金屬有機框架與大腸桿菌雜合體光驅產氫研究

李佳璐,沈俊峰,曾翠平,侯燕萍,王 博

(1.廣西大學資源環境與材料學院,廣西 南寧 530004;2.中國科學院深圳先進技術研究院,廣東 深圳 518005)

0 引言

工業文明的快速發展使得人類生活水平不斷提高,然而不斷加速的化石燃料開采與消耗導致能源危機日趨嚴重,環境日益惡化[1]。因此,必須采取有效措施加大對太陽能等清潔能源的轉化利用。開發光能驅動的能源與化學品生產途徑有助于解決環境和能源問題,促進人類社會的可持續發展[2]。二十一世紀以來,氫氣作為環境友好型能源的代表受到了人們的廣泛關注。目前主流的制氫工藝為化石能源重整制氫,該工藝技術成熟,成本也相對低廉,但是其制氫原料主要以石油、天然氣等化石資源為主,生產過程會排放大量的溫室氣體并污染環境[3]。生物體可通過代謝過程將水、有機廢物或生物質轉化為氫氣,該過程綠色無污染。由于生物體自我復制的特性,生物催化劑的成本相對較低,且制氫過程可以在常溫常壓下進行,因此具有巨大的開發潛力和產業前景[4]。然而,目前生物制氫工藝尚未完全成熟,其工業化受產氫效率低下的制約,仍需進行深入研究。半導體材料光催化分解水制氫是太陽能轉化利用的最理想方式之一,近年來該技術得到了越來越多研究人員的關注[5,6]。這種方法理論上簡單高效,且光催化劑具有光收集效率強和吸光范圍大等優點。然而,很多光催化劑存在制備過程繁雜、帶隙過寬,在制氫過程中催化劑易發生光腐蝕等缺點。因此,當前基于生物制氫及材料光解水制氫的兩個領域都存在明顯的自身發展限制。

近年來,人們開始把目光轉向將二者優點相結合的材料-生物雜合系統。該系統由高效光敏劑和高選擇性催化中心組成,光敏劑通常為無機半導體、有機半導體、光敏染料、量子點等材料,而催化中心則使用純酶或細菌細胞[7,8]。此類雜合系統不僅可以實現非常高的產品選擇性,而且光敏材料的選擇也足夠豐富,從而可以使流向催化中心的電荷流最大化,生物體自我修復特性也賦予了雜合系統更高的穩定性。同時,部分微生物易于進行代謝工程改造從而生成更高價值的產品,擴展性強,有較好的研究和應用前景[9]。2016年楊等人通過將培養液中的鎘離子和半胱氨酸通過生物轉化途徑合成了硫化鎘(CdS)納米粒子,并沉淀在產乙酸菌表面,從而誘導產乙酸菌產生自光敏作用,實現了光照下合成乙酸[10]。2017年王等人將CdS納米顆粒沉淀在大腸桿菌(Escherichiacoli)表面,在一定的光強輻照下,雜合系統的表觀量子效率最高可以達到9.59%,高于許多光合細菌[11]。在2018年姜等人在大腸桿菌表面形成了硫化銀(AglnS2)/硫化銦(In2S3)的固態異質結,構建了AglnS2/ In2S3@E.coli雜合系統收集光能從而生產氫氣[12]。同年,趙等人在大腸桿菌上利用表面展示技術優化了硫化鎘納米粒子的合成方法,光驅產氫效果得以進一步提升[13]。人們也設計了相比于納米材料尺寸更小的量子點材料用于構建雜合系統,例如2021年羅等人通過將硫銦銅(CuInS2)/硫化鋅(ZnS)量子點遞送到希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1細胞中,實現了光驅產氫[14]。2022年,氮化碳(C3N4)量子點材料也被用于與大腸桿菌構建雜合體進行光驅產氫研究[15]。除此之外,人工染料(如曙紅Y)亦可作為光敏劑穿過膜并與大腸桿菌中細胞色素P450的血紅素結構域結合,從而有效地提升電子轉移效率[16]。

