三葉青Th MYB 1及Th MYB 2轉錄因子的克隆及生物信息學分析

趙剛,羅懌文,聞靜*

(1.上饒師范學院生命科學學院,江西 上饒 334000;2.永新中學,江西 吉安 343499)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)為多年生蔓生藤本植物,學名三葉崖爬藤,屬于葡萄科崖爬藤屬,喜陰涼,多生長在林下,具地下塊根[1]。三葉青是我國具有悠久民間藥用歷史的植物,現代藥理學研究表明三葉青塊根提取物具有消炎、鎮痛及解毒等作用[2],對一些慢性疾病如糖尿病及高脂血癥等也具有良好的治療效果[3－4],其塊根提取物中的黃酮類化合物對腫瘤的治療有卓越的效果,有巨大的抗腫瘤臨床應用價值[5]。MYB(V－myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉錄因子家族以含有獨特的MYB結構域為分子結構特征[6],迄今為止的研究顯示MYB轉錄因子在植物中普遍存在,并在植物對干旱與高鹽等非生物脅迫的耐逆性應答[7－8]及次生代謝物質的合成代謝過程中扮演重要角色[9－11],特別是在黃酮類化合物合成代謝中起到重要作用[12－13]。

本課題組的前期研究發現,在三葉青塊根發育過程中伴隨著黃酮類化合物的顯著積累,MYB類轉錄因子大量差異表達。從三葉青塊根的轉錄組數據庫中篩選表達豐度最高的兩個MYB 轉錄因子ThMYB1和ThMYB2,克隆該基因的cDNA 序列,對之進行測序及初步的生物信息學分析,以期為進一步研究該基因與三葉青塊根發育及與黃酮類化合物合成代謝的相關性提供分子生物學參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以玉山縣農林合作社自主馴化栽培的懷玉山三葉青品種“懷玉2號”為實驗材料,該三葉青栽培種為國家地理標志農產品。

針對多酚多糖中藥植物的專用RNA 提取試劑盒,由北京華越洋生物科技有限公司提供;反轉錄(RTPCR)試劑盒、膠回收試劑盒、克隆測序所用的載體及感受態細胞(E.coli DH5α),大連寶生物科技有限公司提供;PCR 高保真酶(Trans Taq DNA ploy High Fidely),北京全式金生物科技有限公司提供;從國藥集團采購Boiwest瓊脂糖、Tris－base、氯仿、EDTA 等試劑;PCR 引物合成由上海生物工程股份有限公司合成;cDNA 樣品送南昌華大生物科技有限分公司測序。

1.2 三葉青總RNA 的提取及cDNA 的合成

以三葉青的芽為樣本提取總RNA,稱取100mg幼芽進行液氮研磨,具體提取方法參照試劑盒說明書。RNA 提取后采用Spec Nano檢測RNA 的純度及濃度,采用RNA 濃度大于200 ng/μL的總RNA 用于反轉錄(RT－PCR),反轉錄的體系及溫控條件參考說明書進行設置。

1.3 Th MYB 轉錄因子基因的克隆和測序

從三葉青轉錄組篩選并調取ThMYB基因的cDNA 序列,利用Primer 3－SGD 在線程序設計擴增兩個MYB轉錄因子的引物,用于擴增基因cDNA 全長,引物信息見表1。PCR 體系的配置方法參照說明書,熱反應條件如下:98℃變性1 min;98℃變性15s,55℃退火10s,72℃延伸1.5 min,反應40個循環;72℃延伸5 min。以0.8%瓊脂糖TAE 凝膠電泳檢測PCR產物的有無及其位置。PCR產物純化后與克隆載體p MD－18T載體連接并轉化大腸桿菌,氨芐霉素(50mg/m L)篩選陽性菌落,菌落PCR檢測后挑選兩個以上陽性克隆擴大培養后,提取質粒后送公司測序。

