UPLC-MS/MS法測定特殊醫學用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留

孫 磊，張明星，翟洪穩，馬俊美，張春林，任曉偉，曹梅榮*

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監管重點實驗室（特殊食品監管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050227）

季銨鹽是一類陽離子表面活性劑，該類化合物具有良好的乳化、潤濕、洗滌、殺菌等性能，在化工等工業領域廣泛應用，同時在抗菌和消毒等領域也越來越受到重視[1]。在乳制品生產過程中，為使衛生要求達標，生產企業會使用臭氧、含氯消毒劑、季銨鹽類消毒劑、乙醇、過氧化氫、過氧乙酸等消毒劑對擠奶設備、裝奶容器以及生產設備等進行消毒，其中季銨鹽類消毒劑副作用小、毒性低且價格低廉，在乳制品生產工藝中得到廣泛應用[2-4]。但隨著各種研究的逐步深入，季銨鹽類消毒劑被發現對水生生物有較強的毒性[5]，同時還可能引起人的哮喘、皮膚過敏性反應以及視力減退等病癥[6-7]。特殊醫學用途配方食品是以醫學或營養學的研究結果為依據，為滿足特殊人群如進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂以及其他特定疾病等人群對營養、膳食的需要，加工而成的配方食品[8]。使用該類產品的人群通常存在一定程度的身體機能障礙，自身免疫力較弱[9]，更容易受到殘留消毒劑的不良影響，因此研究建立含乳成分的特殊醫學用途配方食品中殘留消毒劑的檢測方法，并對特殊醫學用途配方食品中消毒劑殘留水平進行檢測和風險評估具有十分重要的意義。

季銨鹽類消毒劑常用的檢測方法主要包括容量分析法[10]、分光光度法[11-12]、氣相色譜法-串聯質譜法[13-14]、離子色譜法[15-16]、高效液相色譜法[17-19]、液相色譜-串聯質譜法[20-21]等。其中液相色譜-串聯質譜法常見的研究對象主要有環境水樣[22-24]、嬰幼兒配方乳粉[25-27]、冷凍食品[28]、血清和尿液[29]以及復方消毒產品[30]等，但是針對特殊醫學用途配方食品中消毒劑殘留的研究基本空缺，特殊醫學用途配方食品基質較為復雜，容易對檢測造成干擾，且其中消毒劑殘留量較低，因此對檢測方法的精度要求較高。相比其他檢測方法，液相色譜-串聯質譜法具有較高的靈敏度、選擇性以及出色的定性、定量能力，更適用于特殊醫學用途配方食品中低水平殘留消毒劑的檢測。故研究采用超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術，建立含有乳成分的特殊醫學用途配方食品中C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的檢測方法，為掌握含有乳成分的特殊醫學用途配方食品中消毒劑的殘留水平以及對其風險評估提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用樣品為含有乳成分的特殊醫學用途配方食品，均購自藥店和孕嬰店，共5 個品種、44 批次，其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營養配方食品6 批次、早產/低出生體質量嬰兒配方食品11 批次。

C12-苯扎氯銨（純度99.9%）、C14-苯扎氯銨（純度98.8%）、C16-苯扎氯銨（純度98.8%）、十二烷基三甲基溴化銨（純度99.9%）、二癸基二甲基氯化銨（純度99.9%）、四丁基硫酸氫銨（純度99.8%） 北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇 美國Fisher公司；甲酸（色譜純）、乙酸銨 美國Sigma公司；超純水由Milli-Q純水機制得，電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

UPLC-QTrap?5500 UPLC-MS/MS儀 美國Sciex公司；CR22N高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國Elma公司；Vortex Genius 3旋渦混合器 德國IKA公司；0.22 μm PTFE微孔濾膜 美國Pall公司；Milli-Q純水機 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取適量的C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種標準物質于100 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，得到質量濃度為100 μg/mL的標準儲備溶液，于0～4 ℃冷藏保存，可保存3 個月。

吸取適量的6 種消毒劑標準儲備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋成質量濃度為1.0、0.1 μg/mL的混合標準溶液，于0～4 ℃冷藏保存，可保存1 個月。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 固體試樣

準確稱取1 g（精確至0.001 g）試樣置于15 mL離心管中，加入2 mL加熱至50 ℃左右的超純水，渦旋振蕩10 s，再加入8 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min后，放入-18 ℃冰箱中放置1 h，在0～4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后，待測定。

1.3.2.2 液體試樣

準確稱取1 g（精確至0.001 g）試樣置于15 mL離心管中，加入9 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min后，放入-18 ℃冰箱中放置1 h，在0～4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后，待測定。

1.3.3 基質匹配標準工作曲線的繪制

稱取多份空白試樣，每份1 g（精確至0.001 g），置于15 mL具塞離心管中，加入適量混合標準中間溶液，按照1.3.2節的步驟進行相同操作，分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的基質匹配標準工作曲線所需溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）、甲醇體積比15∶85；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫25 ℃。

1.3.5 質譜條件

離子源參數：電噴霧離子源正離子模式；噴霧電壓4 000 V；離子源溫度450 ℃；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi。

在優化好的儀器條件下，6 種季銨鹽類消毒劑的多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）參數見表1。

表1 6 種季銨鹽類消毒劑的MRM參數Table 1 MRM parameters for six quaternary ammonium disinfectants

