紫杉醇(二線)治療晚期胃癌對外周血CD4+T、CD8+T細胞的影響及相關分析※

趙玲琳,韓靜綺,駱玉霜*

(1.青海大學高原醫學研究中心,西寧 810001;2.青海省人民醫院,西寧 810007;3.青海大學附屬醫院,西寧 810001)

以紫杉醇為基礎的化療多作為晚期胃癌的二線化療方案,紫杉醇輸注前需要做激素預處理,其是否會抑制免疫功能影響療效目前在學界存在爭議。本研究觀測紫杉醇(二線)治療晚期胃癌對外周血CD4+T、CD8+T細胞的影響并行相關分析,以明確紫杉醇化療對機體免疫功能的影響及晚期胃癌患者外周血CD4+T、CD8+T細胞數量與紫杉醇療效及患者生存期的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2019年10月至2021年12月在青海大學附屬醫院經病理學確診的一線治療失敗晚期胃癌患者40例。納入標準:①一線化療未使用過紫杉類藥物,二線化療采用統一的紫杉醇方案,且至少完成2個化療周期;②年齡18～75歲;③KPS評分≥70分,ECOG體能狀態評分≤2分,預計生存期≥3個月;④有可經影像學(CT或MRI)評價的客觀可測量病灶;⑤ 病例資料記錄完整,患者知曉研究方案,并簽署書面知情同意書。

本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求,并通過青海大學附屬醫院醫學倫理委員會審核(SL-20190014)。

入選患者一般基線特征見表1。

1.2 方法

1.2.1 治療方案設計

第1、8天給予紫杉醇(135 mg/m2,用500 mL生理鹽水稀釋后以靜脈滴注方式使用,滴注時間為3 h,靜脈滴注12、6 h前口服地塞米松(7.5 mg)預防過敏反應。21天為1個治療周期,完成2個周期以上化療。

1.2.2 療效評價

療效評價采用《實體瘤的療效評價標準(RECIST1.1)》[1],每2個化療周期后進行療效評價。評價按完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)四種情況判斷?；熡行?RR)=(CR+PR)/總例數×100%,疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/總例數×100%。本研究將RR和DCR作為療效評價指標。

1.2.3 外周血CD4+T、CD8+T細胞數量檢測

抽取胃癌患者化療前1日和2周期化療結束時空腹外周靜脈血2 mL入EDTA-K2抗凝管,充分混勻后每份血樣取50 μL加入BD絕對計數管中,每管分別加入BD Multitest CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC單克隆抗體(340503,BD Biosciences)各20 μL,振蕩混勻,避光放置(20℃,15～20 min)。加入稀釋(1:10)后的紅細胞裂解液(R1010,Solarbio)約450 μL,振蕩混勻,避光孵育(10～15 min)。離心(1500 r/min,5 min)棄上清后每管加入1～2 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS),充分混勻(上述步驟重復操作1次)后加入500 μL PBS重懸待測細胞,充分混勻置暗處,2 h內用流式細胞儀檢測(FACS Calibur,BD)。外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細胞數以流式細胞儀檢測并用Multi SET軟件分析。

1.2.4 統計學分析

用SPSS25.0統計軟件行數據分析,用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。計量資料行正態性檢驗,偏態資料以中位數及四分位數表示[M(P25,P75)],患者治療前后外周血T細胞比較采用配對Wilcoxon符號秩和檢驗,多個獨立樣本采用Kruskal-Wallis檢驗,采用Kaplan-Meier及Log-rank檢驗法進行生存分析并繪制生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇(二線)治療晚期胃癌對外周血CD4+T、CD8+T細胞的影響

比較40例胃癌患者做紫杉醇化療前和2周期化療結束時外周血CD4+T、CD8+T細胞數量和CD4+T/CD8+T變化。治療前后差值行正態性檢驗顯示其為非正態數據,行配對秩和檢驗顯示紫杉醇化療后外周血CD4+T、CD8+T細胞數量略高于化療前,而化療后CD4+T/CD8+T略有下降,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 化療前后外周血CD4+T、CD8+T細胞數量[ M(P25,P75)]及比值

2.2 相關分析

2.2.1 分析化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量及比值與療效的關系

40例患者療效評價:CR 0例,PR 7例,SD 14例,PD 19例,RR為17.5%,DCR為52.5%。行Kruskal-Wallis檢驗顯示,治療療效為PR組的患者其化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量高于SD、PD組的患者(P<0.05),而CD4+T/CD8+T與化療療效無關(P>0.05)。見表3。

表3 化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量及比值與治療療效的關系[M(P25,P75)]

2.2.2 分析化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量及比值不同水平患者的PFS、OS曲線

末次隨訪時間截至2022年3月31日,死亡33例(82.5%),存活7例(17.5%),存活患者生存期按隨訪截尾日期計算并按刪失數據處理。紫杉醇(二線)化療后中位PFS為5.0個月(95%CI:4.67～5.33),中位OS為9.6個月(95%CI:9.13～10.07)。分別以化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量中位數(545.5個/μL、442.0個/μL)及CD4+T/CD8+T中位數(1.16)為截點分為高值組、低值組。

分析化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量及CD4+T/CD8+T不同水平患者的PFS曲線:外周血CD4+T、CD8+T細胞數量高的患者其中位PFS雖高于低水平患者(5.2個月與4.8個月比較,5.2個月與4.9個月比較),但差異無統計學意義(P>0.05,圖1A、B);而外周血CD4+T/CD8+T較高患者的中位PFS明顯高于低水平患者(5.5個月與4.7個月比較),差異有統計學意義(P<0.05,圖1C),提示化療前外周血CD4+T/CD8+T越高患者PFS越長。