表1 用于Th MYB 基因克隆的引物序列

1.4 生物信息學分析

利用NCBI網站中開放讀碼框預測(ORF－Finder)模塊推測開放讀碼框位置并獲得氨基酸序列,利用蛋白質比對模塊(Blastp)分析蛋白質的氨基酸序列與已知序列的相似性;利用信號肽在線預測模塊(SignalP－5.0)預測Th MYB1和Th MYB2蛋白質信號肽的有無;利用SOPMA在線程序分析蛋白質的保守氨基酸序列及二級結構特征;利用ExPASy分析蛋白質理化性質及親/疏水性;利用Cell－PLoc 2.0預測蛋白質亞細胞定位;利用SWISS－MODEL在線模塊構建蛋白質的三級結構空間模型;使用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹。

2 結果

2.1 Th MYB 1和Th MYB 2基因的克隆

通過PCR 擴增成功克隆懷玉山三葉青的ThMYB1和ThMYB2基因,獲得包含完整讀碼框的cDNA序列,通過測序獲得的ThMYB1基因片段全長1 450bp,ThMYB2基因片段全長856bp,具體如圖1所示。

圖1 Th MYB 1與Th MYB 2 PCR 產物的電泳檢測結果

2.2 三葉青Th MYB 基因的生物信息學分析

2.2.1ThMYB1與ThMYB2基因推測蛋白質一級結構及二級結構分析

ORF Finder在線分析表明,ThMYB1基因的ORF長度為960bp,編碼319個氨基酸(圖2)。Blastp比對結果顯示與葡萄(Vitisvinifera)的MYB家族轉錄因子PHL6(登錄號RVW63118.1)相似度最高,覆蓋度為98%,相似度為80.50%;蛋白質保守域分析表明,Th MYB1在97－153氨基酸位點間存在MYB 特征SHAQKYF的DNA 結合域,在189－235氨基酸位點具有Myb_CC 特征的LHEQLE 保守域。ThMYB2的ORF長度為489bp,編碼162個氨基酸(圖3),blastp 比對結果顯示與河葡萄(Vitisriparia)的MYB家族轉錄因子(登錄號XP_034693329.1)相似度最高,覆蓋度為94%,相似度為95.93%;推測蛋白質序列在78－105氨基酸位點存在PLN03212(Transcription repressor MYB5;Provisional)保守域。以上生物信息學初步分析表明,ThMYB1與ThMYB2基因的推測蛋白質為植物MYB家族成員。ThMYB1與ThMYB2基因推測氨基酸序列的相對分子質量、等電點、信號肽預測及亞細胞定位如表2所示。

圖2 Th MYB 1測序所得序列及ORF finder翻譯結果

圖3 Th MYB 2測序所得序列及ORF finder翻譯結果

表2 Th MYB 1與Th MYB 2基因編碼推測氨基酸序列的相對分子質量、等電點、信號肽、細胞亞定位和親/疏水性

2.2.2ThMYB1和ThMYB2推測蛋白質的三級結構

ThMYB1推測蛋白質的3D 模型是以磷酸鹽虧欠響應蛋白質2(Protein PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 2)的模型建立起來的,模型對序列有效的識別率達到了62.12%;ThMYB2推測蛋白質的3D 模型是以SAGA 輔助因子(SAGA－associated factor 11)為基本模型建立起來的,但是序列有效識別率較低為18.8%(圖4)。

圖4 Th MYB 1與Th MYB 2推測蛋白質的3D 模型

2.2.3ThMYB1和ThMYB2進化樹的構建

利用Blastp對兩種蛋白質進行同源性比較,分別選取與Th MYB1和Th MYB2蛋白質同源性較高的其他植物的MYB蛋白質序列,使用MEGAX 軟件中的Neighbor－Joining法構建Th MYB1和Th MYB2蛋白質系統發育進化樹,結果如圖5所示。Th MYB1蛋白質與葡萄MYB 類轉錄因子PHL6處于同一進化分支,Th MYB2蛋白質與河葡萄的MYB5轉錄因子處于同一進化分支,Th MYB1與Th MYB2兩種蛋白質序列相似性較低,處于不同的進化分支。

