原發性腦干損傷致死大鼠的腦干組織代謝組學分析

蘇秦，陳倩玲，吳偉斌，向青青，楊成梁，喬東訪，李志剛

1.廣州市刑事科學技術研究所 法醫病理學公安部重點實驗室，廣東 廣州 510442；2.中山大學中山醫學院法醫系，廣東 廣州 510080；3.南方醫科大學法醫學院，廣東 廣州 510515

腦干損傷是指對中腦、腦橋或延髓造成的損傷，是顱腦損傷中最危重的類型之一，起病急，病情進展快，預后差。腦干網狀結構是維持意識的重要結構，因此，腦干損傷后常常發生意識障礙甚至死亡。原發性腦干損傷（primary brain stem injury，PBSI）在所有記錄的顱腦損傷中約占2%，死亡率卻高達70%[1]。PBSI包括腦干橫斷、挫傷、彌漫性軸索損傷和水腫[2]。在法醫實際工作中，常遇到頭面部遭受暴力后迅速死亡的案例，尸體檢驗（包括心傳導系統檢查）時，通常找不到或僅在顯微鏡下發現腦干有輕微、散在的小灶性出血，這給暴力致腦干損傷死亡的診斷帶來困難[3-4]。此外，在PBSI 致死過程中，原發病灶和后續腦外傷并存，相互影響，對死因鑒定造成干擾，直接影響案件的定性，給刑事辦案帶來困難[5]。PBSI 的死因鑒定尚未建立明確、客觀的診斷依據，目前主要借助于形態學方法，結合外傷史，在排除其他死亡原因的前提下得出鑒定意見[6]。因此，PBSI 的死因鑒別診斷仍是法醫病理鑒定實踐中的重點和難點。

隨著社會法律意識與證據意識的提高，法醫病理學者必須從新的切入角度來進行PBSI 的死因鑒別診斷。代謝組學分析被運用于死因鑒別和死亡時間鑒定中，并取得了較好的效果[7-9]。本研究擬對比PBSI與其他死因，如非腦干腦損傷致死或剪頭處死的大鼠尸體腦干代謝組的變化規律，尋找代謝標志物，提出可用于診斷腦干損傷的生理病理學依據。

1 材料與方法

1.1 PBSI 大鼠模型的構建與評價

將72 只7 周齡、體質量約250 g 的雄性SD 大鼠（廣東至遠生物醫藥科技有限公司）隨機分為PBSI組、非腦干腦損傷組和對照組（剪頭處死），每組24 只。

PBSI 組大鼠于麻醉誘導箱中以3%異氟烷誘導麻醉，至角膜反射消失后取出，2%異氟烷維持麻醉。待大鼠頭頂部備皮后進行碘附消毒，采用改良的Marmarou 模型進行動物建模（圖1A）[10]，新模型舍棄了緩沖墊，以張力極小的錫箔紙保持鼠頭與身體水平，保證打擊后頭部繞矢狀面旋轉90°做角加速運動，更符合腦干損傷（創傷性軸索損傷）的損傷機制。具體步驟：沿中線切開頭皮，暴露骨膜，將不銹鋼墊片（直徑1 cm、厚2 mm）用組織膠水固定于頂骨矢狀縫中間（圖1B），隨后撤離麻醉劑，待大鼠稍微清醒后將其俯臥固定于海綿墊上，將質量為250 g 的不銹鋼圓柱體自2 m 高度自由下落，撞擊大鼠顱頂部不銹鋼墊片使其頭部產生快速過屈運動，且圓柱體打擊后不產生反彈。大鼠遭到打擊后迅速進入昏迷狀態，相繼于1 h內死亡。對于非腦干腦損傷組大鼠，除了將不銹鋼墊片固定于額骨中間（圖1C）外，其他操作同PBSI 組，經處理后的大鼠也相繼于1 h 內死亡。對照組大鼠在麻醉后僅進行備皮消毒和切開頭皮的處理，并于1 h 后剪頭處死，剪斷位置為頸椎處。

