鹽酸度洛西汀工藝中類Hofmann-Martius重排產物的確證與產生機制

張可可，林金生，鄭樂偉，王吉超，李 敏*，沈衛陽

（1浙江華海藥業股份有限公司高等分析技術中心，臨海 317024；2中國藥科大學理學院，南京 211198）

抑郁癥是一種常見且對人類身心健康有著嚴重危害的精神類疾病。鹽酸度洛西汀(圖1-A)作為一種新型的口服選擇性5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）雙重再攝取抑制劑（SNRI）在抑郁癥的治療中發揮了重要作用，主要用于治療重度抑郁癥、廣泛性焦慮障礙、纖維肌痛和應激性尿失禁[1-2]。

在鹽酸度洛西汀粗品與鹽酸度洛西汀成品某一批次樣品生產過程的質量控制中，發現了2 個未知單雜，其相對含量分別為0.27%與0.61%。為有效控制本品的內在質量，對以上兩個未知單雜的結構、產生機制和鹽酸度洛西汀的穩定性進行了相關考察，確證了以上兩個未知雜質是鹽酸度洛西汀在酸性條件下產生的兩個類Hofmann-Martius重排產物，雜質1(圖1-B)為萘酚環的對位重排產物，雜質2(圖1-C)是萘酚環的鄰位重排產物，其化學結構式分別見圖1。因二者的產生與酸性條件有關，故隨后考察了結晶過程合適的pH和溫度，結果顯示在50 ℃以下、pH 3 ～ 7 的條件下鹽酸度洛西汀幾乎不會發生分解。結合穩定性考察結果及實際的生產工藝條件，選擇丙酮作為結晶溶劑進行了重結晶實驗，結果顯示得到鹽酸度洛西汀成品的純度顯著提升，且收率達到了85%以上。

Figure 1 Structure of duloxetine hydrochloride (A), para-rearrangement product (B) and ortho-rearrangement product (C)

1 儀器與試藥

戴安Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；Agilent LC-MS 6120液質聯用儀、Agilent 1260&6545 Q-TOF 四極桿飛行時間液質聯用儀、400-MR DD2 核磁共振波譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

鹽酸度洛西汀原料藥（批號：JSW-1051-31-01、2935-19-008、SYP-1595-05-03、20081-23-094PV，浙江華海藥業股份有限公司）；甲醇[色譜純，批號：WXBD5460V，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]；乙腈[色譜純，批號：21035178，霍尼韋爾貿易（上海）有限公司]；二甲基亞砜（色譜純，批號：21B4345）、N，N′-二甲基甲酰胺（色譜純，批號：20E3588）、二氯甲烷（ 色譜純，批號：K53445844124）、N-甲基吡咯烷酮（色譜純，批號：K51223597912) (美國默克公司）；異丙醇（色譜純，批號：21C6220）（美國ROE公司）；其他試劑均為市售分析純。

2 實驗條件

兩個重排產物是在不同批次的鹽酸度洛西汀生產過程中發現的，為了保證兩個產物各自的響應和分離度，在對以上兩個重排產物進行質譜分析時，采用了不同的分析方法。

2.1 雜質1分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6 mm × 150 mm, 3.5 μm)；柱溫為40 ℃；檢測波長為230 nm；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；流動相：混合液(10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈，85∶15) (A)-乙腈(B)，洗脫程序如下：0 ～ 5 min, 0%B; 5 ～ 20 min, 0% ～ 80% B; 20 ～ 25 min, 80% B;25 ～ 25.1 min, 80% ～ 0% B; 25.1 ～ 30 min, 0% B。

2.1.2 質譜條件 在ESI 源正離子模式下進行檢測，掃描范圍m/z100 ～ 400。干燥氣流速為10 L/min，鞘氣流速為12 L/min；干燥氣溫度為320 ℃，鞘氣溫度為350 ℃；Fragmentor 電壓為60 V，噴嘴電壓為600 V，毛細管電壓為3 500 V；霧化氣壓力為60 psi (1 psi = 6.895 kPa)；采集帶寬為4 amu；采集速率為1 spectrum/s；二級碰撞能量為30/40/50 eV。

