基于釀酒酵母的多片段質粒的構建

湯雅萍，程毅，王吐虹，陳佳，高春生，郭利桃，宋志強，唐超，嚴準，李智敏

基于釀酒酵母的多片段質粒的構建

湯雅萍，程毅，王吐虹，陳佳，高春生，郭利桃，宋志強，唐超，嚴準，李智敏*

(中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

為避免現有的多片段質粒構建技術的弊端，提高多片段質粒構建效率，以構建樹干畢赤酵母基因的敲除載體為例，利用釀酒酵母活體細胞重組系統，一次性將多個外源DNA片段和線性化質粒重組，形成環狀質粒。通過引物設計在相互連接的DNA片段之間引入50 bp重疊序列，用PCR擴增DNA片段后，與線性化質粒一起轉化釀酒酵母，再用PCR和測序等方法鑒定陽性酵母菌落中質粒的正確性。通過本方法構建的多片段質粒正確率高、耗時短。

質粒構建；多片段質粒；酵母同源重組系統

基因工程操作中常需要將多個DNA片段連接克隆到同一個載體質粒中，傳統的方法是利用DNA內切酶酶切后再用DNA連接酶將2個片段連接起來構建質粒，每次構建最多只能連接2個片段[1]，下一個DNA片段的構入必須以前一個成功構入DNA片段的質粒為基礎?？梢?，傳統方法受DNA片段內切酶位點的限制，工作量大，周期長。Gateway技術在表達載體構建上不需要人工酶切/連接，也可以在特定結構的載體上一次構入幾個DNA片段[2]，但Gateway技術需要在載體上預先設置attB重組位點，也不能隨意進行多個DNA片段的連接?；讦耸删wRed/ET重組酶系統的質粒構建技術有一定優越性[3]，但該方法需要預先在細菌中表達Red/ET系統的多個重組酶后才能用于多片段質粒的構建[4]。這些技術都有一定的壁壘，應用起來都不夠便捷。目前較常用的、操作相對簡單的是基于Gibson assembly 原理的無縫克隆試劑盒商業產品，但該產品對于多個DNA片段的質粒構建成功率較低。

釀酒酵母細胞內具有一套嚴謹且高效的DNA同源重組系統，保證了酵母遺傳物質的修復和維護[5]。很多研究利用這一重組系統將外源DNA整合到酵母基因組上進行基因表達[6]或者利用這一重組系統進行酵母內部基因敲除[7]。有研究人員利用約50 bp的同源重組序列在酵母菌活體細胞內成功構建了質粒[8–9]，但該研究只涉及1個外源基因片段與1個載體的重組連接。KUIJPERS等[10]利用酵母的重組系統并通過60 bp的重疊序列，實現了幾個片段質粒的構建，但60 bp的重疊片段還是相對較長，這增加了引物合成的成本。本研究以構建樹干畢赤酵母1個未知功能基因()的敲除載體為例，探討1種更高效的多片段質粒構建方法，包括50 bp重疊序列引物設計、外源DNA片段制備、釀酒酵母轉化以及陽性酵母菌落鑒定等4個主要步驟，完成該試驗操作僅需3 d時間即可獲得正確的、多片段組裝的目標質粒。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

分別含有pS300質粒、p2076質粒和pHyg質粒的3個DH5α大腸埃希菌菌株和釀酒酵母()4741菌株以及樹干畢赤酵母()CBS 6054菌株由中國農業科學院麻類研究所提供。

初始質粒pS300作為構建載體的骨架，其主要結構如圖1所示。它包含pMB1 ori、f1 ori 2個原核細胞復制子和在大腸埃希菌中的篩選標記Amp 抗性基因，以及可在酵母宿主中自行復制的元件(CEN/ARS)和線性化酶切位點d III。p2076質粒中含有G418抗性基因，在本次質粒構建中作為釀酒酵母的陽性克隆篩選標記。pHyg質粒中含有潮霉素篩選標記Hyg抗性基因，作為基因敲除序列結構中的1個元件(在本試驗中不作為篩選標記)。樹干畢赤酵母CBS 6054菌株則提供基因的左、右側翼片段序列，序列來源分別是v2.0 assembly中的Picst3|chr_3.1:98395- 99420和Picst3|chr_3.1:103936-105124(http://genome.jgi.do e.gov/Picst3/Picst3.home.html)。