金屬有機框架材料(metal-organic framework, MOF)作為新興的功能材料,可通過金屬離子和有機配體進行自組裝而獲得。它不僅具有類似沸石分子篩規則孔道的晶態結構,同時具有比傳統多孔材料更高的比表面積,由于有機成分的存在又使其兼具可設計性、孔徑大小可調性、孔道表面易功能化等優點[17]。MOF材料在氣體吸附、電極材料制備、催化領域中都得到了廣泛的應用[18]。2018年楊等人使用MOF包裹熱醋酸分枝桿菌以保護細胞。MOF外殼對活性氧自由基(Reactive oxygen species)分解的催化活性使嚴格厭氧細菌在21%的氧氣濃度下的死亡數量較之前減少了五倍,并使細菌能夠在氧化應激條件下通過CO2固定連續生產乙酸鹽[19]。然而,當前MOF作為捕光材料與細菌進行雜合的研究鮮有報道,故MOF材料在材料-微生物雜合系統的應用有待進一步探索。前期光驅產氫研究中,大腸桿菌已體現出拓展性強、易培養和易改造等優點,但也存在電子傳遞效率不高,電子傳遞機理不清等問題[20]。近年來基于鋯氧簇構建的MOF材料被廣泛應用于光催化研究領域[21,22],在本文中,我們將基于內消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)及氯化鋯(ZrCl4)合成金屬有機框架PCN-222,并構建MOF材料與大腸桿菌的雜合體,研究MOF材料的光電響應性質以及大腸桿菌在光照下的產氫性能。進一步通過研究細胞內能量變化分析能量傳遞機理,為未來進一步優化該雜合體平臺提供重要參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料、菌株以及培養基

無水氯化鋯(ZrCl4)、苯甲酸(C6H5COOH)、N,N二乙基甲酰胺(DEF)、內消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Ag /AgCl 參比電極、Pt 對電極,上海越磁電子科技有限公司;NAD+/NADH檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司。實驗中使用的大腸桿菌E.coli為野生型MG1655菌株,培養過程中分別使用LB培養基、BC培養基(磷酸氫二銨10 g/L、硫酸鉀2 g/L、氯化鈉0.3 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L、七水硫酸亞鐵4 mg/L、七水硫酸鋅0.9 mg/L、無水硫酸銅0.4 mg/L、無水硫酸錳0.2 mg/L、二水氯化鈣0.8 mg/L、十水硼砂0.09 mg/L、五水亞硒酸鈉0.6 mg/L、七鉬酸銨0.4 mg/L、硫酸鎳銨0.9 mg/L,pH調整至7)、SBC培養基(磷酸氫二銨10 g/L、硫酸鉀2 g/L、氯化鈉0.3 g/L)。

1.2 PCN-222的合成和形貌與成分表征

將ZrCl4(0.12 g, 0.515 mmol)和C6H5COOH(4.05 g, 33.16 mmol)溶解在 24 mL DEF中并超聲處理1 h.將混合物在烘箱中于 90 ℃加熱 2 h.向加熱的溶液中加入TCPP(0.06 g, 0.075 mmol),超聲溶解20 min,將混合物放置于反應釜內在120 ℃烘箱中加熱反應48 h.冷卻至室溫后,過濾得到紫色板狀晶體。使用掃描電子顯微鏡(蔡司EVO 18型,德國)表征PCN-222的微觀形貌。使用X射線衍射儀(XRD,理學Rigaku D/MAX 2500V,日本)分析材料結構。使用傅立葉紅外光譜(FTIR,Thermo Scientific iN10,美國)進行材料測試。使用X射線光電子能譜儀(XPS,Thermo Scientific Nexsa,美國)分析PCN-222的元素組成。使用紫外可見分光光度計(UV-Vis,島津Shimadzu UV-3600,日本)測定PCN-222在200～800nm范圍內的吸光度。