2.1.3 供試品溶液配制 取樣品3 mg，精密稱定置于10 mL 量瓶中，加入溶劑（甲醇-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度。

2.1.4 酸降解條件 取樣品5 g，溶解于乙酸乙酯100 mL，加入濃鹽酸2 mL，于40 ℃條件下反應45 min，反應完成后，將反應液旋干，稀釋后進樣檢測。

2.1.5 核磁共振檢測條件 核磁共振信息在Varian 400 MHz核磁共振波譜儀上測定，質子頻率為400 MHz，實驗的溫度控制在23 ℃，溶劑氘代為二甲基亞砜。

2.2 雜質2分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6 mm × 150 mm, 3.5 μm)；柱溫：40 ℃，檢測波長230 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；流動相：緩沖液(氨水0.2 mL 加入水1 000 mL 用三氟乙酸調pH至3.0)-乙腈(70∶30)，運行時間為20 min。

2.2.2 質譜條件 在ESI 源正離子模式下進行檢測，掃描范圍m/z50 ～ 1 700。干燥氣流速為12 L/min，鞘氣流速為12 L/min；干燥氣溫度為300 ℃，鞘氣溫度為320 ℃；Fragmentor電壓為70 V，噴嘴電壓為600 V，毛細管電壓為3 500 V；霧化氣壓力為60 psi；采集帶寬為4 amu；采集速率為1 spectrum/s；二級碰撞能量為30/40/50 eV。

2.2.3 供試品溶液配制 取20 mg 樣品，精密稱定置于5 mL 量瓶中，加入溶劑（乙腈-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度。

2.2.4 核磁共振檢測條件 核磁共振信息在核磁共振波譜儀上測定，質子頻率為400 MHz，實驗的溫度控制在23 ℃，溶劑為氘代氯仿。

2.3 兩個類Hofmann-Martius 重排產物的穩定性考察試驗

2.3.1 加熱條件及不同溶劑條件中產物分布考察

（1）條件1：60 ℃取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL 頂空瓶，平行稱取9 份，分別加入水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、N,N′-二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮和異丙醇10 mL，壓蓋密封，混勻后置于60 ℃條件下加熱反應，于15 h 和24 h分別取樣檢測。

（2）條件2：80 ℃取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL 頂空瓶，平行稱取9 份，分別加入水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、N,N′-二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮和異丙醇10 mL，壓蓋密封，混勻后置于80 ℃條件下加熱反應，于5、8、15、20和24 h分別取樣檢測。

2.3.2 白光光照條件下產物分布考察 取樣品30 mg，精密稱定置于透明塑封袋，平行稱取9 份，塑封，置于平均照度為8 390.4 lx 的白光光照條件下，分別于1、2、3、5、7、10、15、18、25 d 時取出，置于25 mL 量瓶中，用溶劑（乙腈-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度，后取出250 μL 加入溶劑750 μL 稀釋為0.3 g/L。

2.3.3 紫外光照條件下產物分布考察

（1）鹽酸度洛西汀固體原料藥：取樣品30 mg，精密稱定置于透明塑封袋，平行稱取3份，塑封，置于平均照度為1 377.4 mW/cm2的紫外光照條件下，分別于1、2、3 d 時取出，置于25 mL 量瓶中，用溶劑（乙腈-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度，后取出250 μL加入溶劑750 μL稀釋為0.3 g/L。

（2）鹽酸度洛西汀溶液：取樣品30 mg，精密稱定置于比色皿中，加入溶劑（乙腈-水，75∶25） 10 mL 溶解，置于平均照度值為1 377.4 mW/cm2的紫外光照條件下反應，于1、2、3 d 時分別取出100 μL加入溶劑900 μL稀釋為0.3 g/L。

2.3.4 高溫固態條件下產物分布考察 取樣品300 mg，精密稱定置于20 mL 稱量瓶中，平行稱取6份，置于80 ℃條件下，分別于1、2、3、8、10、15 d時取出，置于100 mL 量瓶中，用溶劑（乙腈-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度，后取出100 μL 加入溶劑900 μL稀釋為0.3 g/L。