圖1　pS300質粒的主要結構

1.2　方法

1.2.1引物設計與外源DNA片段及初始質粒骨架的制備

試驗預期構建的基因敲除載體質粒所需外源DNA片段和連接方向為pS300 線性質粒3→ 5G418抗性基因3→ 5左同源臂3→ 5Hyg抗性基因3→ 5右同源臂3→ pS300 線性質粒5，如圖2所示。利用酵母重組系統構建質粒，要求在相鄰2個DNA片段的接頭處有約50 bp重疊序列。為使這些片段按規定順序進行連接，用Primer premier 5.0設計好各個DNA序列的特異引物后在引物上添加相應的50 bp重疊序列，具體引物序列如表1，各片段間的50 bp 重疊序列區如圖2所示。各個外源DNA片段可通過PCR擴增獲得。提取pS300初始質粒后用d III酶切線性化；各個片段均用DNA凝膠試劑盒純化回收。用NanoDrop 2000測定DNA片段濃度后，各個DNA片段均保存于–20 ℃冰箱中，備用。為便于后續基因敲除片段的線性化，設計引物時在左側翼片段的左端和右側翼片段的右端均加上II酶切位點。引物對S300–F和S300–R分別位于pS300質粒線性化d III酶切位點的左、右兩側(如圖1所示)。

圖2　外源DNA片段與pS300質粒連接的結構

表1　本試驗所用的引物

序列單下劃線為50 bp同源片段，雙下劃線是在引物中引入的II酶切位點。

1.2.2釀酒酵母的轉化

根據GIETZ等[11]的“LiAc/SS carrier DNA/PEG”方法制備和轉化酵母感受態，但稍有改動：加入的各個DNA和質粒溶液的量如表2所示，對照樣品不加G418抗性基因的DNA片段，而用1.6 μL ddH2O 代替；總體積不超過10 μL。轉化DNA片段后加500 μL新鮮的YPD培養液，在30 ℃、200 r/min搖床中活化4 h；隨后取100 μL活化的細胞液用于涂皿。G418抗性基因以抗生素G418為篩選藥物，制作含有200 μg/mL G418的YPD固體培養基作為篩選平皿。對照樣品涂布于不含G418和含G418的2個培養皿中(以檢驗G418是否有效)，而處理樣品涂布于含G418的培養皿中；封皿后放于30 ℃恒溫培養箱中培養36～48 h。在培養36 h時拍照。

表2　酵母轉化時各個DNA片段的加入量

1.2.3陽性菌落的鑒定

從不含G418的對照樣品平皿上挑取少許菌體接種于不含G418 的YPD培養液中(作為后續陽性菌落PCR鑒定的對照)；從處理樣品平皿中隨機挑取9個陽性菌接種于含有200 μg/mL G418的YPD液體培養基中，在30 ℃、200 r/min培養過夜。采用PBC快速PCR模板制備方法[12]制備PCR模板。用S300–F、S300–R引物(在pS300質粒上的位置如圖1所示)和CloneAmp HiFi PCR Premix (Clontech)對各個樣品模板進行PCR擴增，1.2%凝膠電泳檢測。如插入片段大小與預期(約5656 bp)相符，進一步用Yeast Plasmid Kit (Omega Biotek)提取質粒并將質粒DNA通過CaCl2–熱激法[13]轉化到大腸埃希菌DH5α中。對陽性DH5α菌落搖菌培養并提取質粒后用II和I分別進行單酶切和雙酶切，通過凝膠電泳觀察酶切情況，初步判斷質粒構建是否正確；通過步移測序(由湖南擎科生物技術有限公司完成)進一步確定多片段載體構建質粒序列的正確性。

1.2.4作圖

運用ApE軟件制作圓形質粒圖。

2　結果與分析

2.1　各個DNA片段和線性化質粒骨架的獲取

用相應的引物和DNA模板擴增4個外源DNA片段，1.2%瓊脂糖凝膠電泳。結果(圖3)顯示：第2泳道G418抗性基因目的條帶位于2000 bp和1200 bp中間靠下位置，與預期的1432 bp片段長度相符；第3泳道左同源臂、第4泳道Hyg抗性基因和第5泳道右同源臂的目的條帶的大小均與預期長度(表1)相符，初步證明PCR擴增結果正確；從大腸埃希菌提取的pS300質粒以超螺旋狀態為主(第6泳道)，證明質粒提取效果良好；pS300質粒經d III酶切后被線性化，電泳條帶大小接近3000 bp(第7泳道)，與預期的2872 bp長度相符。

經純化后的各個DNA片段的濃度約為30 ng/μL，具體濃度如表2所示。轉化釀酒酵母時，為保證各個片段之間量的比例約為1，各片段按表2取適當體積的DNA溶液加入釀酒酵母感受態中混合轉化。

泳道1　DNA ladder；泳道2　G418抗性基因；泳道3　Aggl左同源臂；泳道4　Hyg抗性基因；泳道5　Aggl 右同源臂；泳道6　pS300質粒；泳道7　Hind III酶切線性化的pS300質粒。

