朱砂體內汞暴露與幼鼠記憶功能障礙的相關性

胡趙良，鄒文宇，宋 敏，杭太俊，陸宇婷

（中國藥科大學藥物分析系，南京 210009）

朱砂(Cinnabaris)是傳統礦物類中藥材，主含硫化汞(α-HgS > 98%)，性味甘，微寒，歸心經。因其具有鎮驚安神之功效，朱砂常配伍用于兒童中成藥中，用于治療小兒高熱、小兒驚風等[1]143?！吨腥A人民共和國藥典》（2020 版）收載了35 種含朱砂兒科制劑，如小兒驚風散、小兒至寶丸、小兒清熱片等[1]。

汞是公認的有毒重金屬，各種形式的汞化合物都可能造成體內汞暴露量增高，引發毒性反應[2]。朱砂作為含汞中藥材，不合理使用導致的汞中毒事件時有報道[3-5],使其安全性備受質疑。兒童作為特殊的用藥群體，對汞化合物的毒性尤為敏感，因此含朱砂兒童專用制劑的臨床使用應當更為慎重。汞的毒性累及人體各個器官，對中樞神經系統損害尤甚[6]。對于處在發育階段的兒童，長期高水平的汞暴露可引起神經發育障礙，包括記憶功能障礙、兒童自閉癥、注意力缺陷、閱讀及運動障礙等[7-8]。其中記憶功能障礙是兒童汞中毒后較為常見的一種表現，即使擺脫汞暴露，記憶功能也不易恢復[9]。

雖然朱砂的水溶性與口服生物利用度極低，毒性遠小于其他形式的汞化合物，但已有研究表明，復方配伍與胃腸道消化作用能顯著增加機體對朱砂中汞的吸收，并促進汞進入大腦[10]。此外，兒童的血腦屏障發育不完善，更易受有害重金屬的影響[11]，極大地增加了含朱砂兒童專用制劑引發記憶功能障礙的風險。

因此，本研究以幼年大鼠為實驗對象，使用冷原子-原子熒光光譜法(CV-AFS)測定幼鼠灌胃給予低、中、高劑量水平朱砂后不同發育階段的血汞暴露量，觀察海馬神經元形態變化，測試大鼠的記憶功能，并利用相關性分析揭示朱砂與記憶功能障礙間的劑量－血汞暴露量－毒性效應關系，從而為含朱砂兒童專用制劑的臨床合理使用提供科學指導與理論依據。

1 材 料

1.1 試 劑

朱砂（鳳凰縣紅飛藥用朱砂有限責任公司，批號：20190401，硫化汞含量：98.8%，總汞含量：0.85 mg/mg，可溶性汞鹽小于0.10%，符合《中華人民共和國藥典》2020 年版一部“朱砂”項下的要求[1]143），汞單元素標準物質（中國計量科學研究院，批號：19041）。其余試劑均為市售分析純試劑。

1.2 儀 器

AF-640A 冷原子-原子熒光光譜儀（北京瑞利分析儀器有限公司）；AF-2型汞元素熒光空心陰極燈；Morris 水迷宮設備、Xeye Aba V3.2 動物行為軌跡視頻分析系統(北京天鳴宏遠科技發展有限公司)；正置顯微鏡（德國Leica 公司）；BS21S 分析天平（德國Sartorius 公司）。所有玻璃儀器均使用20%硝酸浸泡24 h以上，并用超純水洗凈。

1.3 動 物

清潔級SD 幼年大鼠32 只(雌性，3 周齡，體質量為50 ± 2 g，浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（浙）2019-0001)，在清潔級無汞環境下飼養，每個鼠籠4 只大鼠。飼養室溫度（24 ± 1）℃，相對空氣濕度40% ～ 45%，12 h/12 h 光照/黑暗交替，自由飲水攝食。所有動物實驗操作均經過中國藥科大學動物倫理委員會批準（批號：2020-03-007），符合實驗室動物飼養和使用指導原則。

2 方 法

2.1 實驗動物分組與處理

大鼠適應性喂養3 d后按體質量隨機分為4個劑量組：對照組(C group)、朱砂低劑量組(L group)、中劑量組(M group)、高劑量組(H group)，每組8 只。根據《中華人民共和國藥典》規定的朱砂最高攝入限度0.5 g/d[1]143，按人鼠間體表面積折算大鼠劑量約為50 mg/kg，設置為低劑量，該劑量的5 倍(250 mg/kg)、20倍(1 000 mg/kg)分別為中、高劑量。對照組灌胃給予0.5%CMC-Na 水溶液，朱砂組分別灌胃給予朱砂混懸液（50 mg，250 mg，1 000 mg/kg；以0.5%CMC-Na 水溶液作為混懸介質），每日1 次，連續灌胃14周。

