一株淡紫擬青霉PT1菌株的培養特性及生物學特性

唐慧

貴州林業勘察設計有限公司，貴州 貴陽 550000

1 前言

1.1 淡紫擬青霉簡介

淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus) 在Answorth（1973）系統中屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科擬青霉屬[1]。菌絲體發達，呈疏松棉絮狀，分生孢子直接從菌絲或分生孢子梗上產生，分生孢子梗不形成孢梗束或分生孢子座。至今該屬報道有近50 個種，皆為昆蟲病原菌和線蟲病原菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能寄生于卵，也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結線蟲、孢囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害。淡紫擬青霉廣泛分布于全世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養等優點。

1.2 實驗研究背景

松材線蟲病，即松樹萎蔫病，其病原為嗜木傘真滑刃線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)[2]，其傳播蔓延速度快、防治難度大，又被稱為松樹癌癥、無煙的森林火災[3]。松材線蟲在世界廣泛分布，是繼榆枯萎病、板栗疫病、松針皰疹銹病之后的第四大森林病害，屬于特大毀滅性災害，被列為森林病蟲害之首[4]，對森林資源以及經濟造成了嚴重的影響。有研究發現，用淡紫擬青霉PT1 菌株的發酵液處理松材線蟲，其24h、48h、72h 的校正死亡率都高達100%，表現出較強的殺松材線蟲的能力[5]。研究淡紫擬青霉PT1菌株的培養特性對研究防治松材線蟲有著重要的意義。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗菌株來源

該實驗所用淡紫擬青霉PT1 菌株來源于中國林科院微生物菌株平臺，前期試驗證明其對松材線蟲殺蟲高效菌株。

2.1.2 實驗藥品

瓊脂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、酵母膏。

2.2.3 實驗器材

表1 試驗所用儀器設備Tab.1 Instruments and Equipment Used in the Test

2.2 實驗方法

2.2.1 不同溫度對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

用改良PDA 培養基（培養基成分：馬鈴薯200g、水1000mL、瓊脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g）培養淡紫擬青霉PT1 菌株。設置5 個溫度梯度，分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；每個溫度做5 個重復，重復3 次。在溫箱避光培養7d，用十字交叉法測量菌落直徑，每24h 測量1 次，并記錄測量的結果，比較各個溫度的菌落生長狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長狀況最好的溫度。

2.2.2 不同碳源對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

以改良PDA 為基礎培養基，配方同上。替換碳源，供試碳源有：麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇；每個碳源做5 個重復，重復3 次。在溫箱28℃避光培養7d，用十字交叉法測量菌落直徑，每24h 測量1次，并記錄測量結果，比較各個碳源的菌落生長狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長狀況最好的碳源。

2.2.3 不同氮源對淡紫擬青霉PT1 菌株的生長影響

以改良PDA 為基礎培養基，培養基配方同上。供試氮源有：蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、酵母膏；每個氮源做5 個重復，重復3 次。在溫箱28℃避光培養7d，用十字交叉法測量菌落直徑，每24h 測量1 次，并記錄測量的結果，比較各個氮源的菌落生長狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長狀況最好的氮源。

2.2.4 不同pH 對淡紫擬青霉PT1 菌株的生長影響

以改良PDA 為基礎培養基培養淡紫擬青霉PT1菌株，培養基配方同上。設置6 個pH 梯度，分別為pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9；每個pH 做5 個重復，重復3 次。在溫箱28℃避光培養7d，用十字交叉法測量菌落直徑，每24h 測量1 次，并記錄測量結果，比較各個pH 的菌落生長狀況，篩選出淡紫擬青霉PT1菌株生長狀況最好的pH。

2.2.5 淡紫擬青霉PT1 菌株菌落觀察

用改良PDA 培養基（配方同上）培養淡紫擬青霉PT1 菌株，溫箱28℃避光培養，每天觀察菌落的顏色、大小、質地、形狀、紋路等，并記錄觀察結果，拍照。觀察7d，設置5 個重復。

2.2.6 淡紫擬青霉PT1 菌株產孢時間的觀察

用改良PDA 培養基（配方同上）培養淡紫擬青霉PT1 菌株；每天用接種針挑取少許菌絲置于滴有水滴的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學顯微鏡下觀察是否有孢子的產生，并拍照，記錄產孢時間以及孢子的形態。

