二氫麥角胺改善阿爾茨海默病狀態下的突觸萎縮及其對認知功能的影響

陳佩佩，魏 杰，柳曉泉，劉昊晨

（中國藥科大學代謝動力學研究中心，南京 211198）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經退行性疾病，主要表現為患者的認知功能受損，但其發病機制目前尚不清楚［1-2］。目前已批準的AD 治療藥物對認知功能的改善作用非常有限。因此，學者一直在努力尋找干預AD 的新策略。

越來越多的證據表明，突觸功能損傷或突觸缺失與AD 患者認知受損顯著相關［3］，這提示通過改善突觸萎縮治療AD 認知障礙可能是一種潛在的新策略。有研究表明狐猴酪氨酸激酶1（lemur tail kinase1，LMTK1）是影響突觸生長的關鍵性激酶，周期依賴性蛋白激酶5（CDK5）在Ser-34 處磷酸化LMTK1，磷酸化的LMTK1 調控其下游蛋白TBC1D9B，進而負向調控GTP 酶Rab11A 介導的突觸生長，CDK5-LMTK1-TBC1D9B-Rab11A 級聯反應是一種調節核內體轉運和突觸形成的新的信號通路［4］。抑制LMTK1 可以明顯改善突觸萎縮，但尚未研究LMTK1 改善突觸萎縮對認知功能的影響［5］。本研究采用計算機虛擬篩選的方法發現二氫麥角胺（dihydroergotamine， DHE）可以抑制LMTK1 的活性并可通過血腦屏障［6］，故選擇DHE來探究其對突觸萎縮的改善作用及其對認知功能的影響。早在20 世紀70 年代就有臨床研究報告了麥角生物堿制劑安得靜（hydergine）治療老年性腦萎縮的臨床病例，隨后hydergine 被廣泛應用于老年人認知、情感障礙［7］。Kemali 等［8］發現麥角酸二乙胺可以提高突觸密度并改善突觸形態。DHE是一種生物活性較高的麥角生物堿衍生物，它對認知、記憶處理和運動控制可能具有調節作用［9-10］。本研究采用快速老化的AD 模型小鼠SAMP8，探究DHE 對AD 模型小鼠突觸形態、突觸可塑性及認知功能的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

CCK8 試劑（上海翌圣生物科技有限公司）；Western blot 及免疫染色相關試劑、嘌呤霉素（江蘇碧云天生物科技有限公司）；多克隆抗體PSD95、高爾基染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Alexa Fluor?488 山羊抗兔IgG（美國Cell Signaling Technology 公司）；GAPDH 抗體、β Ⅲ-Tubulin 抗體（中國Proteintech公司）；P-TBC1D9B抗體、P-LMTK1抗體（南京金斯瑞公司）；DHE 標準品（美國MCE 公司）；人淀粉樣蛋白1-42（吉化生物公司）；PCR 相關試劑（南京諾維贊生物科技有限公司）；其余試劑 均為市售分析純。

1.2 儀 器

倒置熒光顯微鏡 （日本Olympus 公司）；水迷宮裝置（北京眾實迪創公司）；ANY-maze 動物行為學采集分析軟件（英國Global Biotech 公司）；病理切片機（上海徠卡儀器公司）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；PANNORAMIC 259 全景切片掃描儀（匈牙利3dhistech 公司）；SynergyTMH1 全功能微孔板檢測儀（美國伯騰有限公司）；冰凍切片機，QuantStudio3 實時熒光定量PCR 系統（美國Themo公司）；電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；多功能凝膠成像系統（中國Tanon公司）。

1.3 細胞與動物

鼠源神經母細胞瘤細胞C17.2細胞，購自北京北納創聯生物技術研究院；SPF級雄性衰老加速小鼠耐藥1（senescence-accelerated mouse resistant 1，SAMR1）和衰老加速易感小鼠品系8（senescenceaccelerated prone mouse strain 8，SAMP8），3 月齡，購于武漢有度生物公司，生產許可證號SCXK（鄂）2021-0025。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 動物分組與給藥