1.3 PCN-222的電化學性能表征

制備工作電極:裁剪邊長為2×1厘米的長方形碳紙,取5 mg材料融于990 μL異丙醇及10 μL Nafion溶液中,超聲后將液體均勻的涂抹在碳紙的兩面,晾干后用電極夾夾緊。將工作電極、參比電極(Ag/AgCl參比電極),對電極(Pt絲電極)安裝在電解槽中(石英,體積50 mL),加入30 mL 0.5 mol/L的Na2SO4電解質溶液。光照條件為LED白光,光照強度為38.93 W/m2.在電化學工作站(CHI660E,上海華辰,中國)上分別進行光電流測試(i-t)以及交流阻抗(EIS)測試。

1.4 PCN-222@E.coli雜合體系的構建與表征

用槍頭或接種環挑取野生型Mg1655E.coli的單菌落放入50 mL離心管,其中放入5 mL LB培養基。放入37 ℃搖床,過夜。將活化后的E.coli加入新鮮LB,將OD調為0.1在37 ℃搖床進行擴培,經過七個小時取出。將E.coli離心,使用PBS離心清洗兩次。把菌放入BC培養基,并在體系中加入30 mM葡萄糖。把材料按經實驗優化后的比例(3 mg/20 mL)加入培養基內。將裝有菌和PCN-222的250 mL三角瓶放入厭氧罐內,同時迅速將厭氧袋放入其中。將厭氧罐放入37 ℃培養箱中的攪拌器之上(轉速為250 rpm),過夜。使用臺式場發射掃描電鏡(Pharos,Phenom,中國)對雜合體系的表面形貌進行拍攝,并對樣品中的Zr、C、N、O元素進行能譜(15 kV)掃描。使用Zetasizer pro(Blue/Red)電位儀(英國Malvern公司)對雜合體系的表面電位進行分析。

1.5 產氫檢測與細胞內還原力水平檢測

將E.coli從LB中離心,再使用滅菌PBS離心清洗兩次。把菌放入SBC培養基(含20 mM葡萄糖)。將培養基分裝成每份20 mL后放入50 mL光反應瓶,充入氮氣并使用熱熔膠將其密封。將密封好的光反應瓶放入多通道(自動控溫)光催化反應系統(PCX50C Discover,泊菲萊,中國)開始反應,將光強調至20%,溫度調整至37 ℃.反應一共進行四小時,每個小時進行一次取樣。用微量進樣針(100 μL)抽取頂空體積100 μL手動打進氣相色譜儀(GC9790Ⅱ,福立,中國)進樣口,進行氫氣含量測量,方法為外標法,載氣為氬氣(純度> 99.99%),流量為30 mL/min,檢測器為熱導檢測器(TCD檢測器),柱溫箱溫度為80 ℃,出峰位置在5 min左右。分別用NAD+/NADH檢測試劑盒檢測細胞內NADH/NAD+.使用96孔板(Tecan Safire Abs,瑞士)測定吸光度,并使用標準曲線計算單個化合物的濃度。

2 結果與討論

2.1 PCN-222的合成與表征

從掃描電子顯微鏡(SEM)顯示的形態和微觀結構可以觀察到,本研究中所合成材料呈現出長度不一的中空棒狀形態和較為粗糙的表面。X射線衍射(XRD)圖像(圖1b)顯示,該樣品主要特征衍射峰出現在2°～10°之間。所獲得的XRD圖案與先前文獻中所報道的PCN-222一致[21],表明成功合成了PCN-222.傅里葉變換紅外(FTIR)光譜(圖1c)顯示,在3 400 cm-1出現的寬峰歸因于羥基的拉伸振動峰,表明樣品中存在結合水或者游離水。在1 000 cm-1處存在-COOH的振動峰表明在制備的PCN-222結構中存在TCPP化合物。1 800～1 400 cm-1處出現的的振動峰可歸因于PCN-222中C=0與N-H的對稱振動和不對稱振動峰,與先前報道的文獻一致[23]。使用X射線光電子能譜(XPS)研究了PCN-222的化學組成。從0到1 300.0 eV的XPS光譜描繪了Zr 3d、C 1s、N 1s、O 1s的特征結合能特征(圖1d)。綜上所述,本研究成功基于內消旋-(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)及氯化鋯(ZrCl4)合成了金屬有機框架PCN-222材料,并將基于此材料進一步構建與大腸桿菌E.coli的雜合體以展開探索。