2.3.5 高溫高濕固態條件下產物分布考察 取樣品300 mg，精密稱定置于20 mL 稱量瓶中，平行稱取6 份，置于80 ℃、75% RH 條件下，分別于1、2、3、8、10、15 d 時取出，置于100 mL 量瓶中，用溶劑（乙腈-水，75∶25）溶解后稀釋至刻度，后取出100 μL加入溶劑900 μL稀釋為0.3 g/L。

2.4 pH和溫度考察

取適量丙酮溶液4 份，分別調pH 至1.2、2.5、3.5、7，備用。

取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL頂空瓶中，平行稱取4 份，分別用pH 為1.2、2.5、3.5、7 的丙酮溶液稀釋至2 mg/mL，置于室溫下反應6 h。

取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL頂空瓶中，平行稱取4 份，分別用pH 為1.2、2.5、3.5、7 的丙酮溶液稀釋至2 mg/mL，置于40 ℃下反應6 h。

取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL頂空瓶中，平行稱取4 份，分別用pH 為1.2、2.5、3.5、7 的丙酮溶液稀釋至2 mg/mL，置于50 ℃下反應6 h。

取樣品20 mg，精密稱定置于20 mL頂空瓶中，平行稱取4 份，分別用pH 為1.2、2.5、3.5、7 的丙酮溶液稀釋至2 mg/mL，置于60 ℃下反應6 h。

2.5 重結晶實驗

取鹽酸度洛西汀粗品2 g，精密稱定于250 mL圓底燒瓶中，加入丙酮200 mL，加熱使其完全溶解，2 h 內緩慢冷卻至室溫，接著繼續冷卻至5 ℃左右，繼續析晶1 h，過濾，濾餅用冷卻至5 ℃的丙酮10 mL洗滌，烘干。

3 結果與討論

3.1 雜質1（對位重排產物）及雜質2（鄰位重排產物）定位分析

采用原始色譜分析方法采集的鹽酸度洛西汀樣品的色譜圖（圖2-A）中，度洛西汀在15.8 min 出峰，在6.5min 處出現一個未知單雜，含量為0.27%，為了表述方便，將該雜質命名為雜質1。采用原始色譜分析方法采集的某一批次的鹽酸度洛西汀樣品的色譜圖（圖2-B）中，度洛西汀在16.3 min 出峰，在11.9 min 處出現一個未知單雜，含量為0.61%，為了表述方便，將該雜質命名為雜質2。由于原始色譜分析方法不適用于質譜檢測器，并且為了保證這兩個未知雜質各自的響應和分離度，針對兩個批次的樣品分別開發了新的液質聯用分析方法，即實驗條件中的雜質1 分析方法和雜質2分析方法。

Figure 2 UV chromatogram of duloxetine hydrochloride

3.2 雜質1（對位重排產物）結構解析

采用液質聯用分析方法對鹽酸度洛西汀樣品分析時，通過采集該雜質的質譜信息，得知其[M+H]+的精確質荷比為m/z298.122 7，匹配分子式為C18H20NOS，匹配誤差為11 × 10-6，分子式與度洛西汀相同，由此可確定，該雜質為度洛西汀的同分異構體。

由于雜質1于度洛西汀成鹽過程中生成，在該步成鹽工序中，有鹽酸的加入，同時度洛西汀分子中噻吩環芐位含有一個萘酚醚基團，在酸性條件下容易發生醚鍵斷裂并重排，因此懷疑雜質1的生成與酸有關，于是進行了相關的酸降解實驗。通過酸降解，在相同的保留時間產生了大量降解產物，含量為29.1%，該降解產物的[M+H]+的精確質荷比為m/z298.122 7，匹配分子式為C18H20NOS，誤差11 × 10-6。先后采集了該降解物與目標雜質的紫外吸收光譜圖和二級質譜數據，結果顯示完全一致，具體數據見表1。綜上可以確認度洛西汀酸降解的目標降解物與鹽酸度洛西汀粗品中的雜質1為同一化合物。