AD 模型小鼠SAMP8 和對照小鼠SAMR1，適應性飼養1 個月，4 月齡時，將SAMP8 小鼠隨機分為3 組（每組12 只），包括疾病組（SAMP8）、SAMP8+1 mg/kg DHE 組，以及SAMP8+2 mg/kg DHE 組。相同月齡的SAMR1 小鼠（n =12）作為正?？瞻讓φ战M（blank-SAMR1）。小鼠腹腔注射給藥，每天1 次，連續給藥8 周后，進行后續實驗。DHE的給藥劑量和周期參照文獻［11］。

2.2 Western blot實驗

給藥完成后，每組隨機挑選3 只，處死，取海馬，進行Western blot 實驗（抗P-LMTK1，1∶2 500，抗P-TBC1D9B，1∶800），用凝膠圖像系統記錄結果。通過Image J軟件分析結果。

2.3 Morris water maze水迷宮實驗

每組剩余9 只小鼠進行水迷宮實驗。實驗流程參照文獻［12］，主要包含：可視化平臺實驗（visible platform trail，D1）、獲得性訓練實驗（acquisition training trail，D2-6）、探索性實驗（probe trail，D7）、反向實驗（reversal trail，D8-D10）。對記錄的指標進行分析，包括逃生潛伏期、平均速度、穿越次數以及在目標象限度過的時間等。

2.4 電生理實驗

水迷宮實驗結束后的小鼠，每組隨機挑選3只麻醉取腦，于ACSF 中利用振動切片機切片放入28 ℃ ACSF 中進行孵育。轉移至記錄槽內，2 mL/min進行灌流。刺激腦片海馬Schaffer側枝，在CA1輻射層樹突記錄得到興奮性突觸后電位（EPSP）。雙鎢絲電極刺激脈沖（0.1 ms）每隔15 秒進行1 次，強度為0.5 mA。使用Axoclamp 2B amplifier在20 kHz采樣，10 kHz過濾后輸出。使用Digitdata 1200 進行數字信號轉換?；€條件：每分鐘4 次，波寬0.1 ms，持續記錄10 min。使用一個高頻刺激（high frequency stimulation，HFS，100 Hz）產生長時程增強（long-term potentiation，LTP），并在HFS后持續記錄40 min。采用pCLAMP 10.0分別測量EPSP起點和終點與負峰得差值，計算其平均值。LTP誘導成功標志是HFS 后EPSP 的均值不小于基線的120%。

2.5 小鼠腦組織的免疫熒光實驗

“2.4”項中剩余的6只小鼠處死后，取半腦，固定、包埋、切片、脫蠟至水及抗原修復后。進行封閉、一抗孵育（抗PSD95，1∶200）、二抗孵育（Alexa Fluor?488 山羊抗兔IgG，1∶500）、DAPI 染核及封片。使用Pannoramic 掃描儀掃描成像，用Caseviewer 2.4 軟件打開進行觀察。隨后，使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分別測量每張圖片中海馬區域陽性的累積光密度（integrated optical density，IOD）（右1）以及對應的組織像素面積（area），并計算出面密度（areal density，IOD/area）。

2.6 高爾基染色

將“2.5”項下剩余的半腦組織塊經固定、切塊、染色后，于80%的冰醋酸中過夜浸沒，組織變軟后置于30%蔗糖溶液中切片，晾干后進行顯影定影。用Image-Pro Plus 6.0 分別測量每張400 倍圖片中心完整神經元上的第2 或3 樹突分支30 ～90 μm 長度范圍內樹突棘的個數，測量長度及計數該長度內樹突棘數量，以每10 微米樹突棘個數作為其密度 = 樹突棘數量/樹突長度 × 10。使用Image J 1.51K 分析軟件中Neuron J 插件繪制每張400倍圖片中心神經元胞體結構圖，使用Shollanaly插件，以胞體為中心做間距為10 μm 的10 個同心圓，計數樹突與同心圓的交點數，并計算出10個交點數之和。

2.7 細胞毒性CCK8實驗

在96 孔板中以每孔2 × 103接種C17.2 細胞，孵育24 h，向其中加入0，4，40，400，2 000，4 000 nmol/L的DHE稀釋液，每組設6個平行復孔。孵育24， 48， 72 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，于培養箱內孵育3 h，用VersaMax 酶標儀測定450 nm 處的吸收度。

