UPLC-MS/MS 快速測定血液中布桂嗪

高章明，石景瑜，曾皓，張學軍

1.上饒市公安局物證鑒定中心，江西 上饒 334000；2.上饒市廣信區人民醫院藥劑科，江西 上饒 334100；3.江西省公安廳毒品檢驗鑒定中心，江西 南昌 330000

布桂嗪又名強痛定、AP-237，化學名稱為1-正丁?；?4-肉桂基哌嗪，英文名bucinnazine，屬于國家管制的麻醉藥品。1968 年，日本杏林制藥員工ITO 等首次報道了布桂嗪的合成[1]。布桂嗪是一種速效、強效的鎮痛藥，屬于阿片類鎮痛藥物，鎮痛作用是嗎啡的1/3、氨基比林的4～20 倍[2]，主要對皮膚、黏膜、運動器官（包括關節、肌肉、肌腱等）的疼痛有明顯的抑制作用，是目前我國治療癌癥以及相關慢性疼痛的首選鎮痛藥，在臨床上適用于偏頭痛、三叉神經痛、癌性疼痛等。布桂嗪連續超劑量使用可致耐受和成癮，容易引起濫用，過量則可導致中毒死亡。目前，在歐美已出現布桂嗪作為新型毒品濫用的勢頭[3]，在國內也有使用布桂嗪成癮的案例報道[4-6]，因此，建立高效、準確的布桂嗪檢測方法對日常涉毒案件的偵破和臨床治療都具有十分重要的意義。

對血液中布桂嗪的檢驗，常見的前處理方式主要有液液萃?。╨iquid-liquid extraction）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、基質固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD）萃取等[7-8]。其中，液液萃取方法需要手動操作，過程繁瑣，耗時長，目標物回收率偏低且需要消耗大量有機溶劑，容易對環境造成污染；SPE 和MSPD 萃取方法的檢驗成本較高，方法開發較為復雜。布桂嗪常見的分析方法有GC、GC-MS和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等[7-10]。GC 和HPLC 易受樣品中復雜基質的干擾，導致定性不準確。GC-MS方法靈敏度較低，容易漏檢。面對布桂嗪濫用案件的逐漸增加，亟須建立一種檢驗效率高、成本低、專屬性強的方法。本研究擬通過優化的沉淀蛋白法，并結合超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）特異性強、分析時間短、靈敏度高、重現性好等優點，建立血液中布桂嗪的UPLC-MS/MS 快速測定方法，并應用于實際案例，為司法案件提供準確快速的鑒定意見。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LCMS-8050 三重四極桿液相色譜質譜聯用儀（日本島津公司），配電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；Milli-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）；RG-165AT 高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DHG-9075A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

布桂嗪標準品（0.1 mg/mL，美國Cerilliant 公司），嗎啡-d3（純度≥98.0%，美國Sigma 公司），甲醇、乙腈（色譜純，美國Honeywell 公司），甲酸、乙酸銨（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），0.22 μm 混合纖維素酯濾膜［島津（上海）實驗器材有限公司］。

1.2 標準工作溶液的配制

根據實驗需要，用甲醇稀釋布桂嗪標準品溶液得到質量濃度為1 μg/mL 的標準工作溶液。嗎啡-d3用甲醇稀釋成質量濃度為1 μg/mL 的內標工作液。將上述標準品溶液密封后置于冰箱中-20 ℃冷凍保存。

1.3 樣品前處理

本研究使用沉淀蛋白法對血液樣品進行前處理，分別考察乙腈溶液和甲醇溶液的沉淀效果，乙腈溶液的比例為100%乙腈、80%乙腈水溶液、50%乙腈水溶液，甲醇溶液的比例為100%甲醇、80%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液。

取空白血液加入布桂嗪標準工作溶液，配制質量濃度為20、50、80 μg/L 的系列血液樣品，取100 μL 上述3 種質量濃度的血液樣品分別置于2 mL 具塞離心管中，加入1 μg/mL 嗎啡-d3內標工作液5 μL，再加入900 μL 上述不同比例的甲醇和乙腈，渦旋混勻1 min后，14 800×g，高速離心5 min，取上清液，過0.22 μm混合纖維素酯濾膜，平行進樣 3 次。

1.4 儀器條件

液相色譜條件：Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2 μm；日本島津公司），柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min。在流動相的選擇方面，本研究考察0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈、5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇4 種流動相，使用梯度洗脫。洗脫程序：初始流動相為10%B，0～3.0 min 10%B～28%B，3.0～5.0 min 28%B～100%B，5.0～7.0 min 100%B，7.0～7.01 min 100%B～10%B，7.01～8.0 min 10%B?？偛蓸訒r間為8.0 min，進樣量為5 μL。