圖1 大鼠模型的構建Fig.1 Construction of rat models

將3 組大鼠尸體全部放置在室溫條件下（溫度25～27 ℃，濕度50%～55%），并于死后6 h 從每組隨機取8 只大鼠提取腦干組織。將剩余48 只大鼠尸體轉移至0～4 ℃環境中，分別于死后1 d 和3 d 提取腦干組織，每組每個時間點8 只。

為評價構建的大鼠模型，取出大鼠全腦，沿正中矢狀面對半切開后，取一半腦干組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，之后以切面為包埋面進行常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，并將蠟塊連續切片（5 μm），分別進行常規HE 染色和甘氨酸銀染色。

本研究涉及動物的實驗均通過廣東至遠生物醫藥科技有限公司動物倫理學委員會的審查（審批文號：IAEC-2022022301）。

1.2 樣本收集與處理

將切取的另一半腦干組織分裝于無菌袋（4 cm×4 cm）中，經液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱中保存。每份樣本取120 mg組織進行液氮研磨，加入120 μL 50%甲醇溶液后充分混勻，提取樣品中的代謝物?；靹蛭锍仂o置10 min 后轉移至-20 ℃條件下過夜以沉淀樣品中的蛋白質。4 000×g離心20 min，取上清液代謝物提取液至96 孔板用于上機檢測，其中每個樣品等量取出10 μL 稀釋液進行混合，形成質量控制樣品，用于檢測檢驗方法的穩定性。

1.3 LC-MS 檢測

用UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）分離色譜。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；英國Waters公司）反相分離，柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min；流動相A 為水溶液（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫條件設置為：0～0.5 min 5%B，0.5～7.0 min 5%B～100%B，7.0～8.0 min 100%B，8.0～8.1 min 100%B～5%B，8.1～10 min 5%B。上樣量為4 μL。

1.4 數據前處理

使用MSConvert 軟件（美國ProteoWizard 公司）將下機的原始數據轉換成可讀數據mzXML 文件，再利用R 4.1.2軟件（https://www.r-project.org/）和XCMS 3.4.1 包對代謝物離子峰進行提取和質量控制。通過R 軟件和CAMERA 3.4.1 包以及Compound Discoverer 3.1.0 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分別對提取到的物質進行加和離子分析和物質注釋（HMDB數據庫，https://hmdb.ca），將二級質譜信息與代謝物標準品本地數據庫（杭州聯川生物技術股份有限公司）進行匹配。經K-最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）算法補充缺失值，概率商歸一化（probabilistic quotient normalization，PQN）算法對樣品數據歸一化處理，利用質量控制樣品進行質量控制-魯棒樣條校正（quality control-robust spline correction，QC-RSC），去掉不穩定代謝物。

1.5 統計分析

采用R 軟件MetaX 1.4.16 包進行偏最小二乘-判別分析法（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA），計算R2（表示模型解釋能力）和Q2（表示模型預測能力），若均高于0.5，表明模型的解釋率和預測率均較好[11]。同時利用MetaX 1.4.16 包以變量投影重要性（variable important in projection，VIP）評分≥1.0作為篩選條件篩選組間變化顯著的代謝標志物[12]，同時進行交叉驗證，并繪制置換檢驗圖。通過R 軟件VennDiagram 1.7.1包繪制韋恩圖。利用R軟件random-Forest 4.7-1 包進行隨機森林建模，首先采用Bootstrap方法對數據集進行抽樣，每次抽取每組總體樣本的75%作為訓練集對樣本進行分類，另外25%的數據（稱為袋外數據）作為測試集用于估計隨機森林的分類誤差和計算變量的重要性。隨機森林建模時將樹的個數和每棵樹包含的特征個數分別設置為500 和3。隨后利用R 軟件randomForest 4.7-1 包建立的模型對測試集進行預測。利用R 軟件pROC 1.18.0 包進行受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線繪制。