Table 1 Comparison of LC-UV-MS data of duloxetine and impurity 1

隨后分離了該雜質，并對其進行了核磁共振檢測，1H NMR和13C NMR譜歸屬的碳氫信號數據見表2。對照專利中的相關記載[3]，確定該雜質為度洛西汀酸降解后的類Hofmann-Martius 對位重排產物。同時，對此雜質1的二級碎片及度洛西汀的二級碎片解析，也能支持目標雜質為度洛西汀的類Hofmann-Martius 對位重排物的結論。度洛西汀可能的裂解途徑見圖3，雜質1可能的裂解途徑見圖4。

Figure 3 Proposed mechanism for MS2 fragmentation pathway of duloxetine

3.3 雜質2（鄰位重排產物）結構解析

對鹽酸度洛西汀樣品在原始色譜分析方法中于11.9 min 出峰的雜質進行收集，即雜質2，色譜圖見圖2-B。隨后將收集到的雜質2采用液質聯用分析方法進行檢測，通過采集該雜質的質譜信息，得知其[M+H]+的精確質荷比為m/z298.127 0，匹配分子式為C18H20NOS，匹配誤差為3.4 × 10-6，其分子式與度洛西汀及雜質1均相同，但三者色譜出峰時間差異較大，由此可確定，該雜質為度洛西汀的另一同分異構體。

Figure 4 Proposed mechanism for MS2 fragmentation pathway of impurity 1

首先將該雜質與度洛西汀的紫外吸收光譜圖進行了對比，見圖5，發現該雜質與度洛西汀的紫外吸收較為相似，二者最大吸收波長分別都在215 nm和235 nm 左右，并且都在290 nm 左右有一個弱吸收。接著將該雜質和度洛西汀的二級質譜圖進行對比，發現二者含有大量相同的碎片離子，如m/z239.052 5，m/z221.042 7，m/z183.080 9，m/z157.065 2。結合雜質1 的產生原因分析，推測鹽酸度洛西汀在酸性條件下除了會產生其萘酚環對位重排產物外，還會產生萘酚環鄰位重排產物，即在萘酚中間態與烷基噻吩正離子發生親核結合時，除發生對位重排反應外，應該還會發生鄰位重排。結合雜質2 的結構解析推測雜質2 可能為度洛西汀的鄰位重排產物。

為了確定該雜質的結構，分離并制備了該雜質，對其進行了核磁共振檢測，1H NMR 和13C NMR譜歸屬的碳氫信號數據見表2。通過對1H NMR 譜和13C NMR 譜進行分析，可以確定雜質2 即是度洛西汀的類Hofmann-Martius鄰位重排產物，為雜質1的同分異構體。雜質2可能的裂解途徑見圖6。

Table 2 1H NMR and 13C NMR data of the para-rearrangement product

Figure 5 Comparison of UV spectra between duloxetine (A) and impurity 2 (B)

Figure 6 Proposed mechanism for MS2 fragmentation pathway of impurity 2

通過1H NMR、13C NMR譜分別對雜質1和雜質2進行解析，具體解析過程如下：通過對13C NMR譜進行分析，發現這兩個化合物與度洛西汀相同，均含有18 個碳原子，包括1 個甲基碳信號，2 個亞甲基碳信號，1 個烷基次甲基碳信號，5 個季碳信號，同時含有9個芳基次甲基碳信號，但這兩個化合物5-位上的碳原子信號相比度洛西汀明顯向高場移動，說明5-位上的碳原子可能已經不再和氧原子相連，具體的13C 譜信號見表2。1H NMR 譜中顯示化合物含有與相應碳原子對應的17 個質子信號，通過其化學位移、積分，確定這兩個化合物均含有3 個甲基氫原子，2 組亞甲基氫原子（共4 個氫原子）、1個烷基次甲基氫原子以及9個芳基次甲基氫原子信號，這與13C譜信號相符，同時發現羥基和氨基位置的活潑氫沒有出峰。同時結合文獻數據[3]，確定雜質1 和雜質2 分別為度洛西汀的對位和鄰位的取代產物。