質譜條件：在電噴霧正離子模式下進行多反應監測掃描；霧化器流速3 L/min，加熱器流速10 L/min；接口溫度300 ℃，加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流速10 L/min。經優化后得到的布桂嗪質譜參數見表1。

表1 布桂嗪和內標嗎啡-d3的質譜參數Tab.1 Mass spectrum parameters of bucinnazine and morphine-d3

1.5 方法學驗證

1.5.1 選擇性

6 個不同來源的空白血液樣品按1.3 節方法處理后進行UPLC-MS/MS 分析，觀察血液中內源性物質對布桂嗪和嗎啡-d3的檢測是否存在干擾。

1.5.2 線性關系、檢出限和定量限

取空白血液100 μL于2 mL具塞離心管中，加入布桂嗪標準工作溶液，配制質量濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L 的系列血液樣品，按1.3 節方法進行前處理后，按1.4 節條件進行分析，使用內標法定量，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。以信噪比（S/N）≥3 時的樣品質量濃度為檢出限，以信噪比（S/N）≥10 時的樣品質量濃度為定量限。

1.5.3 基質效應

基質效應是指樣品中除目標物以外的物質對分析結果的影響和干擾，通常表現為使目標物在儀器上的響應發生增強或抑制。用甲醇配制質量濃度為1、10和100 μg/L 的布桂嗪標準工作溶液進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積為S1。6 份不同來源的空白血液樣品基質提取液添加相應的布桂嗪標準工作溶液進行UPLC-MS/MS 分析，記錄峰面積為S2。以S2與S1的比值評價基質效應。

1.5.4 回收率

取空白血液100 μL 于2 mL 具塞離心管中，加入布桂嗪標準工作溶液，分別配制質量濃度為1、10 和100 μg/L 的布桂嗪血液樣品，每個質量濃度6 份樣品，按1.3 節方法進行前處理后，按1.4 節條件進行分析，記錄峰面積為S3。以S3與S2的比值計算回收率，回收率需滿足日常案件檢驗需要[11]。

1.5.5 準確度和精密度

依據《法醫毒物分析方法驗證通則》（SF/T 0063—2020）[12]計算準確度、日內精密度和日間精密度，準確度用偏倚（%）表示，日內和日間精密度均用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

取空白血液100 μL于2 mL具塞離心管中，加入布桂嗪標準工作溶液，分別配制低（1 μg/L）、中（10 μg/L）、高（100 μg/L）3 個質量濃度的血液樣品，每個質量濃度6 份樣品，按1.3 節方法進行前處理后，按1.4 節條件進行分析，連續測定3 d，計算測定結果的準確度。將上述3 種質量濃度的血液樣品于1 d 內分析6 次，得日內精密度；連續測定3 d，得日間精密度。所得結果需滿足體內樣品分析要求[13]。

1.5.6 穩定性

針對血液樣品在不同溫度下的保存情況，設計血液中布桂嗪的長期穩定性實驗。取空白血液100 μL于2 mL 具塞離心管中，加入布桂嗪標準工作溶液，分別配制低（1 μg/L）、高（100 μg/L）兩個質量濃度的血液樣品各24 份，分為4 組，每組包含低、高質量濃度血液樣品各6 份，分別置于-25、0、25、50 ℃下保存10 d，于第5 天、第10 天各取樣3 份，與新配制的低、高質量濃度血液樣品同時按1.3 節方法處理后進行測定，所得準確度用偏倚（%）表示，偏倚在±15%以內，表明目標物在一定時間內可以穩定保存[12]。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

實驗結果表明，相同比例下，乙腈溶液提取的回收率比甲醇溶液高，在考察的3 種比例乙腈溶液中，80%乙腈水溶液回收率最高，提取效果最好。而使用100%乙腈提取時，渦旋混合后血液不能完全散開，容易凝成小球，影響回收率。最終選擇80%乙腈水溶液作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優化

對4 種流動相進行考察，結果發現：選擇乙腈為有機相時，布桂嗪的峰形和分離效果比甲醇好。在水相中加入少量乙酸銨，增強流動相極性，緩沖流動相pH 值，可進一步提高目標物的離子化效率。最終選擇5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈為流動相用于布桂嗪的分析，分析結果顯示：布桂嗪峰形穩定，沒有出現拖尾峰或前沿峰。布桂嗪和內標嗎啡-d3的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 布桂嗪和嗎啡-d3的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of bucinnazine and morphine-d3