每日記錄大鼠體質量、飲水量、攝食量，觀察大鼠狀態；分別于第8周、10周、12周、14周末次給藥24 h 后，眼內眥靜脈叢取血0.3 mL 至含有肝素鈉的離心管中，混勻，置-80 ℃保存待測；于第13 周進行Morris 水迷宮實驗；于第14 周末次給藥24 h后，腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉大鼠，暴露胸腔，心臟灌注生理鹽水約250 mL，低溫條件下取大鼠腦組織，稱重后置于4%多聚甲醛中固定24 h。

2.2 大鼠血汞暴露量的測定

2.2.1 大鼠全血樣品前處理 取全血0.2 mL，置50 mL凱氏燒瓶中，加入HNO3-HClO4(4∶1) 5 mL，混勻，過夜。于120 ～ 140 ℃加熱消解2 h，保持微沸，必要時補加HNO3適量，加熱至溶液澄清透明，溶液體積約1 mL，停止加熱，放冷。用5%HNO3-0.05% K2Cr2O7轉移至10 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。同法制備空白溶液。

2.2.2 冷原子-原子熒光光譜檢測條件 以2%HNO3溶液為載流；0.1%KBH4-0.2%KOH 水溶液為還原劑；蠕動泵轉速為100 r/min；PMT 負高壓為-270 V；主燈電流為30 mA；原子化器溫度為200 ℃（冷原子，低溫）；載氣氬氣流量為400 mL/min；輔助氣流量為400 mL/min；原子化器高度為7mm；連續流動程序為：進樣(8 s)；停泵(4 s)；注入(25 s)；停泵(1 s)；以峰面積定量，峰形對稱且平滑。

2.3 大鼠海馬組織形態學病理檢測

固定后的腦組織經脫水透明，石蠟包埋后切片，切片厚度為3 μm，烘干脫蠟后進行HE染色，對切片進行脫水透明，用中性樹膠封片。在正置顯微鏡下觀察和拍攝。

2.4 Morris水迷宮實驗

Morris 水迷宮實驗在直徑150 cm，高60 cm 的宮體中進行，宮體被平均分為4個象限，并在第4象限（目標象限）放置直徑為10 cm，高為30 cm 的平臺，水溫為23 ～ 25 ℃。Morris 水迷宮實驗過程分為連續6 d的定位航行實驗和第7天的空間探索實驗兩部分。定位航行實驗期間，設置平臺可見，訓練大鼠對平臺位置的記憶，每天訓練2 次，每次游泳時間為90 s；空間探索實驗期間，撤去平臺，測試大鼠的記憶能力，分別記錄90 s 內大鼠平臺潛伏期、目標象限潛伏期、平臺停留時間、目標象限停留時間、目標象限停留總時間（平臺停留時間 + 目標象限停留時間）以及穿臺次數。

2.5 統計分析

所有數據以±s表示，使用SPSS 23軟件進行兩組之間的雙尾獨立樣本Student’st-test、Spearman 相關性分析與Pearson 相關性分析，當P<0.05 時具有統計學意義。使用GraphPad Prism 8軟件繪制結果統計圖，使用R 語言Pheatmap 包繪制相關性熱圖。

3 結 果

3.1 朱砂對幼年大鼠生長發育、體質量及腦組織臟器系數的影響

給藥期間，各組大鼠飲水攝食正常，生長發育情況良好，未見明顯中毒癥狀。如圖1 所示，各組大鼠體質量增長速度接近，無統計學差異；給藥結束后，剝取腦組織，稱重，計算臟器系數（腦重/體質量 × 100），無統計學差異。

3.2 大鼠灌胃朱砂后血汞暴露量檢測

3.2.1 大鼠血汞暴露量檢測方法學驗證 對建立CV-AFS 血汞暴露量測定方法進行了線性、專屬性、精密度、回收率、穩定性考察。以全血系列標準樣品熒光峰面積(Y)對血汞暴露量(C, ng/mL)進行回歸。典型回歸方程為Y= 32.26C+ 52.86，相關系數r= 0.999 6。結果表明，血汞暴露量在5 ～ 80ng/mL 的范圍內線性關系良好，定量限濃度為5 ng/mL。分別配制低、中、高3個質量濃度水平(10、35、60 ng/mL)的全血總汞標準樣品各6份，同法操作并測定。結果表明，本法測定大鼠血汞暴露量的專屬性良好，內源性物質對測定無干擾；低、中和高濃度樣品的批內和批間精密度良好（RSD 均小于15%）；加樣回收率在91.68% ～ 109.1%之間。全血樣品在-80 ℃冰箱冰凍保存30 d，反復凍融3次，消解結束后室溫放置2 d 的穩定性均良好，適用于血汞暴露量的測定。

