因的南海北部金錢魚種群遺傳結構分析[J]．南方農業學報，2021，52(10)：2851–2860．

[10] 邢晶晶．分子遺傳標記及其技術在水產生物中的研究與應用[J]．水產學雜志，2002，15(1)：61–70．

[11] 彭巧玲，蒲友光，王志方，等．中華鱉線粒體基因組序列分析[J]．中國生物化學與分子生物學報，2005，21(5)：591–596．

[12] 楊彥平，許萌原，馬鳳嬌，等．基于線粒體基因的長江刀鱭群體遺傳結構分析[J]．江西農業學報，2021，33(8)：11–16．

[13] 陳辰，朱新平，李偉，等．一組鱉科動物線粒體全基因組擴增通用引物：CN112501308 A[P]．2021–03–16．

[14] 申紹祎，田輝伍，汪登強，等．長江上游特有魚類紅唇薄鰍線粒體控制區遺傳多樣性研究[J]．淡水漁業，2017，47(4)：83–90．

[15] 唐首杰，畢詳，張飛明，等．基于線粒體DNA基因序列團頭魴3個選育群體的遺傳變異分析[J]．水產科技情報，2019，46(2)：61–68．

[16] 楊偉，代應貴，安丹丹，等．北盤江光唇裂腹魚種群基因組DNA遺傳多樣性的AFLP分析[J]．海洋漁業，2021，43(4)：385–394．

[17] 程亞欣．基于線粒體控制區和細胞色素B基因的江豚種群遺傳多樣性和遺傳結構分析[D]．上海：上海海洋大學，2016．

[18] NEIGEL J E，AVISE J C．Application of a random walk model to geographic distributions of animal mitochondrial DNA variation[J]．Genetics，1993，135(4)：1209–1220．

[19] GRANT W，BOWEN B．Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes：insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]．Journal of Heredity，1998，89(5)：415–426．

[20] 李璐，譚舜，王彪，等．基于線粒體D–loop區序列的中華鱉不同群體遺傳差異分析[J]．水產學雜志，2020，33(5)：7–11．

[21] KARTAVTSEV Y P．Divergence atandmtDNA genes on different taxonomic levels and genetics of speciation in animals[J]．Mitochondrial DNA，2011，22(3)：55–65．

[22] 李大命，孫文祥，許飛，等．高郵湖大銀魚、太湖新銀魚和基因序列多態性分析[J]．水產科學，2020，39(2)：258–264．

[23] HOUKI S，YAMADA M，HONDA T，et al．Origin and possible role of males in hermaphroditic androgeneticclams[J]．Zoological Science，2011，28(7): 526–531．

[24] 劉陽，史燕，朱新平，等．中華鱉5個群體遺傳多樣性的微衛星分析[J]．基因組學與應用生物學，2012，31(2)：141–146．

[25] 田鎮，陳愛華，曹奕，等．紅殼色文蛤選育群體遺傳多樣性的微衛星分析[J]．南方農業學報，2021，52(9)：2582–2589．

[26] PERMANA G N，HUTAPEA J H，MORIA S B，et al. Maternal inheritance of yellowfin tuna () in captivity[J]．Journal of Environmental Science and Engineering B，2015，4(1)：31–36．

[27] 龐廣昌，姜冬梅．群體遺傳多樣性和數據分析[J]．林業科學，1995，31(6)：543–550．

[28] 張世水，胡火庚，王軍花，等．江西省中華鱉種質狀況及養殖方式調查[J]．南昌大學學報(理科版)，2012，36(1)：77–81．

[29] 蔡完其，李思發，劉至治，等．中華鱉七群體稚鱉—成鱉階段養殖性能評估[J]．水產學報，2002，26(5)：433–439．

[30] 劉陽，龍建杰，劉佳瑤，等．中華鱉洞庭湖群體、黃河群體及其雜交種稚幼體生長對比試驗[J]．廣東農業科學，2012，39(14)：156–157．

[31] 范厚勇．英明中華鱉的選育及其養殖性能研究[D]．南昌：南昌大學，2013．

[32] 何中央，張海琪，周凡，等．中華鱉“浙新花鱉”[J]．中國水產，2017(3)：80–83．

[33] 張君，陳露，余鵬，等．中華鱉4個品系營養成分分析與比較[J]．水生生物學報，2018，42(4)：770–778．

[34] DONG Z，ZHOU E．Application of the random ampli?ed polymorphic DNA technique in a study of heterosis in common carp，L.[J]. Aquaculture Research，1998，29(8)：595–600．

Genetic diversity analysis ofand their hybrid from two geographical populations of usingsequence

XIAO Hewei，HU Yazhou，QIN Qin，XU Dajian，LIANG Yixin，LIU Xiaoyan，WANG Xiaoqing*

(College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

To comprehend the genetic diversity within the Chinese soft-shelled turtle(), mitochondrial genes() from two geographical populations ofand their hybrids were sequenced and analyzed. The study yielded a total of 90 sequences with 18 haplotypes among the three sequenced groups of Japanese population, Huangsha population and hybrid population ofvia PCR. Among the 90 individuals of, the average base contents for A, T, C and G was 35.4%, 26.0%, 27.9% and 10.7%, respectively, revealing a distinct anti-G bias. The Japanese population, Huangsha population and hybrid population exhibited 5, 6 and 10 haplotypes, respectively. Notably, the Japanese population shared haplotypes Hap 8, Hap 9 and Hap 16 with the hybrid population. Population variance contributed significantly to overall variation at 60.8%. Haplotype diversity for all three populations ranged from 0.747 to 0.867, average nucleotide differences ranged from 12.922 to 16.262, and nucleotide diversity ranged from 0.009 13 to 0.011 51. In terms of the three groups, the number of haplotypes, haplotype diversity, average nucleotide diversity and nucleotide diversity of the hybrid population were the highest, and those of the Japanese population were the lowwest, while the number of polymorphic loci decreased in the order of the Huangsha population, hybrid population and Japanese population. The study findings underscored the rich genetic diversity of hybrid population of, suggesting that hybridization events augment the genetic diversity within.

Huangsha population of; Japanese population of;gene; genetic diversity; haplotype; variable site

S917.4

A

1007–1032(2023)04–0486–05

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.017

2022–04–02

2023–08–10

國家重點研發計劃項目(2018YFD0900200)；湖南省水產產業技術體系

肖何威(1997—)，男，湖南長沙人，碩士研究生，主要從事水產動物遺傳育種研究，X42643934@163.com；*通信作者，王曉清，博士，教授，主要從事水產動物遺傳育種研究，wangxiao8258@126.com

肖何威，胡亞洲，秦溱，徐大建，梁藝馨，劉小燕，王曉清．基于序列分析黃沙鱉和日本鱉及其雜交子一代的遺傳多樣性[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：486–490．

XIAO H W，HU Y Z，QIN Q，XU D J，LIANG Y X，LIU X Y，WANG X Q．Genetic diversity analysis ofand their hybrid from two geographical populations of usingsequence [J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：486–490．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正