2.2 轉化釀酒酵母后獲得的陽性克隆及PCR驗證

將G418抗性基因、左同源臂、Hyg抗性基因、右同源臂和線性化pS300質粒等5個外源DNA片段共同轉化釀酒酵母4741菌株感受態，轉化結果如圖4所示。對照樣品的2個皿中，不含G418的平皿上長滿了酵母菌體(圖4–a)，而含有G418的平皿上沒有長出任何菌落(圖4–b)。加G418抗性基因的處理樣品長出了超過100個克隆的陽性菌落(圖4–c)?？梢娙鄙貵418抗性基因的對照樣品不能形成帶有G418抗性的質粒，而加有G418抗性基因的處理樣品平皿中的單菌落在酵母活體細胞同源重組系統作用下形成了環狀化的帶有G418抗性的質粒。

圖4　多片段共轉化釀酒酵母的平皿篩選結果

在處理樣品皿(圖4–c)上隨機挑取9個陽性菌落進行PCR鑒定，結果顯示：對照菌沒有擴增出任何條帶(圖5泳道2)；而隨機挑取的9個陽性菌落中有6個(圖5泳道3、5、6、7、10和11)能擴增出稍大于5000 bp的目的條帶，該條帶的大小與預期的4個DNA片段(G418抗性基因、左同源臂、Hyg抗性基因和右同源臂)的大小之和(約5656 bp)相符；另外3個陽性菌落的PCR擴增片段(圖4泳道4、8和9)大小約1600 bp，與預期不符。初步證明已經成功構建了由4個外源DNA片段與質粒組成的復雜載體，多片段質粒構建成功率約為66.7%。由于構建好的質粒在酵母細胞中的拷貝數較低，為獲得較多的質粒，將圖5第3泳道對應的菌株DNA轉化大腸埃希菌DH5α菌株，用于下一步酶切和測序驗證，并將該質粒命名為knockout plasmid。

泳道1　DNA ladder；泳道2 對照4741菌株；泳道3～11 處理樣品的陽性菌落。

2.3　酶切和測序進一步檢驗構建的多片段質粒

為驗證knockout plasmid質粒中是否含有預設的2個II酶切位點以及1個I酶切位點(Hyg抗性基因本身帶有該酶切位點)，對從大腸埃希菌中提取的knockout plasmid 質粒進行酶切和電泳分析。各個外源DNA片段拼接的預期質粒結構和設置的酶切位點如圖6–a所示。在序列位置1 bp和4089 bp位置設有酶切位點II(表1)，在1842 bp位置有酶切位點I。用II和I分別對knockout plasmid質粒進行單酶切和雙酶切的結果如圖6–b所示。II的單酶切產物在電泳圖上有1條帶位于3000～5000 bp(圖6–b，第3泳道)，這個結果與預期相符。因為在預期的圓形質粒上有2個II位點，能將質粒切成4089 bp和4292 bp 2個片段，這2個片段長度較大且片段大小接近，在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上難以分開而只形成一條帶。用I進行單酶切后有單一的條帶，條帶位置遠大于DNA ladder 的5000 bp條帶(圖6–b，第4泳道)，與預期的knockout plasmid質粒8382 bp相符。用II和I對該質粒進行雙酶切，結果產生3條帶：一條帶在3000～5000 bp，另外2條帶分別在DNA ladder 2000 bp帶的上、下位置。從質粒結構圖譜上可知II和I雙酶切可以形成3個片段，片段大小分別為4292、2247、1842 bp?？梢?，雙酶切的結果也與預期相符。酶切結果進一步說明由多個DNA片段組合的質粒已經構建成功。

a　4個DNA片段與pS300質粒連接的結構與酶切位點示意圖；b 構建完成后的質粒酶切電泳情況。泳道1 DNA ladder；泳道2 SsAggl knockout plasmid；泳道3　Pvu II酶切；泳道4　Nde I酶切；泳道5　Pvu II和Nde I雙酶切。

為驗證構建的質粒中各個外源DNA片段的連接是否正確，進一步對knockout plasmid質粒進行測序分析。步移測序分析結果顯示：線性化pS300質粒的3端(G418–F引物上的同源序列)與G418抗性基因的5端成功連接(圖7–a，測序結果為反向互補序列)；下一個連接點的測序峰圖結果顯示G418抗性基因3端與左同源臂的5端連接正確(圖7–b)；左同源臂3端與Hyg抗性基因5端成功正確連接(圖7–c)；Hyg抗性基因的3端與右同源臂的5端成功正確連接(圖7–d)；右同源臂的3端也與pS300 5端重組位置一致(圖7–e)。測序結果的連接處序列與表1中各個DNA片段頭、尾處的50 bp重疊序列的堿基均一致，說明連接方向為pS300 3→5G418抗性基因3→ 5左同源臂3→5Hyg抗性基因3→5右同源臂3→pS300 5'的樹干畢赤酵母基因敲除載體質粒構建成功。