2 結果

2.1 PBSI 模型評估

HE 染色結果顯示：對照組大鼠額葉、腦室和腦干組織形態結構正常，未見明顯病理改變；非腦干腦損傷組大鼠可見全腦蛛網膜下腔出血，實質內神經元及血管周圍間隙擴大，側腦室和第三腦室出血，額葉實質內散在點片狀出血；PSBI 組大鼠可見程度不一的蛛網膜下腔出血，實質內神經元及血管周圍間隙增寬，側腦室、第三腦室和第四腦室出血，延髓實質內見多處灶狀出血（圖2）。甘氨酸銀染色結果顯示：對照組和非腦干腦損傷組大鼠腦干組織軸索排列整齊，走行正常，而PSBI 組大鼠腦干軸索排列紊亂，彌漫性斷裂、腫脹、扭曲呈蚯蚓狀，間隙增寬（圖3）。上述結果表明，PBSI 模型構建成功。

圖2 不同死因大鼠腦組織的病理學改變（HE 染色）Fig.2 Pathological changes of rat brain tissues with different causes of death（HE staining）

圖3 不同死因大鼠腦干組織的病理學改變（甘氨酸銀染色）Fig.3 Pathological changes of rat brain stem tissues with different causes of death（Silver staining）

2.2 不同死因大鼠腦干組織的代謝物鑒定

3 組大鼠共檢測到1 597 種代謝物，包括有機酸及其衍生物（29.34%），脂質和類脂分子（25.55%），雜環化合物（13.08%），苯類化合物（9.17%），有機氧化物（8.19%），苯丙酸類和聚酮化合物（4.77%），核苷（酸）及其類似物（3.55%），有機氮化物（2.81%）及其他（3.55%）。

2.3 基于PLS-DA 的差異代謝物分析

PLS-DA 被用于確定區分3 個死因模型中腦干的差異代謝物，利用1 597種代謝物中能被注釋到HMDB數據庫的818 種代謝標志物進行分析。死后6 h，3 種死因大鼠的腦干組織PLS-DA 結果顯示，R2和Q2分別為0.94 和0.81，死后1 d 大鼠腦干組織的R2和Q2分別為0.92 和0.65，死后3 d 大鼠腦干組織的R2和Q2分別為0.92 和0.69（圖4），且同一死因的樣本緊密聚合在一起，表明同一方式處理的樣本重復性良好。在3 個時間點的樣本中，PBSI 組和對照組均能明顯分離，而PBSI組和非腦干腦損傷組僅在死后6 h能有效分離，而在死后1 d和3 d存在部分重疊。對模型的質量進行交叉驗證，置換檢驗結果顯示Q2均＜0，表明模型不存在過擬合的情況，基于此獲得的差異代謝物準確（圖5）。

圖5 不同死因大鼠死后不同時間點腦干組織OPLS-DA 的置換檢驗（200 次）結果Fig.5 Permutation test results（200 times）of OPLS-DA of rat brain stem tissues with different causes of death at different time points after death

同時通過計算VIP 衡量各代謝物表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助代謝標志物的篩選。結果顯示，死后6 h、1 d 和3 d 大鼠腦干組織的代謝標志物分別為285、281 和301 種。通過韋恩圖分析發現，死后3 個時間點大鼠腦干組織共有的代謝標志物為86 種（圖6）。

圖6 死后6 h、1 d 和3 d 大鼠腦干組織代謝標志物的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of metabolic markers in rat brain stem tissues at 6 h，1 d and 3 d after death