Table 3 1H NMR and 13C NMR data of the ortho-rearrangement product

3.4 兩種類Hofmann-Martius 重排產物的穩定性考察結果

經過以上條件的考察，兩個重排產物主要的產生情況如下：鹽酸度洛西汀80 ℃條件下以水為溶劑反應至5 h 時，就產生了兩種類Hofmann-Martius 重排產物，對位和鄰位重排產物的含量分別為2.21%和11.03%；反應至8 h 時產生的兩種重排產物的含量分別為3.75%和20.23%；至15 h 時，度洛西汀已出現降解過度現象，二者的含量分別為8.82%和39.01%。以甲醇為溶劑的條件下反應至8 h 時產生的對位和鄰位重排產物的含量分別為0.44%和0.24%；反應至24 h 時，二者的含量分別達到了1.49%和0.79%。以乙腈為溶劑反應至8 h 時產生了含量為0.16%的對位重排產物；反應至24 h 時，二者的含量分別為0.61%和0.26%。以異丙醇為溶劑時，反應至24 h 時，兩種重排產物的含量分別為0.71%和0.11%。兩種重排產物在以水、甲醇、乙腈和異丙醇為溶劑在60 ℃條件下的含量隨時間的變化趨勢分別見圖7-A 和圖7-B；在80 ℃條件下的含量隨時間的變化趨勢分別見圖7-C和圖7-D；在60 ℃和80 ℃條件下以其他試劑作溶劑時，二者均沒有產生；鹽酸度洛西汀溶液在紫外燈下反應至第3 天時有少量對位重排產物產生；鹽酸度洛西汀固體原料藥在高溫高濕（80 ℃、75% RH）條件下反應至第10天時有少量的對位重排產物的產生；在其他的考察條件下均沒有目標雜質的產生。

對以上考察結果進行分析，兩種重排產物的產生可能與水等質子性溶劑有關，與溶劑的質子化程度呈正相關，且二者的產量隨溫度的升高而增大，如在現有的考察條件下，在80 ℃以水為溶劑時，兩種重排產物的含量最大。這一結論正好與兩種重排產物的產生條件與酸有關的推測相契合，鹽酸度洛西汀的鹽酸部分在質子性溶劑中會以游離態的形式存在，為重排反應的發生提供了必要的酸性環境，溫度升高則可以加劇反應的進行。同時，對非質子性溶劑也進行了考察，發現其中乙腈雖然為非質子性溶劑，但是有文獻報道，乙腈中含有少量的氫氰酸存在[4-5]，故乙腈中也存在一定的酸性條件，這可能是兩種類Hofmann-Martius重排產物在乙腈中也有少量生成的原因。鹽酸度洛西汀固體原料藥在高溫高濕（80 ℃、75% RH）條件下有少量的對位重排物的產生，提示藥物穩定性研究過程中，對位重排物雜質可能會增長，需要關注在存儲過程中該雜質是否有超標的風險。

3.5 兩個類Hofmann-Martius 重排產物可能的產生機制

對于以上兩個類Hofmann-Martius 重排產物，Arava 等[6-7]發表過的關于度洛西汀在酸性條件下發生重排反應的報道，該報道顯示，度洛西汀在某些條件下可以發生類Hofmann-Martius 重排反應，生成以對位取代產物為主并且有少量鄰位取代產物產生的萘酚類重排產物，但在論文中只提到此兩個重排產物是在某些極端的破壞性條件，比如在特定溶劑及Lewis 酸三氯化鋁或三氟化硼存在時可以產生，但這兩個試劑在實際工藝中并未使用到，與實際工藝條件下重排產物的產生情況有很大的不同，并且此論文也未對雜質的產生機制進行研究，因此研究工藝條件下重排產物產生條件及其產生機制研究具有重要的現實意義。