a 線性化pS300 3'與G418抗性基因5'端的連接點(反向互補序列)；b G418抗性基因3'端與Aggl左同源臂5'端的連接點；c Aggl左同源臂3'端與Hyg抗性基因5'端的連接點；d Hyg抗性基因3'和Aggl右同源臂5'端的連接點；e Aggl右同源臂3'和pS300 5'端的連接點。彩色粗線段標記的是引物重疊序列。

3　結論與討論

本研究中，以構建樹干畢赤酵母基因的敲除載體為例，利用釀酒酵母活體細胞重組系統，一次性將多個外源DNA片段和線性化質粒重組形成環狀質粒，用該方法構建多片段質粒的陽性酵母菌落中，大部分能夠形成正確重組連接的質粒，而少數陽性菌落含有錯誤連接。這些錯誤質粒僅連接了G418抗性基因片段，可能是由于非同源末端連接修復(NHEJ)引起的[14]。雖然最終轉化有少數錯誤的質粒，但是這種多片段質粒的構建方法仍是非常簡便而高效的。在筆者多次用不同的多片段構建質粒的試驗中(相關數據未在本文中顯示)，陽性克隆的正確率均在50%以上，且只要適當增加陽性菌落的檢測數量，即可從中獲得正確組裝的重組質粒。

本試驗介紹的多片段質粒構建方法包含3個主要步驟：1)含50 bp重疊序列的引物的設計；2)外源DNA片段的制備和釀酒酵母轉化；3)陽性酵母菌落的鑒定。這一過程只需3 d時間?？梢?，本試驗描述的多片段質粒構建方法的成功率和效率都相對較高。由于本方法屬于同源重組，片段之間還可以實現“無縫”連接或者按需求添加酶切位點。雖然克隆單一外源片段的商業化無縫克隆試劑盒效果相對穩定，但是面對多片段質粒構建時用此類試劑盒仍然需要分步進行、多次克隆才能實現，構建周期大幅增加。細菌Red/ET重組方法也需要大約50 bp的重疊序列，且需要預先在宿主菌中協同高效表達重組系統相關的酶(Redα/Redβ 或RecE/RecT等)[15]，相對本方法的材料要求更高。而Gateway技術只能在特定序列位點進行重組[16]，難以用于有序的多片段組裝：因此，本研究的多片段質粒構建方法相對更為簡便而高效，可以廣泛用于構建各種復雜片段或載體質粒。

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Construction of multi-fragments plasmid based on

TANG Yaping，CHENG Yi，WANG Tuhong，CHEN Jia，GAO Chunsheng，GUO Litao，SONG Zhiqiang，TANG Chao，YAN Zhun，LI Zhimin*

(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan 410205, China)

To enhance the efficiency of multi-fragment plasmid construction and overcome the limitations of current techniques, this study introduced a method that utilized the recombination system withinliving cell. This approach enabled the simultaneous integration of multiple exogenous DNA fragments with linearized plasmid into a circular plasmid, using the construction of an-gene knockout vector foras an example. The method involved designing primers to introduce 50 bp overlapping sequences between interconnected DNA fragments, followed by PCR amplifying of these fragments. Subsequently, the linearized plasmids were co-transformed with the DNA fragments intocells. Validation of the plasmids accuracy was then performed in positive yeast colonies through PCR and sequencing. This method offers a high level of precision and considerably reduces the time required for constructing multi-fragments plasmids.

vector construction; multi-fragments plasmid; yeast homologous recombination system

Q782

A

1007–1032(2023)04–0421–07

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.007

2022–12–09

2023–07–24

中國農業科學院科技創新工程(ASTIP–IBFC–04)；湖南省自然科學基金項目(2015JJ3128)；湖南省植保植檢站植物防疫防控科研項目(HNZB202104)

湯雅萍(1997—)，女，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事作物黑粉病研究，82101205263@caas.cn；*通信作者，李智敏，博士，副研究員，主要從事谷類作物真菌病害研究，lizhimin@caas.cn

湯雅萍，程毅，王吐虹，陳佳，高春生，郭利桃，宋志強，唐超，嚴準，李智敏．基于釀酒酵母的多片段質粒的構建[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：421–427．

TANG Y P，CHENG Y，WANG T H，CHEN J，GAO C S，GUO L T，SONG Z Q，TANG C，YAN Z，LI Z M．Construction of multi-fragments plasmid based on[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：421–427．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正