3 結果與分析

3.1 溫度對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

溫度對淡紫擬青霉PT1 菌株的生長影響較大，溫箱避光培養7d 后，結果顯示：當溫度為30℃時，淡紫擬青霉PT1 的菌落直徑較其他幾個溫度是最大的，其生長到第7 天的菌落直徑為4.25cm，其次是20℃、25℃，其淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑分別為3.61cm、3.45cm，但溫度在35℃時，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑為1.82cm，是生長狀況最差的。從圖1 的曲線圖可以看出，代表30℃的曲線最陡，表明淡紫擬青霉PT1 菌株在30℃時，菌株的生長速度最快；代表35℃的曲線則特別平緩，菌株的生長速度特別緩慢，幾乎沒怎么生長。綜上所述，淡紫擬青霉PT1 菌株在30℃時，生長狀況最好，在35℃時，生長速度特別緩慢，在前6d，25℃的比20℃的生長狀況要好，在第7 天時，20℃下培養的淡紫擬青霉PT1 菌株比25℃下培養的淡紫擬青霉PT1 菌株快，原因可能是由于25℃的溫箱在中途沒有關好門，導致溫箱內實際溫度降低，不到25℃，導致生長速度減緩，可能是20℃時，淡紫擬青霉PT1 菌株才開始快速生長，具體原因有待繼續研究。

圖1 不同溫度菌株生長直徑隨時間變化Fig.1 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains at Different Temperatures with Time

3.2 碳源對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

在葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、淀粉這6 種碳源中，菌株均可生長（圖2）。由于淡紫擬青霉PT1 菌株生長緩慢，所以當菌株生長到第7 天時仍未長滿培養皿。28℃溫箱培養7d 后，不同碳源的培養基上的淡紫擬青霉PT1 菌株的生長情況不同。由圖2 可以看出，當淡紫擬青霉PT1 菌株生長到第7天時，由蔗糖作為碳源的培養基培養的淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑為最大，菌落的最大直徑為4.78cm；由葡萄糖作為碳源的培養基培養的淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑是相對最小的，培養到第7 天的菌落直徑為3.35cm。由圖2 的曲線圖可以看出，代表蔗糖的曲線較陡，則說明在以蔗糖為碳源的培養基上，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長速度較其他碳源快；而代表葡萄糖的曲線比較平緩，則說明在以葡萄糖為碳源的培養基上，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長較其他碳源緩慢。綜上所述，在供試的6 種碳源中，最適合淡紫擬青霉PT1 菌株生長的碳源是蔗糖，不適合淡紫擬青霉PT1 菌株生長的碳源為葡萄糖。

圖2 不同碳源菌株生長直徑隨時間變化Fig.2 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains with Different Carbon Sources with Time

3.3 氮源對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

菌株在供試氮源培養基上均能生長（圖3）。不同氮源對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響較大，28℃下培養7d 后，不同氮源培養基上的淡紫擬青霉PT1 菌株生長差異較明顯。由圖3 可以看出，在氮源為牛肉膏的培養基上淡紫擬青霉PT1 菌株生長最好，菌落直徑為4.47cm；其次為以酵母膏為氮源的培養基上淡紫擬青霉PT1 菌株，菌落直徑為3.98cm；以蛋白胨為氮源的培養基上淡紫擬青霉PT1 菌株，菌落直徑為3.80cm；直徑最小的是以硫酸銨為氮源的培養基上生長的淡紫擬青霉PT1 菌株，其菌落直徑為2.95cm。由圖3 可以看出，牛肉膏的曲線較陡，說明淡紫擬青霉PT1 菌株在以牛肉膏為氮源的培養基中生長速度較其他氮源快；代表硫酸銨的曲線明顯比較平緩，則說明淡紫擬青霉PT1 菌株在以硫酸銨為氮源的培養基上的生長速度較緩慢。綜上所述，在供試4 種氮源中，淡紫擬青霉PT1 菌株在以牛肉膏為氮源的培養基中的生長狀況是最好，而在以硫酸銨為氮源的培養基中淡紫擬青霉PT1 菌株的生長狀況是4 種氮源中最差的。

圖3 不同氮源菌株生長隨時間變化直徑Fig.3 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different Nitrogen Sources with Time

3.4 pH 對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響

菌株在試驗所設置的pH 范圍內都能生長（圖4）。不同的pH 對淡紫擬青霉PT1 菌株生長的影響各不相同。由圖4 的柱狀圖可以看出，當pH 為8 時，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑是最大，菌落直徑為4.25cm；其次是pH 為7 時，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑，其菌落直徑為4.23cm，兩者相差不大。但pH 為4 時，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落生長情況最不理想，其菌落直徑在第7 天時為2.48cm。由圖4可以看出，代表pH4 的曲線較平緩，說明淡紫擬青霉在pH 為4 的培養基上生長狀況不好；代表pH8 的曲線比較直且陡，說明在pH 為8 的培養基上淡紫擬青霉PT1 菌株的生長速度較均勻且較快；pH 為7 的培養基的在第3 天到第6 天時，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長狀況比pH 為8 時的要好，但pH7 的生長速度不均勻，第6 天到第7 天時生長速度有所下降；代表pH9 曲線比較直，說明在pH 為9 的培養基上生長的淡紫擬青霉PT1 菌株的生長速度比較均勻。綜上所述，淡紫擬青霉PT1 菌株適合在偏堿性的環境中生長，且生長速度較快，不適合在偏酸性的環境下生長，其生長的最適pH 范圍為7～8。