2.4 基于隨機森林的差異代謝物分析

為了從死后3個時間點大鼠腦干組織共有的86種代謝標志物中找到最具有組別區分效應的代謝物，將72 個樣本的86 種代謝標志物的豐度信息構建數據集，從各組各時間點大鼠樣本中隨機抽取6 個樣本構成訓練集（共54個樣本），其余樣本構成測試集（共18個樣本），進行隨機森林模型構建和預測。通過對測試集數據進行預測，發現其準確率為83.3%（圖7A，表1）。其中：對照組均預測正確；非腦干腦損傷組存在2 個預測錯誤，其中1 個被預測成對照組，另1 個被預測成PBSI 組；PBSI 組中有1 個被錯誤預測成非腦干腦損傷組。

表1 86 種代謝標志物和818 種代謝標志物進行隨機森林建模的預測結果Tab.1 Prediction results of random forest modeling using 86 metabolic markers and 818 metabolic markers（個）

圖7 86 種代謝標志物的隨機森林模型構建結果Fig.7 Construction results of random forest model for 86 metabolic markers

對隨機森林中變量的重要性進行計算，結果（圖7B）顯示，占據前10 的分別為HMDB0038126［京尼平苷酸（genipinic acid，GA）］、HMDB0037386｛（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯［（S）-menthone 8-thioacetate］}、HMDB0059773［S-3-氧代癸酰半胱胺（S-3-oxodecanoyl cysteamine）］、HMDB0013272［N-月桂酰甘氨酸（N-lauroylglycine）］、HMDB0029365［阿魏酰酪胺（moupinamide）］、HMDB0040551［L-α-氨基-1H-吡咯-1-己 酸（L-alpha-amino-1H-pyrrole-1-hexanoic acid）］、HMDB0029427［L-次甘氨酸A（L-hypoglycin A）］、HMDB0005199｛（R）-去甲豬毛菜堿［（R）-salsolinol］}、HMDB0013645［N，N-二甲基鞘氨醇（N，Ndimethylsphingosine）］和HMDB0001008［膽綠素（biliverdin）］。其中，與對照組和非腦干腦損傷組相比，在PBSI 組顯著上調的代謝標志物分別為HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0013272（N-月桂酰甘氨酸）、HMDB0005199［（R）-去甲豬毛菜堿］和HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇），見圖8。

圖8 15 種代謝標志物在不同死因大鼠腦干組織中的相對表達量Fig.8 Relative expression levels of 15 metabolic markers in the rat brain stem tissues with different causes of death

此外，為了排除PLS-DA 篩選結果對隨機森林模型構建的影響，將72 個樣本的818 種代謝標志物的豐度信息構建數據集，進行隨機森林模型構建和預測（訓練集為54 個樣本，測試集為18 個樣本）。模型對測試集數據的預測準確率為88.9%（圖9A，表1）。變量的重要性排序中，占據前10 的為HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0041907［咪達普利（imidapril）］、HMDB0014843［地拉 韋啶（delavirdine）］、HMDB0040551（L-α-氨基-1H-吡咯-1-己酸）、HMDB0030814（Mammea E/BB）、HMDB0033272（dihydroclusin）、HMDB0029365（阿魏酰酪胺）、HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇）、HMDB0037386［（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯］和HMDB0062769［ε-己內酰胺（epsilon-caprolactam）］，見圖9B。其中HMDB0041907（咪達普利）、HMDB0014843（地拉韋啶）、HMDB0030814（Mammea E/BB）、HMDB0033272（dihydroclusin）和HMDB0062769（ε-己內酰胺）均在非腦干腦損傷組中高表達（圖8），另外5 種代謝標志物與利用PLS-DA 篩選出來的86 種代謝標志物進行隨機森林建模變量的重要性占據前10 的代謝標志物重疊。

圖9 818 種代謝標志物的隨機森林模型構建結果Fig.9 Construction results of random forest model for 818 metabolic markers

3 討論

本研究采用LC-MS 檢測了大鼠3 種死因所致的腦干代謝組變化，基于PLS-DA 分析篩選出86 個VIP值≥1.0 的代謝標志物或直接用818 種代謝標志物進行數據分析，基于隨機森林算法構建最佳的死因鑒別模型，并對這些代謝標志物在模型中的重要程度進行排序，最終發現HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0037386［（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯］、HMDB0041907（咪達普利）等15 種代謝標志物起到重要的作用。