2.3 方法學驗證

2.3.1 選擇性

實驗結果表明，6 個不同來源血液樣品中的內源性物質對布桂嗪和嗎啡-d3無干擾，該方法選擇性良好。

2.3.2 線性關系、檢出限和定量限

布桂嗪在0.5～200 μg/L 范圍內線性關系良好。血液樣品加標后所得線性方程為y=0.023x+0.025，相關系數（r）為0.999 7，檢出限為0.1 μg/L，定量限為0.5 μg/L。

2.3.3 基質效應

布桂嗪在血液中的基質效應為69.4%～73.8%（表2），血液中的基質對目標物有抑制作用，基質效應較為明顯，所以本方法選擇使用內標嗎啡-d3來減少基質效應帶來的影響。

表2 布桂嗪在血液中的基質效應、回收率、準確度和精密度Tab.2 Matrix effect，recovery，accuracy and precision of bucinnazine in blood （%）

2.3.4 回收率

血液中布桂嗪在3 個添加質量濃度（1、10、100 μg/L）的回收率見表2，回收率在78.3%～83.8%。

2.3.5 準確度和精密度

研究結果（表2）表明，本方法的準確度在3.1%～3.5%，日內精密度在1.9%～2.8%，日間精密度在2.8%～3.2%，日內和日間精密度均小于5%。

2.3.6 穩定性

研究結果（表3）表明，低質量濃度血液樣品的穩定性低于高質量濃度血液樣品。血液中布桂嗪在-25 ℃下保存時，低質量濃度血液樣品的準確度（偏倚）在±4.5%范圍內，高質量濃度血液樣品的準確度（偏倚）在±3.0%范圍內，穩定性均較好。在0 ℃下保存時，血液樣品的準確度（偏倚）均在±8.6%范圍內，較為穩定。在25 ℃和50 ℃下保存10 d 后，高質量濃度血液樣品的準確度（偏倚）分別為±24.7%和±49.9%，均大于±15%。由此可見，在常溫和高溫下目標物不能長時間穩定保存，存儲溫度的升高會加速血液中布桂嗪的分解，所以對于血液樣品的保存，建議短期冷藏、長期冷凍。

表3 布桂嗪在血液中的準確度（偏倚）Tab.3 Accuracy（bias）of bucinnazine in blood（n=3，%）

2.4 案例應用

某年12 月，一男子被發現死于家中，現場提取了死者的血液送檢，由于受到設備的限制，僅在死者血液中檢出芬太尼和利多卡因成分。4 年后，實驗室將當年的血液再次解凍，使用本研究方法在血液中檢出了芬太尼、利多卡因和布桂嗪成分（圖2），其中布桂嗪質量濃度為22.8 μg/L、芬太尼質量濃度為40.2 μg/L、利多卡因質量濃度為88.9 μg/L。

圖2 實際樣品的多反應監測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatogram of practical sample

布桂嗪成人的用量為1次30～60 mg口服（每日3次）或者1 次50 mg 皮下或肌內注射（每日1～2 次），對于慢性中重度癌性疼痛患者，劑量可逐漸增加且第一次及總量可以不受常規劑量的限制[14]，所以會造成布桂嗪在血液中的治療濃度范圍較大。YU 等[15]的研究結果顯示，大鼠布桂嗪的亞致死量為1.0 g/kg；FOGARTY等[16]報道的4 例患者死后血液中布桂嗪的質量濃度范圍為820～5 800 μg/L。本例死者血液中布桂嗪含量遠未達到文獻所報道的質量濃度，分析有以下兩個原因：（1）死者生前存在多種藥物濫用，有可能是多種藥物間的協同作用導致死亡；（2）從藥物穩定性方面分析，雖然檢材長期在-25 ℃下保存，但存儲時間過長，布桂嗪在血液中緩慢分解，導致測定的含量偏低。

3 結論

本研究通過優化前處理中的乙腈沉淀蛋白法與UPLC-MS/MS 條件，針對血液中的布桂嗪進行快速定性定量分析，具有取樣量小、前處理過程簡單高效、重現性好、儀器分析靈敏度高等優勢，該方法的定量限可達0.5 μg/L，且檢材在-25 ℃下冷凍保存可保證布桂嗪在血液中的穩定性。本方法在司法鑒定領域針對布桂嗪濫用的快速定性定量以及臨床藥物濃度監測方面有較高的應用價值。