1.4 數據處理

儀器操作、分析控制與數據收集通過Analyst?軟件（Version 1.6.3，美國AB Sciex公司）完成；儀器數據處理及消毒劑殘留物的含量計算通過MultiQuantTM軟件（Version 3.0.8664.0，美國AB Sciex公司）完成。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

特殊醫學用途配方食品中通常含有較高的蛋白質、脂肪和糖類等物質，而季銨鹽在水和有機溶劑中都有良好的溶解度，用水提取樣品中的季銨鹽時，提取液會形成懸濁液，無法開展后續的分析測定工作，因此常用乙腈和甲醇作為提取溶劑來提取特殊醫學用途配方食品中的季銨鹽類消毒劑。采用乙腈作為提取溶劑時，由于乙腈對脂肪的溶解度比甲醇低，且比甲醇有更強的沉淀蛋白能力，因此提取溶液相比使用甲醇時更為清澈，回收率較高并且可以很大程度降低提取液中基質的干擾。

本研究考察體積分數60%、70%、80%乙腈溶液和純乙腈作為提取溶劑時的提取效果。對于脂肪、蛋白含量較高的樣品，采用60%乙腈溶液進行提取時，提取液經常會出現渾濁現象。隨著提取液中乙腈的比例不斷提高，對蛋白的沉淀效果也不斷提升，提取溶液的渾濁度逐漸下降。但使用純乙腈進行提取時，迅速沉淀的蛋白等雜質會與待測樣品凝結成團狀，不能很好地分散，導致提取效率下降。綜合分析后，最終提取溶劑采用80%乙腈溶液。同時優化固體試樣的提取方式，先用2 mL水充分溶解，再加入8 mL乙腈進行提取。同時采用冷凍提取液的方式，進一步促進脂類和蛋白的沉淀。此外，樣品定量測定時采用基質匹配標準工作曲線進行校正，能夠有效降低樣品基質的干擾，保證測定結果的準確性。

2.2 色譜條件的優化

本研究比較3 種流動相對峰型和響應值的影響，分別為水-甲醇、20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇及20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）-甲醇。使用水-甲醇體系時，得到的峰型較差，且出現了拖尾。使用20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇體系時，能夠有效改善峰型較寬和拖尾的問題。流動相加入甲酸后，促進待測物在離子源中的電離，6 種消毒劑的響應值均有一定程度的提高，因此最終選擇20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）-甲醇體系作為流動相。

2.3 質譜參數的優化

在質譜上使用基質匹配混合標準溶液對6 種季銨鹽類消毒劑的碰撞能量和去簇電壓進行優化，同時確定適合的駐留時間，優化后的參數詳見表1。6 種季銨鹽類消毒劑均具有良好的峰型和響應值，具體的MRM離子色譜圖見圖1。

圖1 6 種季銨鹽類消毒劑（1 ng/mL）的MRM離子色譜圖Fig.1 MRM ion chromatograms of six disinfectants (1 ng/mL)

2.4 標準曲線的線性關系、方法檢出限和定量限

通過向空白基質中加標的方式，獲得方法的檢出限和定量限。選取信噪比（RS/N）=3時待測物的質量濃度為方法的檢出限，選取RS/N=10時待測物的質量濃度為方法的定量限。文獻中的類似相關方法線性相關系數通常大于0.995，檢出限為0.2～1.0 μg/kg，定量限為0.5～5.5 μg/kg。由表2可知，本研究中6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的質量濃度為0.1～5.0 ng/mL時，線性關系良好，線性相關系數（R2）≥0.996 0，檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg，方法的靈敏度優于大部分其他文獻中的方法。

表2 6 種季銨鹽類消毒劑的線性關系、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, LODs and LOQs of six disinfectants

2.5 準確度和精密度

向空白基質中添加6 種季銨鹽類消毒劑的標準物質進行加標回收率的測定，分別添加低、中、高3 個梯度，每個梯度進行6 次重復測定。文獻中的類似方法加標回收率范圍通常為65%～115%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.64%～16.80%。由表3可知，6 種季銨鹽類消毒劑在固體試樣基質中加標回收率為72.8%～102.3%，RSD為0.25%～3.88%，在液體試樣基質中加標回收率為71.8%～100.8%，RSD為0.19%～2.51%，與文獻中的其他方法相比，該方法加標回收率穩定，且精密度更佳。

表3 6 種季銨鹽類消毒劑的加標回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of six disinfectants from spiked samples (n = 6)

2.6 實際樣品的測定

為進一步驗證本方法的適用性，分別選擇在售的5 個品種44 批次含乳成分的特殊醫學用途配方食品進行實際樣品檢測，其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營養配方食品6 批次、早產/低出生體質量嬰兒配方食品11 批次。測定過程中方法穩定性良好，結果顯示，該44 個批次產品中均未檢出6 種季銨鹽類消毒劑殘留，表明含乳特醫食品中消毒劑殘留水平控制的較好。

3 結 論

該研究基于UPLC-MS/MS技術建立了含乳成分的特殊醫學用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留的檢測方法。該方法前處理簡單快速、準確度高、精密度好，適用于含乳成分的特殊醫學用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的檢測。目前對于特殊醫學用途配方食品中季銨鹽消毒劑殘留量的檢測研究還較少，該研究可以同時為其他種類的特殊醫學用途配方食品中季銨鹽類消毒劑的檢測提供技術參考，并為特殊醫學用途配方食品中消毒劑殘留水平的檢測以及對其風險評估提供方法支持。