陳海燕,張慧寧,馬春芳,陳 娟,楊俊華,謝榮國,楊 奇
(寧夏回族自治區獸藥飼料監察所,銀川 750001)
目前有效的抗生素很多,但磺胺類藥具有抗菌譜廣、性質穩定、品種多、價格低、使用簡便等優點[1],在控制急性泌尿系統感染中有重要價值。所以在畜牧養殖業中常被用作治療動物腸道感染等疾病,若以預防為目的在飼料中長期添加,會使致病菌產生耐藥性,磺胺類藥物也因此會殘留在動物的肌肉等組織中,影響人的身體健康[2]?;前奉惪股剡€可以通過沉降、吸附等作用蓄積在地表水沉積物中[3],造成水體污染。農業農村部第194號公告頒布后,磺胺類藥物禁止作為飼料藥物添加劑被使用,其檢測對飼料質量安全控制十分必要。高效液相色譜檢測法能夠對飼料中的磺胺類藥物含量進行快速檢測,且檢測結果準確,誤差小,利于相關人員開展飼料中磺胺類藥物含量測定[4]。本研究采用高效液相色譜法,對飼料中磺胺類藥物進行測定,將GB/T 19542—2007[5]《飼料中磺胺類藥物的測定高效液項色譜法》中稱樣容器錐形瓶改為離心管,提取液乙腈體積減半,驗證建立更加合理、利于操作的檢測方法。
高效液相色譜儀(型號為Agilent 1260 infinity Ⅱ),安捷倫科技有限公司產品;離心機(型號為CR22G),日本日立公司產品;旋渦混勻器(型號為IKA MS3),德國艾卡公司產品,分析天平(型號為AX-205)、電子天平(型號為LD202-L),梅特勒-托利多公司產品;超聲清洗器(型號為KQ-400KDB),昆山舒美超聲儀器有限公司產品;固相萃取裝置(型號為SepLine-S4),萊伯泰科有限公司產品;振蕩器(型號為WSZ-100-A),上海一恒科學儀器有限公司產品;純水儀(型號為Milli-Q Integral 5),默克密理博公司產品。
色譜條件:紫外檢測器,檢測波長為270 nm;色譜柱,Agilent C18柱,柱長250 mm,內徑4.6 mm;流動相:乙腈∶4%冰乙酸水=25%∶75%,流速1.0 mL·min-1,進樣量20 μL。
該方法的定量限,磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶為5 mg·kg-1;磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉為2 mg·kg-1。
乙腈(色譜級,批號為178563)、甲醇(色譜級,批號為175614),Fisher chemical 產品;冰乙酸(優級純,批號為180219),天津市科密歐化學試劑有限公司產品;超純水,德國默克密理博Milli-Q Integral 5 制得;堿性氧化鋁SPE 小柱(批號為029639192A),沃特世Waters Spe-Pak 1 000 mg·(12 mL)-1。
1.5.1 標準貯備液配制
標準貯備液配制過程見表1。配制好后在-16 ℃避光保存,有效期6個月。
1.5.2 混合標準中間液
表1 標準貯備液配制
表2 5種磺胺類藥物的回收率及精密度
分別量取一定體積的標準貯備液置于同一25 mL棕色容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,使其成為濃度100 μg·mL-1的混合標準中間液。4 ℃避光保存,有效期1個月。
1.5.3 繪制混合標準工作曲線
準確量取混合標準中間液10、20、50、150 μL和500 μL,分別置于10 mL 的棕色容量瓶中,用流動相定容至刻度,使濃度分別0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1,繪制混合標準工作曲線。
樣品制備:選具有代表性的飼料500 g,粉碎過40目篩,混勻備用。
提?。簻蚀_稱取2 g(精確至0.001 g)試樣于50 mL離心管中,加入25 mL乙腈,渦旋1 min,振蕩30 min,9 000 r·min-1離心5 min,備用,同時做空白對照。