3.2.2 大鼠血汞暴露量測定結果 各組大鼠不同發育階段的全血總汞濃度如圖2 所示。正常生理條件下，大鼠全血總汞質量濃度范圍在10 ～ 30ng/mL，且全血總汞濃度隨周齡增加而上升[12-13]。實驗結果顯示，隨著給藥時間延長，各劑量組大鼠血汞暴露量呈上升趨勢，在給藥10周內，血汞暴露量顯著升高，繼續給藥2 ～ 4 周，上升速度放緩，趨于平穩，呈現出時間依賴性。低、中、高劑量組大鼠給藥后的血汞暴露量隨朱砂劑量依次升高，并且均顯著高于對照組(P< 0.001)，呈現出明顯的劑量依賴性。

Figure 1 Effect of Cinnabaris on rats’ body weights and brain coefficients (± s, n = 8)

Figure 2 Total mercury concentration in the rats’whole blood samples at different growth phases (± s, n = 8)

3.3 朱砂對幼年大鼠海馬神經元形態結構的影響

各組大鼠海馬CA1 區、CA3 區及DG 區HE 染色結果如圖3 所示。對照組大鼠各區域海馬錐體細胞排列整齊，層次清楚，錐體細胞核大而圓，核仁明顯、數目多；朱砂低劑量組大鼠僅CA3 區錐體細胞出現輕微核固縮；中劑量組大鼠海馬DG 區未見明顯病變，CA1 區、CA3 區均出現不同程度的錐體細胞核固縮，CA3 區較為嚴重，且錐體細胞形態不規則；高劑量組大鼠DG 區同樣未見明顯病變，CA1 區、CA3 區錐體細胞核固縮程度較重、細胞形態不規則，且CA3 區出現錐體細胞排列紊亂的病理改變。

3.4 朱砂對幼年大鼠記憶功能的影響

如圖4 所示，灌胃給予朱砂14 周后，與對照組比較，低、中、高劑量組大鼠平臺停留時間略有縮短，平臺穿越次數減少，但無顯著差異；平臺潛伏期與目標象限潛伏期隨朱砂給藥劑量升高而延長，相較于對照組，中劑量組大鼠平臺潛伏期有顯著差異(P< 0.05)，高劑量組大鼠平臺潛伏期與目標象限潛伏期均有顯著差異(P< 0.05)；目標象限停留時間與目標象限停留總時間則隨朱砂給藥劑量升高而縮短，相較于對照組，中、高劑量組大鼠均有顯著差異(P< 0.05)。長期給予高劑量朱砂可導致大鼠記憶功能受損，劑量越高，對記憶功能的影響越大。

3.5 朱砂與記憶功能障礙的劑量-血汞暴露量-毒性效應相關性分析

對給藥劑量和不同發育階段各組大鼠的血汞暴露量進行Spearman 相關性分析；對各發育階段血汞暴露量與水迷宮實驗指標進行Pearson相關性分析，結果如圖5 所示。結果表明，給藥8 ～ 14 周，大鼠血汞暴露量與朱砂劑量的Spearman 相關系數分別為0.87、0.94、0.95 和0.93，呈現極強的正相關(r> 0.87,P< 0.01)。目標象限潛伏期與給藥8周、12周、14周的血汞暴露量呈現弱到中等程度的正相關(0.36

Figure 3 Effects of Cinnabaris on rats’ morphological features of hippocampal pyramidal neurons by HE staining (× 200)

Figure 4 Effects of Cinnabaris on rats’ memory functions (± s, n = 8)

4 討 論

由于朱砂含有大量重金屬汞，其臨床使用安全性備受關注。歐美等國家和地區對含朱砂中藥按化學藥品重金屬雜質進行嚴格的總汞量控制，并警告公眾警惕其質量不合格以及潛在的毒性風險[14-15]。但是從化學角度分析，朱砂屬于共價化合物，極難溶于水，不易被人體吸收，用總汞量評價朱砂難免會高估其健康風險。本組前期朱砂體外溶出研究表明，在模擬胃腸液中朱砂的生物可利用汞含量僅為0.12 μg/g[16]，在醫生指導下使用，相對安全。但簡單的體外實驗不能完全模擬復雜的體內過程，因此以體內汞暴露量評估朱砂的汞中毒風險更為科學合理。由于體內過高的汞暴露會嚴重損傷兒童的記憶功能，而朱砂引起的兒童汞暴露風險評估卻鮮有報道，《中華人民共和國藥典》對含朱砂兒童專用制劑也缺乏明確的安全限量。因此本實驗以幼年大鼠為對象，圍繞給予朱砂后體內汞暴露量與記憶功能損傷展開研究，為含朱砂兒童專用制劑的合理使用提供科學指導。