在本論文的研究中，先是對實際生產過程中遇到的兩個重排產物的結構進行了解析，后又考察了在不同溫度及不同溶劑中、相關固態降解條件下兩個重排產物的分布情況，以上研究對鹽酸度洛西汀的實際生產具有重要參考意義，同時，也對此兩個重排物的產生機制進行了深入研究。實驗結果表明，兩個重排產物的產生與酸性環境密切相關，在酸性條件下，度洛西?。?）中萘酚醚基團的醚氧鍵發生斷裂，接著產生的萘酚中間態（2）和烷基噻吩正離子中間態（3），由于產生的烷基噻吩正離子中間態（3）具有很強的親電性，將分別在萘酚環的鄰位和對位的對萘酚中間體（2）發生親核進攻產生兩個同分異構體（4和5）。度洛西汀對位重排產物和鄰位重排產物的產生機制分析見圖8。

Figure 7 Level of para-rearrangement product and ortho-rearrangement product in each solvent with time at different temperature A: Level of pararearrangement product in each solvent with time at 60 °C; B: Level of ortho-rearrangement product in each solvent with time at 60 °C; C: Level of pararearrangement product in each solvent with time at 80 °C; D: Level of ortho-rearrangement product in each solvent with time at 80 °C

3.6 pH范圍和溫度考察結果

當使用丙酮當溶劑時，在常溫、40 ℃、50 ℃條件下，同時pH 為2.5、3.5、7時，鹽酸度洛西汀分子非常穩定，無降解雜質產生；而當pH 為1.2 時，在40 ℃、50 ℃條件下，可以發現鹽酸度洛西汀均會發生降解產生大于0.5%的重排雜質1 及重排雜質2，同時也會產生大量的其他雜質。因此，在丙酮當結晶溶劑的條件下，pH 大于2.5 可以保證鹽酸度洛西汀不會發生分解。同時，考慮到實際結晶工藝中過量的酸存在條件下，會導致最終成品的酸殘留，并且鹽酸度洛西汀溶解于丙酮本身就呈弱酸性，因此可以確認，采用丙酮當結晶溶劑對鹽酸度洛西汀直接進行重結晶，既可保證雜質去除效果，又能有效避免鹽酸度洛西汀降解產生這兩個重排雜質。

3.7 重結晶實驗結果

根據“2.5”項部分對鹽酸度洛西汀粗品進行了重結晶研究，根據前期的實驗結果，發現用丙酮當溶劑，且pH 在2.5 ～ 7 之間，鹽酸度洛西汀的穩定性非常高，幾乎完全不會降解產生這兩個重排雜質及其他雜質。在重結晶實驗中，起始物料鹽酸度洛西汀粗品的純度為99.0%，重排雜質1含量為0.25%，重排雜質2的含量為0.20%，重結晶之后樣品的純度為99.6%，重排雜質1 及重排雜質2 的含量均低于0.05%，收率為87%，結合兩個重排產物的溶劑考察結果、重結晶實驗結果以及生產工藝的可行性等因素，最終選擇了非質子性溶劑丙酮作為了實際生產工藝的結晶溶劑。

Figure 8 Proposed pathway for the formation of the para-rearrangement product (impurity 1) and the ortho-rearrangement product (impurity 2) in duloxetine hydrochloride

4 總 結

本研究對鹽酸度洛西汀生產過程中發現的雜質1 和雜質2 進行了結構解析，結果證實兩個雜質分別為鹽酸度洛西汀成鹽過程中，萘酚醚鍵斷裂，并在萘酚環對位和鄰位發生重排產生的同分異構體；同時對兩個重排產物的穩定性和產生條件進行了考察，結果表明兩個重排產物的產生與酸性條件及質子性溶劑的存在密切相關，并且這兩個重排產物的產生受溫度影響也非常大。在生產過程中這兩個重排產物的發現，提示在鹽酸度洛西汀生產工藝中應重點關注度洛西汀成鹽過程中的pH 和溫度變化，最終篩選出了有效的結晶溶劑丙酮，并將反應pH 控制在3 ～ 7，反應溫度控制在50 ℃以下，以將兩個重排產物的含量控制在相關指標之下，從而保證鹽酸度洛西汀成品的質量。