圖1 a)掃描電子顯微鏡圖;b)X射線衍射譜圖;c)傅里葉變換紅外光譜圖;d)X射線光電子能譜圖

2.2 PCN-222@E.coli雜合體的構建與表征

為了驗證PCN-222與大腸桿菌E.coli的雜合情況,采用掃描電子顯微鏡、能量色散X射線光譜(EDS)圖譜研究了PCN-222@E.coli雜合體系。從圖2a的SEM圖像可以清晰看出,PCN-222的表面以及周圍都散落著大腸桿菌,且有大量大腸桿菌團聚在PCN-222表面。圖1b的Zr元素的EDS圖譜分析證實了SEM圖中的高亮棒狀物體為PCN-222,因為Zr元素為PCN-222的獨有元素。而圖2c～e為C、N、O元素,這是PCN-222與大腸桿菌二者都具備的元素,這三張圖顯示PCN-222與大腸桿菌之間形成了較為緊密的接觸。通過Zeta電位儀測得PCN-222的表面電位為21.7 mV,大腸桿菌表面電位為-69.58 mV,雜合體的表面電位為-51.36 mV(圖2f)。由此可見,PCN-222與E.coli二者表面存在正負電荷相互吸引力,促進了PCN-222@E.coli雜合體系的形成,也是大腸桿菌團聚在PCN-222表面的主要成因。

圖2 a)PCN-222-@E.col雜合體在2 μm比例下的 SEM 圖像;b、c、d、e)Zr,C,N,O四種元素的X射線能譜面掃分析;f)PCN-222、E.coli、PCN-222-@E.coli雜合體的zeta電位圖

2.3 PCN-222的光電活性研究

材料的光電化學活性是決定材料-生物雜合系統光能轉化效率的決定性因素。為了進一步了解PCN-222的光電特性,使用紫外可見漫反射(UV-Vis)并通過光電流測試(i-t)、電化學阻抗測試(EIS)等多種測試技術對PCN-222進行測試。UV-Vis一般可用于催材料表面的光吸收性能的測定,PCN-222的紫外可見漫反射光譜如圖3a所示。PCN-222在200～800 nm范圍內具有相對較強的吸收,表明可以在可見光下進行電子躍遷。氮化碳(C3N4)是一種典型的聚合物半導體,其帶隙符合光解水制氫的熱力學要求,并且也被廣泛應用于半人工及人工光合領域[24]。圖3b和圖3c為在三電極體系下,將所制備的PCN-222或C3N4涂覆于碳紙表面作為工作電極,Ag/AgCl為參比電極、鉑絲作為對電極,進行了i-t以及EIS測試后得到的圖像。如圖3b所示,PCN-222在重復的光開/關循環中保持著快速、穩定、重復性強的光電流響應,并且與C3N4相比,PCN-222具有更高的光電流,這表明PCN-222具備更優越的光響應和更高的電子遷移效率。除了i-t外,本文還利用EIS技術表征了PCN-222的性能。從圖3c可知,無論在光照或者黑暗條件下,從PCN-222獲得的電化學阻抗Nyquist譜圖均顯著低于C3N4,說明使用PCN-222與E.coli組成雜合系統,有利于形成材料與細菌表面快速的界面電荷轉移。為了進一步驗證PCN-222捕獲的光能是否被傳遞到大腸桿菌中,我們使用光致發光光譜(PL)研究了PCN-222@E.coli雜合體在非生物和生物界面上的電子轉移。如圖3d所示,在單獨的大腸桿菌細胞中沒有觀察到熒光信號,而與單獨使用PCN-222相比,PCN-222與大腸桿菌雜合后導致熒光信號強度有所下降。這表明大腸桿菌作為電子受體,從PCN-222端獲取了光電子,并有效抑制了電子與光生空穴的復合速率。由此可見,本研究中所合成的PCN-222材料具有廣譜的捕光性能和優異光電化學活性,且在與E.coli組成的雜合系統中,可以有效地將光生電子傳遞給活細胞,為雜合體高效轉化利用光能進行氫氣合成奠定了重要基礎。