為了監測給予朱砂后大鼠體內汞暴露水平，需要選擇準確可靠，容易獲得的生物樣本進行檢測。常用于評價機體汞暴露水平的生物樣本有血液、尿液和毛發[17]。本組前期研究顯示，成年大鼠灌胃朱砂后，極少量的汞能被吸收進入血液，并分布至腦、肝、腎等組織中，并且腦組織中的汞含量隨血汞暴露量上升而增加[10]。此外，血樣可及性高、易采集，本研究選擇血液作為生物樣本，用于評估大鼠體內的汞暴露水平。血液中95%左右的巰基存在于紅細胞，由于Hg2+對巰基有高度的親和力，可迅速結合紅細胞，同時又可與血漿蛋白結合，選擇全血作為研究汞在血液中動態變化規律的檢測對象，使得汞暴露水平監測更加準確可靠。血汞暴露量檢測結果表明，大鼠血汞暴露量呈時間和劑量依賴式增高。前期研究表明，全血與腦組織中汞均表現出消除緩慢的特征[10]，因此在多次給予高劑量朱砂后，汞極易在腦中蓄積，極大地增加了朱砂對中樞神經系統的健康風險。

海馬是大腦組織中負責記憶的關鍵區域，根據神經元形態與排布關系，海馬通常被分為CA1、CA2、CA3和DG 區。海馬神經元從內嗅區發起，沿穿緣通路投射于齒狀回(dentategyrus，DG)顆粒細胞與CA1 區錐體細胞；DG 區顆粒細胞再通過苔狀纖維通路投射于CA3 區錐體細胞；最后由CA3 區錐體細胞發出軸突，通過Schaffer 通路投射至CA1 區錐體細胞，由此構成了海馬的三突觸回路。三突觸回路是記憶形成的結構基礎，其中任何環節突觸聯系的損傷都會影響記憶功能。因此，本研究重點考察了各組大鼠海馬HE 染色中CA1 區、CA3區與DG 區神經元的形態變化，以評價朱砂對記憶功能相關組織結構的影響。病理檢查結果表明，朱砂對DG 區顆粒細胞形態影響較??；而隨著朱砂劑量增高，低劑量組大鼠腦組織CA3 區錐體細胞出現輕微核固縮，中、高劑量組大鼠腦組織CA1 區與CA3 區錐體細胞的病變程度依次加重，呈現劑量依賴性，且CA3 區較CA1 區更為嚴重。海馬組織各區域病變程度的不同可能與神經元類型對汞暴露的敏感程度及組織內汞局部暴露濃度差異有關。

Figure 5 Heatmap of Pearson correlation coefficients between in-vivo mercury exposure at different growth phases andevaluation indicators of Morris water-maze test (n = 8)

Morris 水迷宮實驗廣泛應用于評價動物的空間學習記憶功能。結果表明，朱砂低劑量組大鼠在水迷宮實驗中與對照組大鼠無明顯差異，而朱砂中、高劑量組大鼠的平臺與目標象限潛伏期依次延長，平臺與目標象限停留時間依次縮短，且多數指標與對照組大鼠有顯著差異，并呈現劑量依賴性。HE 染色與Morris 水迷宮實驗的結果，分別從組織結構與記憶功能的角度，共同驗證了長期高劑量的朱砂攝入能夠引起記憶功能障礙的結論。

對朱砂和記憶功能障礙之間的劑量-血汞暴露量-毒性效應關系進行相關性分析，結果表明，朱砂劑量與各個發育階段的血汞暴露量之間均存在極強的正相關性，而血汞暴露量與水迷宮實驗中的4個指標都存在顯著的相關性。由此可以證明，體內過高的汞暴露是朱砂引起記憶功能障礙的主要危險因素，且記憶功能障礙程度與朱砂呈現出劑量－血汞暴露量－毒性效應依賴式增加。

綜上所述，幼年大鼠長期超劑量給予朱砂后，體內汞暴露水平增高，血液中的汞能透過血腦屏障侵入腦組織，破壞海馬組織正常形態結構，影響記憶功能。因此，在含朱砂兒科制劑的臨床使用過程中，應防止超劑量長時間服用，以避免朱砂中汞對兒童大腦記憶功能的損害。