A:CD4+T細胞數量不同水平患者的PFS曲線;B:CD8+T細胞數量不同水平患者的PFS曲線;C:CD4+T/CD8+T不同水平患者的PFS曲線

分析化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量及CD4+T/CD8+T不同水平患者的OS曲線:外周血CD4+T細胞數量及CD4+T/CD8+T較高患者的中位OS雖高于低水平患者(9.9個月與9.6個月比較,10.6個月與8.8個月比較),但差異無統計學意義(P>0.05,圖2A、C);而外周血CD8+T細胞數量水平不影響患者中位OS(9.6個月與9.6個月比較,P>0.05,圖2B)。

A:CD4+T細胞數量不同水平患者的OS曲線;B:CD8+T細胞數量不同水平患者的OS曲線;C:CD4+T/CD8+T不同水平患者的OS曲線

3 討論

惡性腫瘤的發生、發展及預后與機體免疫功能密切相關,在以細胞免疫為主的抗腫瘤免疫中,T淋巴細胞通過功能各異的亞群在抗腫瘤作用中發揮免疫調控作用。CD3+分子是成熟T淋巴細胞表面的共有標志,T淋巴細胞亞群主要包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、調節性T細胞(Treg細胞)等[2]。CD4+分子表達在輔助性T細胞(Th)和誘導性T細胞(Ti)表面,通過直接和間接的方式參與介導其他的免疫細胞發揮活性,幼稚 CD4+T 細胞被抗原提呈細胞(APC)刺激后激活并分化為輔助T 細胞,通過分泌多種細胞因子調控體液、細胞免疫反應發揮抗腫瘤作用[3]。CD8+分子多表達在具有調節效應的抑制性T細胞(Ts)和具有殺傷作用的細胞毒T細胞(Tc)表面,幼稚CD8+T 細胞通過與APC結合,刺激活化為具有細胞毒性功能的殺傷細胞,并伴隨分泌絲氨酸酯醇、穿孔素等殺傷腫瘤細胞[4],CD8+T細胞還可以通過釋放腫瘤壞死因子及干擾素等細胞因子間接殺死靶細胞[5]。CD4+T/CD8+T的變化代表著T淋巴細胞亞群水平的變化,是反映機體免疫功能紊亂的敏感指標。據報道,CD4+T、CD8+T細胞與胃癌預后相關,已被推薦用于預后預測和療效評估[6]。

紫杉醇是從紫衫樹皮中提取分離的新型抗微管藥物,通過與游離微管蛋白結合,組裝成穩定的微管,抑制微管解聚,抑制腫瘤細胞有絲分裂,單獨或聯合其他藥物治療晚期胃癌顯示出顯著的抗腫瘤活性[7]。臨床上,以紫杉醇為基礎的化療多作為晚期胃癌的二線及以上方案。紫杉醇單藥方案通常為每3周給藥1次,每次劑量為(200～225)mg/m2,ORR為17%～28%,中位生存時間為8個月左右[8]。Koizumi等人[9]在以氟尿嘧啶為基礎的化療期間,給病情進展的胃癌患者以紫杉醇(二線)治療,有效率為17.5%,疾病控制率為70.0%,中位PFS為111天。本研究中觀察到40例患者經紫杉醇(二線)治療的有效率為17.5%,疾病控制率為 52.5%。研究表明[10],紫杉醇在直接殺傷腫瘤細胞的同時,還能對包括效應性T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、調節性T細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞發揮調節作用。有研究發現[11],與順鉑單藥治療相比,順鉑+紫杉醇對細胞毒性T淋巴細胞的上調作用更強,并降低調節性T細胞的數量,從而增加抗腫瘤細胞因子(IL-1和IFN-γ)釋放,增強抗腫瘤作用。目前,免疫聯合化療被證實可提高胃癌治療療效。但紫杉醇以無水乙醇或者蓖麻油作為溶劑,為防止過敏反應,輸注之前需要激素預處理,考慮到糖皮質激素對T細胞功能的潛在抑制作用,是否會抑制機體免疫功能影響抗腫瘤治療療效尚無定論。

對Keynote-407的研究[12]發現,在轉移性鱗狀非小細胞肺癌患者中,無論是需要激素預處理的紫杉醇還是無需激素預處理的白蛋白結合型紫杉醇,與帕博利珠單抗聯用時患者客觀緩解率無顯著差別。對Keynote-355的研究[13]也發現,紫杉醇用藥前的激素預處理并沒有影響帕博利珠單抗的免疫治療效果。從本研究可以看到,經紫杉醇化療后外周血CD4+T、CD8+T細胞數量略高于化療前,雖無統計學意義,但說明化療前激素應用并沒有抑制外周血CD4+T、CD8+T細胞,提示紫杉醇可能為免疫聯合化療治療胃癌的優選藥物。本研究看到化療前外周血CD4+T、CD8+T細胞數量越高其化療效果越好,化療前外周血CD4+T/CD8+T越高的患者其PFS越長。因此,通過檢測外周血T細胞數量和比值,可以初步了解胃癌患者機體免疫狀態、評估患者對化療的反應和對PFS的影響。但是本研究具有單臂設計、入組樣本量小的局限性,同時由于臨床樣本異質性較大,下一步需要在更大范圍的臨床研究中進一步去探索驗證,以確定研究結果的可靠性,并動態檢測外周血CD4+T、CD8+T細胞數,延長總生存期的隨訪時間,為晚期胃癌化療藥物選擇提供一定的依據。