圖5 Th MYB1與Th MYB2系統進化樹的構建

3 討論

MYB蛋白質超家族數量龐大,功能多樣,存在于所有真核生物中,大多數MYB蛋白質作為轉錄因子發揮作用,多重復結構域的主要功能是結合DNA 模板[14]。MYB 蛋白質的結構特征在于高度保守的MYBDNA 結合域,通常該結構域由最多四個重復序列(被稱為R 序列)組成,每個重復序列約包含52個氨基酸或更少數量的氨基酸,每個重復序列形成三個α－螺旋,其中第二個和第三個螺旋能夠形成一個螺旋－轉角－螺旋(HTH)結構,具有三個規則間隔的色氨酸(或疏水)殘基,在3D HTH 結構中形成疏水核心[15]。MYB類蛋白質可以根據臨近重復序列的數量多少分成4個不同亞家族,其中最小的一類是4R－MYB亞家族,其成員包含四個類似R1/R2的重復序列,目前對該類蛋白質研究極少[16];第二類是指R1R2R3型MYB(3R－MYB)蛋白質,編碼3R－MYB蛋白質的基因已在大多數真核生物基因組中被發現,主要在細胞周期控制中發揮著不同的作用[17];第三種MYB相關亞家族蛋白質僅含有單個或部分MYB重復的蛋白質,統稱為MYB相關家族(1R－ MYB/MYB－related)[18－19],本研究中的ThMYB2基因只有一個PLN03212保守域,因此Th MYB2屬于該1R－MYB/MYB－related亞家族;第四種R2R3－MYB 轉錄因子,在N 端帶有DNA 結合結構域(即MYB結構域),而在C 端則帶有激活或抑制結構域,Th MYB2在N 端(97－153氨基酸位點)存在MYB特征SHAQKYF的DNA 結合域,在C端(189－235氨基酸位點)具有Myb_CC特征的LHEQLE保守域,因此Th MYB1屬于該亞家族[20]。由于保守域的不同,Th MYB1及Th MYB2分屬不同的MYB亞家族,Th MYB2所屬的R2R3－MYB亞家族的蛋白質參與到較為廣泛的植物學生物過程中,包括次生物質的代謝[21]、生物脅迫[22]與非生物脅迫[23]、細胞分化與纖維發育[24]及種子萌發[25]等生物學過程;而關于Th MYB1所屬的MYB/MYB－related的亞家族的研究較少,目前只發現該類亞家族蛋白質有可能參與到低溫脅迫[26]及ABA 的信號轉導[27]。

目前有大量的研究表明,植物地下儲藏器官中黃酮類化合物的代謝與MYB轉錄因子密切相關。St-MYB12A的過表達顯著增加了馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖中黃酮醇和其他苯丙素的含量[28]。Yu等[29]的研究表明,芒柄花素和刺槐素含量在美麗雞血藤(Calleryaspeciosa,Champ.ex Benth)塊根發育過程中顯著增加,R2R3－Cs MYB可能調控了參與異黃酮生物合成途徑的結構基因的表達。MYB－b HLHWD40/MYB－b HLH－WD40－WRKY 復合物可結合花青素結構基因IbDFR的啟動子并激活該基因的表達,以維持甘薯(Ipomoeabatatas)塊根中花青素的積累[30]。Th MYB2蛋白質與河葡萄的MYB5轉錄因子親緣關系最近,阿馬托(Amato)等[31]的研究表明,葡萄的MYB5轉錄因子能夠使MBW 復合物與WRKY因子結合,以增強參與葡萄中液泡超酸化和運輸相關的靶基因的表達。ThMYB1轉錄因子與葡萄MYB類轉錄因子PHL6處于同一進化分支,而關于葡萄VvPHL6基因的功能,目前還沒有報道。

植物的MYB類轉錄因子廣泛參與到植物的生長發育過程中,目前MYB類轉錄因子對于三葉青黃酮類化合物生物合成調控的研究還未見報道,前期轉錄組數據研究表明,藍光輻照后伴隨著黃酮類化合物含量提高,ThMYB1和ThMYB2轉錄因子的表達量顯著提高,但是ThMYB1和ThMYB2轉錄因子在三葉青塊根發育過程中的表達與黃酮化合物的積累是否相關,還需要進一步通過轉基因功能驗證進行研究。