2.8 LMTK1 基因過表達和沉默C17.2 細胞株的構建及效率驗證

dcas9-SAM 轉錄激活系統過表達LMTK1 由吉滿生物科技設計合成。C17.2 細胞以每毫升1.5 ×105個密度接種于6 孔培養板，待細胞匯合30% ～40% 時依次感染dcas9-VP64 慢病毒、MS2-P65-HSF1_Hygro 慢病毒、gRNA-SAM 慢病毒（MOI =30），并在感染后依次使用殺稻瘟菌素（7.5 μg/mL）、潮霉素B（100 μg/mL）、嘌呤霉素（8 μg/mL）進行篩選。進行RT-qPCR 實驗驗證沉默的效率。以GAPDH 作為內參，采用2（-ΔΔ）Ct法計算LMTK1 的相對表達量。

siRNA 靶向LMTK1 的重組慢病毒（LMTK1-siRNA：5′-GCUCAGUGCAGCUCCUCAA-dTdT-3′）和對照慢病毒（Ctrl-siRNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTd-3′）合成于上海漢恒生物科技有限公司。沉默細胞株的構建步驟參考上述過表達細胞株的構建。感染后用8 μg/mL 嘌呤霉素篩選48 h。進行Western blot 實驗驗證轉染效率，兔源LMTK1、兔源β-tubulin 抗體及兔源二抗稀釋比分別為1∶1 000、1∶4 000、1∶4 000。

2.9 C17.2細胞的免疫熒光實驗

取對數生長期的C17.2 細胞，以每孔40 個細胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養4 h，加入分化培養基，繼續培養5 d，每48 小時更換新的分化培養基。第5 天，加藥，繼續培養24 h。固定、通透、封閉后，每孔加入兔源beta-Ⅲ Tubulin 抗體（1∶50）約50 μL， 4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌后，加入Alexa Fluor?488 抗兔熒光二抗（1∶500）約100 μL，避光孵育1 h。DAPI 避光染色5 min，PBST 避光洗滌。觀察并拍照。

2.10 數據統計分析

數據處理使用GraphPad Prism 8.0，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗，P的多重檢驗采用Bonferroni 方法，結果以±s表示，P< 0.05被認為有顯著性差異。

3 結 果

3.1 DHE對AD小鼠海馬區域突觸密度的影響

突觸后密度蛋白95（postsynaptic density 95，PSD95）是突觸后密度區樹突棘的主要支架蛋白，可反映突觸的密度和數量，被認為是突觸后可塑性的生物標志物［13-14］。為探究DHE 對AD 模型小鼠海馬體內突觸密度及可塑性的影響，從各組動物中隨機選取6 只進行海馬體切片及PSD95 熒光染色，由于其中一張切片海馬區域缺失，所以樣本量為5。PSD95的熒光強度統計分析結果如圖1所示：SAMP8小鼠海馬中PSD95陽性細胞平均面密度較SAMR1 組顯著降低（P< 0.05），SAMP8+2 mg/kg DHE 組PSD95 平均面密度明顯升高（P< 0.05vsSAMP8），說明DHE 能夠顯著增加AD 模型小鼠海馬內的突觸密度并改善突觸可塑性。

3.2 DHE對AD模型動物突觸萎縮的影響

樹突棘是興奮性突觸的主要突觸后元素，是記憶和認知的關鍵結構。高爾基染色結果（圖2）顯示，與對照組（SAMR1）相比，AD 模型組小鼠海馬體內樹突棘密度顯著降低（P< 0.05）和分支數量顯著下降（P< 0.01），而DHE 給藥后，樹突棘密度和分支數量得到提高，其中DHE 高劑量組（2 mg/kg DHE）樹突棘密度顯著增加（P< 0.001vsAD 組）以及分支數量顯著提高（P< 0.05vsAD組）。DHE可以顯著改善AD小鼠的突觸萎縮。

3.3 DHE對AD小鼠海馬體突觸可塑性的影響

長時程增強（long-term potentiation，LTP）是突觸可塑性的特定表現形式［15］，本實驗通過測量海馬CA1 區LTP 反映海馬區突觸可塑性的變化，每組3 只小鼠，每只測定2 次，其中一次LTP 誘導失敗，所以樣本量為5。結果表明（圖3），與正常SAMR1 小鼠相比，AD 小鼠（SAMP8）fEPSP 斜率顯著降低（P< 0.000 1），DHE 給藥2 mg/kg 組fEPSP斜率顯著升高，LTP 得到改善，DHE 能改善AD 小鼠海馬的突觸可塑性。