HMDB0038126（京尼平苷酸）最早于1964 年被發現[13]，通常在飲料和水果中被檢測到。京尼平苷酸屬于環烯醚萜類，可有效抑制小膠質細胞釋放一氧化氮，減少細胞中白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2 的產生，從而抑制細胞炎癥、保護神經元[14-15]。CHEN 等[16]研究發現，京尼平苷酸可上調神經突生長標志物，包括微管相關蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP2）和生長相關蛋白43（growth associated protein 43，GAP43），從而促進神經突生長。此外，京尼平苷酸還可以作為降壓活性成分發揮作用[17]。在PBSI 中，腦干組織損傷所引起的局部反應主要表現為細胞膜破壞，活性氧類物質和胞質內游離鈣增多，缺氧，化學毒害和遺傳物質變異等幾方面，而京尼平苷酸可以保護神經元不受氧化應激等誘導的細胞毒性的影響，抑制細胞炎癥，促進小膠質細胞降解和清除異常蛋白并促進神經元軸突再生[18]。因此，京尼平苷酸的生物學功能與本研究觀察到的結果即PBSI 致腦干組織中出現京尼平苷酸上調是一致的。但由于京尼平苷酸可能是大鼠通過食物攝取進入體內的物質，不屬于體內固有的代謝產物，其重要性有所削弱，在后續甄別應用中應加以注意。

HMDB0013272（N-月桂酰甘氨酸）被發現可作為診斷肝硬化的代謝組學生物標志物[19]，在肝硬化患者體內其豐度顯著提高[20]。HMDB0005199［（R）-去甲豬毛菜堿］是一種兒茶酚異喹啉類化合物，是多巴胺神經毒素｛N-甲基（R）-去甲豬毛菜堿［N-methyl-（R）-salsolinol］｝的前體[21]，其合成水平受腦組織中多巴胺和乙醛濃度的影響。研究[22]表明，（R）-去甲豬毛菜堿可激活蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B-mammalian target of rapamycin，AktmTOR）信號通路來調節細胞內的自噬水平，從而引發神經毒性。HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇）是一種神經性疼痛誘導劑，可通過上調神經生長因子活性誘發神經性疼痛樣行為[23]。結合本研究的結果，表明（R）-去甲豬毛菜堿和N，N-二甲基鞘氨醇的上調可能是由于PBSI 的應激作用引起。在代謝物重要性排序前10 中還有其他代謝物，目前雖暫不清楚其在PBSI 致死過程中的具體作用，但也提示其與PBSI致死相關。

此外，本研究利用隨機森林算法進行死因識別建模，模型準確率最高達88.9%，這可能是由于每個死因組別中包含了死后6 h、1 d 和3 d 的樣本，而樣本中的代謝物水平會隨著時間的變化而發生變化。若有足夠的樣本量來進行單個時間點的建模，相信預測準確率將有所提高。此外，兩種隨機森林模型的結果表明，基于所有代謝物建模的效果更好，這可能是由于PLS-DA 與隨機森林算法對變量的篩選過程存在差異，利用更多變量進行隨機森林建模，可提高模型預測的準確性。當然，本研究主要是基于大鼠模型，若在實際案例中，則需要使用人類尸體樣本重新建模。

綜上所述，本研究對PBSI、非腦干腦損傷和對照（剪頭處死）組死后6 h、1 d 和3 d 的大鼠腦干組織樣本進行了代謝組學分析，基于PLS-DA 和隨機森林算法，成功建立了死因識別模型，并鑒定出與PBSI 相關的代謝標志物——京尼平苷酸、N-月桂酰甘氨酸、（R）-去甲豬毛菜堿和N，N-二甲基鞘氨醇，為法醫學實踐中腦干相關的死因鑒別提供了一定的參考。