圖4 不同pH 菌株生長隨時間變化直徑Fig.4 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different pH Values Changing with Time

圖5 淡紫擬青霉PT1 培養形態Fig.5 Culture Morphology of Paecilomyces lilacinus PT1

3.5 淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落形態觀察

用改良PDA 培養淡紫擬青霉PT1 菌株，28℃避光培養，每天用肉眼觀察淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落形態，觀察發現淡紫擬青霉PT1 菌株起初菌落顏色為白色，菌絲呈放射狀向四周均勻擴散，因此其菌落形狀為均勻的圓形，菌落質地呈疏松棉絮狀，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長速度較緩慢，所以培養10d后仍然沒有長滿培養皿。在淡紫擬青霉PT1 菌株長到20d 左右時，菌落顏色開始變化從白色變為淡紫色，逐漸長滿培養皿。

3.6 淡紫擬青霉PT1 菌株產孢時間的觀察

用改良PDA 培養淡紫擬青霉PT1 菌株，28℃避光培養。每天在超凈工作臺內用接種針挑取少許菌絲在滴了水的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學顯微鏡下用40 倍鏡觀察孢子。在培養到4d 時，在光學顯微鏡下觀察到有孢子的產生，有的分生孢子直接著生于菌絲上，有的分生孢子著生于分生孢子梗上，在顯微鏡下觀察到菌絲接近透明，分生孢子透明，近圓形，分生孢子梗較粗壯。產生分生孢子時的菌落形態如圖6，分生孢子如圖7。

圖6 產生分生孢子時的菌落形態（第4 天）Fig.6 Colonial Morphology of ConidiaGermination(4th days)

圖7 分生孢子形態Fig.7 Conidia Morphology

4 結論與討論

該試驗研究了淡紫擬青霉PT1 菌株培養特性，實驗結果表明，能使淡紫擬青霉PT1 菌株生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適生長溫度為30℃，最適生長pH 為7～8，淡紫擬青霉PT1 菌株初期沒有長滿培養皿時的菌落顏色為白色，培養20d左右，菌落也逐漸長滿了培養皿，菌落顏色也從白色變為淡紫色，菌絲呈放射狀向四周擴散，菌落現狀為圓形，菌落質地為疏松棉絮狀，其分生孢子無色近圓形，直接著生在菌絲上，或者著生在分生孢子梗上，淡紫擬青霉PT1 菌株在35℃時幾乎不生長，生長速度及其緩慢，在偏堿性的環境下生長較好。李芳等人[6]也對淡紫擬青霉的培養特性進行了研究，結果顯示淡紫擬青霉NH-PL-03 菌株在發酵過程中，pH 是相對穩定的，在快速生長時pH 下降，在培養到第7天至第9 天時，pH 回升，并且維持在6～7，碳源的消耗量隨著菌絲生長液在逐漸增加。彭鑫等人[7]對玫煙色擬青霉QH-4 的形態特征，分生孢子的萌發環境條件進行了研究，研究結果顯示其分生孢子在可萌發的pH 范圍較大，在pH5～pH11 條件下都可萌發，但偏酸或者偏堿都會導致其萌發率降低，其分生孢子萌發的最適溫度范圍為25℃～27℃，生長條件較寬松與淡紫擬青霉PT1 菌株相比，對生長環境的酸堿度和溫度的要求不高。夏振遠等人[8]采用正交試驗研究了淡紫擬青霉IPC 菌株的發酵培養基，其研究結果發現適當增加通氣量，pH 控制在5～6，溫度控制在29℃更適合淡紫擬青霉IPC 菌株液體的深層發酵，該研究還發現了適合淡紫擬青霉IPC 菌株發酵培養的最佳培養基的配方，蔗糖+ 黃豆粉+0.005g/L FeSO4·7H2O+0.008g/L MnSO4+0.002g/L H3BO3+0.005g/L ZnSO4+0.004g/L CuSO4+ 0.004g/L Na2MoO4+0.002g/L CoCl2+0.04g/L 肌醇為最佳培養基配方，其最佳生長碳源和淡紫擬青霉PT1 菌株一樣，也為蔗糖。周靖等人[9]則以查實培養基為基礎，采用正交試驗研究淡紫擬青霉的培養條件，其研究結果顯示，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸銨，最佳pH 范圍為5～6，最佳溫度為30℃，與淡紫擬青霉PT1 菌株的最佳碳源和最佳溫度是相同的。大量的研究顯示，淡紫擬青霉對根結線蟲的防治效果好，而淡紫擬青霉防治松材線蟲的研究少之又少，而有研究發現淡紫擬青霉對松材線蟲也有較高的防治作用[5]，所以研究淡紫擬青霉PT1 菌株的培養特性對防治松材線蟲有促進作用，也是該實驗的創新點，該實驗的不足之處在于研究的不夠深入，碳氮源的種類較少，可采用正交實驗研究適合淡紫擬青霉PT1 生長的最佳培養基。