3.4 DHE 對AD 小鼠的認知功能和行為評價的影響

為了探究DHE 對AD 模型小鼠認知功能的改善作用，進行了Morris水迷宮實驗評估小鼠的學習記憶能力。第1天的可視化平臺實驗中，觀察到各組小鼠的逃生潛伏期和游泳速度沒有顯著性差異（P> 0.05），表明各組小鼠的視力和運動能力沒有差別（圖4-A）。獲得性訓練實驗中，隨著訓練天數的增加，AD 組（SAMP8）和SAMP8+1 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期未顯示出規律性變化，對照組（SAMR1）、SAMP8+2 mg/kg DHE 組小鼠的逃生潛伏期逐漸縮短，并且，在訓練的最后一天，SAMP8+2 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期顯著低于AD 組（圖4-B）。探索性實驗結果如圖4-C所示，撤去平臺后，對照組和DHE 高劑量給藥組的小鼠在原平臺所在區域穿越的次數以及所在象限中停留的時間均顯著高于AD 對照小鼠。第10 天的反向實驗（圖4-D）表明，與AD 組相比，對照組以及SAMP8+2 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期顯著降低（P< 0.05）。綜上所述，DHE 改善SAMP8 小鼠的認知功能。

Figure 1 Effect of dihydroergotamine (DHE) on the expression of postsynaptic dense 95 in hippocampus of Alzheimer’s disease (AD) mouse (± s, n = 5)

Figure 2 Effect of DHE on the density of dendritic spines and number of branches in hippocampus of AD mouse (± s, n = 6)

Figure 3 DHE improved impaired hippocampal long-term potentiation (LTP) in AD mice (± s, n = 5)

3.5 DHE 對AD 模型小鼠海馬體內LTMK1 下游蛋白的影響

利用Western blot 實驗探究SAMR1 和SAMP8小鼠海馬體中LMTK1 磷酸化水平的變化以及DHE 對其下游TBC1D9B 磷酸化蛋白（P-TBC）表達的影響。結果如圖5 所示，SAMP8 小鼠海馬組織LMTK1 的磷酸化程度顯著高于SAMR1 小鼠（P<0.01），并且相較SAMR1 小鼠，SAMP8 小鼠海馬體內P-TBC 表達量顯著增加（P< 0.05）。SAMP8 小鼠連續長期給予DHE 后，海馬內P-TBC 表達顯著下降，2 mg/kg DHE 組較1 mg/kg組P-TBC下調更加顯著，DHE 對P-TBC 蛋白的下調作用具有一定的劑量依賴性。

3.6 DHE 對LMTK1 過表達C17.2 細胞突觸萎縮的影響

為研究DHE對C17.2細胞的毒性作用，進行了CCK8 實驗。2 μmol/L 的DHE 給藥達到72 h 時，對C17.2細胞無顯著毒性作用，細胞存活率為92%。

利用基因轉錄激活技術CRISPR-SAM 系統構建LMTK1 過表達的C17.2 細胞株，研究DHE 對LMTK1 過表達的神經祖細胞突觸長度的影響。利用RT-qPCR測定3種穩轉株的基因過表達效率，如圖6 轉錄激活LMTK1 表達的效率為對照組的200% ～ 350%，選擇轉染效率最高的sgRNA3 進行免疫熒光實驗，探究DHE 對已分化細胞突觸長度的影響。結果顯示（圖6-B），當LMTK1 過表達，神經祖細胞C17.2 分化的突觸長度相較于野生型細胞明顯降低（P< 0.05）。與過表達細胞單獨給予Aβ1-42相比，過表達細胞DHE 給藥后突觸長度顯著增加（圖6-C，P< 0.05）。表明DHE 對LMTK1過表達的C17.2細胞突觸萎縮具有改善作用。