圖3 a)PCN-222的紫外-可見光光譜圖;b)PCN-222與C3N4的光電流測試;c)PCN-222與C3N4化學阻抗測試圖譜;d)PCN-222、E.coli、PCN-222@E.coli雜合體的光致發光圖譜

2.4 雜合體光驅產氫性能和胞內能量分析

為了驗證雜合體系的光驅產氫性能,通過設置黑暗或光照條件(使用光照強度為38.93 W/m2的發光二極管照射)、間隔一小時取樣的方式檢測了其在反應四個小時內的氫氣產量。在相同的條件下,純PCN-222在黑暗或光照下均未檢測到H2產生。如圖4a所示,黑暗及光照組的產氫量在4 h內都呈上升趨勢。在黑暗條件下,純菌組的4 h氫氣產量為591.75 μmol/L,雜合體略高于純菌組(1 040.31 μmol/L)。在光照條件下,純菌組4 h的氫氣產量為1 330.47 μmol/L,而雜合體在光照下的4 h氫氣產量達到了3 865.7 μmol/L,達到了黑暗下純菌組的6.5倍。據報道,光電子可以通過膜結合蛋白的直接電子轉移或通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)間接介導。且NAD+可以作為光電子受體轉化為NADH,為厭氧發酵等氧化還原反應提供關鍵的還原動力,當還原力過剩時,將以H2的形式釋放[25]。因此,我們進一步檢測了不同條件下細菌體內的NADH與NAD+的比值(NADH/NAD+)。從圖4b中可見,雜合體在光照的4小時內胞內還原力顯著提升,而其他對照組則變化不明顯。該結果與圖4a中雜合體的氫氣產量結果相吻合。因此,實驗結果證明來自PCN-222的光電子將NAD+還原為NADH,從而提升大腸桿菌的氫氣產量。結合光電子轉導的結果及其在生物產氫中的作用,根據上述結果,我們提出了PCN-222@E.coli雜合體產氫的機理機制,如圖4c所示。由于靜電相互作用,表面帶正電的PCN-222與帶負電的E.coli自組裝成PCN-222@E.coli雜合體系。在適度的光照下PCN-222會產生大量的電子-空穴對,其表面的光生電子可以通過細胞膜傳輸到E.coli體內,而E.coli額外獲得的這些光生電子提高了胞內的還原力水平(即NADH/NAD+),導致過量的還原力以氫氣的形式釋放,因此氫氣的產量得以提升。

圖4 a)PCN-222@E.coli雜合體與大腸桿菌在光照和黑暗條件下四個小時內的氫氣產量;b)PCN-222@E.coli雜合體與純大腸桿菌在黑暗和光照下培養0、1、2、3、4h的NADPH/NADP+;c)雜合體的產氫機理示意圖

3 結論

在本研究中,我們合成了PCN-222并通過一系列的技術手段對其基本性能進行表征,隨后通過PCN-222與大腸桿菌的靜電吸附結合構建了PCN-222@E.coli雜合體。通過研究雜合體系的產氫能力來檢驗PCN-222對大腸桿菌能量傳遞的效果,從而驗證金屬有機框架-大腸桿菌雜合體在光驅產氫路徑開發方面的可拓展性。最后進行了胞內能量傳遞機理研究,為未來進一步優化該雜合體平臺提供重要參考。