凈化過程:堿性氧化鋁SPE小柱,取10 mL乙腈淋洗,準確移去10 mL樣品試液過濾,流出后吹干。分別用2 mL 流動相洗脫2 次,收集洗脫液混勻,過0.22 μm濾膜后上機測定。
向稱取的樣品中分別加入20、40、100 μL 和300 μL濃度為100 μg·mL-1的混合標準貯備液,制成濃度為1、2、5mg·kg-1和7.5mg·kg-1的陽性添加樣品,上機濃度分別為0.2、0.4、1.0 μg·mL-1和1.5 μg·mL-1,每個濃度陽性添加做6個平行,連續3次。
5 種磺胺類藥物0.2 μg·mL-1的標準圖譜,1 mg·kg-1陽性添加回收及空白樣品圖譜見圖1~3。
圖1 5種磺胺類藥物0.2 μg·mL-1標準圖譜
圖2 5種磺胺類藥物1 μg·mL-1回收圖譜
因飼料中粗蛋白等含量較高,基質復雜容易對目標物形成干擾,選用乙腈做流動相,可以沉淀蛋白質;流動相的pH 會影響磺胺類藥物在色譜柱中的分離,水相選用4%的冰乙酸水利于不同磺胺類藥物的分離。試驗結果表明:5種磺胺類藥物標準圖譜與添加回收圖譜的色譜峰保留時間一致,且峰形良好,分離度好,互不干擾,說明流動相比例合理;由添加回收圖譜可以看出,樣品基質對添加回收影響小,說明試驗條件及方法可行。
以含量為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,見圖4~8。
圖4 磺胺嘧啶的標準曲線
圖6 磺胺二甲基嘧啶的標準曲線
圖7 磺胺甲惡唑的標準曲線
圖8 磺胺喹惡啉的標準曲線
由圖4~8可以看出,5種磺胺類藥物回歸方程分別為:磺胺嘧啶y=87.484 9x-0.874 3,磺胺間甲氧y=72.653 2x-0.765 0,磺胺二甲基嘧啶y=75.852 7x-0.717 9,磺胺甲惡唑y=75.664 7x-0.816 4,磺胺喹惡啉y=66.821 4x-1.231 0,5 種藥物5 個濃度(0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1)的線性均在0.999 9以上,線性良好。
陽性添加濃度為0.2、0.4、1.0mg·kg-1和1.5mg·kg-1四個濃度時,平均回收率為85.8%~113.0%,變異系數(RSD)為0.2%~7.6%,說明該方法精密度良好,符合方法學要求。
磺胺類藥物屬于酸堿兩性物質[6],標準貯備液配制過程中,磺胺喹惡啉超聲后若有混濁不溶現象,可適量加0.1%氫氧化鈉溶液50~100 μL,直至溶解后定容。標準品配制過程中,所用的容量瓶均建議采用棕色。
2022 年對寧夏區內生產企業、經營店、養殖場的豬雞配合飼料38 批次牛、羊精料補充料44 批次、自配料38批次,共計120批次飼料樣品,應用該方法進行檢測,均未檢出上述5 種磺胺類藥物,檢測結果見表3。
自飼料中禁止使用抗生素公告頒布后,飼料中抗生素檢測成為檢驗檢測機構的主要任務,磺胺類藥物為抗菌藥品種數量最多的人工合成藥物。飼料中磺胺類藥物分析測定方法有多種,例如高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-串聯質譜法[10-11]、酶聯免疫法、放射受體分析法等,液相色譜-串聯質譜檢測法成本較高,酶聯免疫法易出現假陽性、假陰性反應,需用高效液相色譜法或液相色譜-串聯質譜法進行確證,放射受體分析法有時會出現交叉反應及假陽性反應,樣品處理復雜,其中高校液相色譜法較成熟并被廣泛應用。本研究針對《飼料中磺胺類藥物的測定高效液相色譜法》中的前處理方法進行了改進,改進后的方法更加便捷、高效,更有利于進行大批量飼料樣品中常見磺胺類藥物的風險監測。
利用高效液相色譜法測定飼料中5種磺胺類藥物,將GB/T 19542—2007方法中稱樣容器錐形瓶改為離心管,利于樣品旋渦、振搖、離心等操作。提取液體積由50 mL乙腈改為25 mL,降低有機試劑的使用量,減少環境污染及對操作人員的毒性作用。改進后的方法更為簡單,利于操作和樣品的批量處理。經驗證,改進的方法各項參數均符合方法學要求,可用于飼料中非法添加磺胺類藥物的檢測,對飼料禁止使用磺胺類藥物的篩查具有重要意義。