3.7 LMTK1 沉默后DHE 對C17.2 細胞突觸萎縮的改善作用

為了驗證DHE 是否通過抑制LMTK1 的活性發揮神經突觸的改善作用。本研究通過對神經細胞C17.2 進行si-LMTK1 干擾，建立LMTK1 基因沉默的細胞株。圖7 為Western blot 實驗檢測C17.2細胞內LMTK1 蛋白的沉默效率，其沉默效率為對照組的50%。沉默細胞系構建完成后，給予DHE，進行體外細胞免疫熒光實驗，研究LMTK1沉默情況下DHE 對Aβ1-42誘導的突觸萎縮的影響。沉默LMTK1 后，Aβ1-42和DHE 同時給藥后，突觸長度沒有顯著性改變。以上結果表明，當LMTK1沉默后，DHE 對抗Aβ1-42誘導的突觸萎縮作用消失。綜合上述實驗結果表明DHE 對LMTK1具有靶向作用。

Figure 4 Effect of DHE on learning and spatial memory performance of AD mice in the morris water maze task (± s, n = 9)

Figure 5 Effect of DHE on expression of P-LMTK1 and P-TBC in hippocampus (± s, n = 3)

Figure 6 Effects of DHE on synaptic length after LMTK1 over-expression (± s)

Figure 7 Relative expression of LMTK1 in control, negative control and S-LMTK1 groups (± s, n = 3)

Figure 8 Effects of DHE on synaptic length after LMTK1 silencing (± s, n = 10)

4 討 論

越來越多的證據表明AD 早期階段就會發生突觸結構和功能損傷［16］，但認知功能并未出現明顯的下降，此階段是AD藥物干預的最佳時機［17-18］。在AD 早期增加突觸密度以及改善突觸可塑性有助于緩解AD 狀態下的認知功能減退［19］。例如，代謝性谷氨酸受體5（mGluR5）沉默變構調節劑（SAM）被證明可以恢復海馬突觸密度，并改善AD狀態下認知功能障礙［20］。Grimmig 等［20］通過給予老年小鼠蝦青素飲食增加了海馬體CA1-CA3 突觸的突觸可塑性，提高了記憶認知功能，本研究也發現改善AD 模型小鼠的突觸損傷可以緩解認知功能障礙。

突觸的形態和功能與認知功能密切相關，胞內體轉運途徑是神經突觸生長的關鍵過程。胞內體轉運途徑主要包含3個步驟：首先將形成突觸所需的物質“打包”成早期核內體，然后早期核內體將這些物質轉運至突觸并將其“打包”成循環核內體；最后循環核內體將蛋白插入到細胞膜中形成突觸，早期核內體將需要降解的蛋白“打包”成晚期核內體［21］。其中Rab11A 是循環核內體轉運過程中的關鍵效應蛋白。TBC1D9B 可以使Rab11A失活，抑制循環核內體的轉運［22］。LMTK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，以Cdk5 依賴性方式使TBC1D9B 的磷酸化水平升高，磷酸化的TBC1D9B會導致Rab11A 失活，進而抑制循環核內體轉運及突觸的生長［5，23］，但目前尚無LMTK1 的特異性抑制劑，本研究借助于計算機虛擬篩選發現DHE 可以抑制LMTK1 并且可以通過血腦屏障［6］，但由于DHE 的選擇性和活性不高，只有高劑量的DHE 顯著改善了AD 模型小鼠的突觸密度、突觸可塑性以及認知功能。并證明在AD 小鼠海馬組織內LMTK1 的磷酸化水平升高，DHE 可以顯著降低LMTK1 下游蛋白TBC1D9B 的磷酸化水平，伴隨著突觸萎縮的改善、突觸密度的增加及認知功能改善，上述結果提示，LMTK1 與認知功能密切相關。進一步的體外實驗結果顯示，DHE 能逆轉過表達LMTK1 導致的突觸萎縮，沉默LMTK1 后，DHE 對突觸損傷的改善作用消失。已有大量的文獻報道突觸損傷與認知功能下降密切相關［16］，上述體內外實驗結果均提示DHE 可能通過靶向LMTK1，調控突觸的生長，發揮認知功能的改善作用。由于DHE具有廣泛的中樞活性，其對于認知功能的改善作用是否還涉及到其他的機制尚待進一步探究。

本研究發現DHE 可以顯著增加AD 模型小鼠海馬區突觸密度并改善突觸萎縮和認知功能，其改善作用可能是通過靶向突觸生長的關鍵調控激酶LMTK1。這提示增加突觸密度是未來改善AD患者認知功能的一種新策略。