管氏腫腿蜂毒液過敏原3基因的克隆及表達分析

汪斌偉,樊曉紅,吳朝妍,朱家穎

(西南林業大學生物多樣性保護學院,云南省森林災害預警與重點實驗室,昆明 650224)

膜翅目昆蟲作為種類繁多的有毒動物類群之一,其毒液含有豐富多樣的蛋白和多肽(Beckage and Gelman,2004;Danneelsetal.,2010;Diasetal.,2014)。其中,大多數社會性膜翅目昆蟲的毒液能引起過敏反應,特別是對于敏感人群(Bilò,2011;Wormetal.,2014)?，F有研究表明,社會性膜翅目昆蟲毒液內含的磷脂酶A(Phospholipase A)、透明質酸酶(Hyaluronidase)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)、抗原5(Antigen 5)等是導致人類過敏的致敏成分(Mǜller,2002;Spillneretal.,2014)。例如,胡蜂Polybiapaulista毒液磷脂酶A1能水解sn-1位的1, 2-二?；?3-甘油磷脂的酯鍵,將這些底物轉化為相應的溶質化合物并釋放脂肪酸(Santosetal.,2007);黑腹虎頭蜂Vespabasalis磷脂酶A1能夠破壞生物膜的磷脂結構,引發嚴重的溶血,并導致動物的心功能障礙和死亡(Houetal.,2016)。

寄生蜂是一類膜翅目中的重要天敵昆蟲,毒液作為該類群的關鍵寄生因子之一,具有調控寄主生長發育、抑制寄主免疫反應、影響寄主營養代謝等生理功能,在寄主體內發揮重要作用(Beckage and Gelman,2004;Kim-Joetal.,2019;Yangetal.,2021;李麗芳等,2021)。目前,通過對隸屬繭蜂科Brcaoindae、姬蜂科Ichneumonidae、金小蜂科Pteromalidae等近10個科的20多種寄生蜂毒液組分進行鑒定(李麗芳等,2021),獲得了上百種毒液蛋白,但是僅探明了絲氨酸蛋白酶同源物、鈣網蛋白、RhoGAP等少數毒液蛋白的功能(Poiriéetal.,2014;Moreau and Asgari,2015;Wuetal.,2020;Huangetal.,2021;Quicke and Butcher,2021;李麗芳等,2021)。通過比較寄生蜂與社會性膜翅目蜂類之間的毒液組分發現,它們存在較大差異(Poiriéetal.,2014;Dashevsky and Rodriguez,2021)。如,寄生蜂毒液不像社會性膜翅目蜂類毒液一樣富含致敏蛋白成分,僅酸性磷酸酶、過敏原3(Allergen 3)等個別致敏蛋白在寄生蜂毒液中被鑒定到,且除酸性磷酸酶普遍存在寄生蜂毒液中外,其他種類的致敏蛋白僅在少數寄生蜂(如,菜蛾盤絨繭蜂Cotesiaplutellae、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis和谷象金小蜂Anisopteromaluscalandrae)中被鑒定到(許俊峰和韓召軍,2008;Dorémusetal.,2013;Perkinetal.,2015)。但是,目前尚不清楚這些寄生蜂毒液致敏蛋白的生理功能。

本文以天牛、小蠹蟲等重要蛀干害蟲的外寄生蜂—管氏腫腿蜂Sclerodermaguani為研究對象,在前期研究發現過敏原3(SgA3)為該蜂主要毒液組分之一的基礎上(Zhu,2016),通過RT-PCR擴增SgA3基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列,分析其時空表達特征,原核表達并純化SgA3重組蛋白,以期為今后進一步探究該毒液蛋白的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

管氏腫腿蜂的飼養參照Zhuetal.(2013)的方法,利用剛化蛹的黃粉蟲Tenebriomolitor作為寄主在室內進行繼代飼養,利用蘸有20%蜂蜜水的脫脂棉球飼養成蜂。

1.2 SgA3基因克隆及序列分析

取羽化1～5 d的管氏腫腿蜂雌蜂,采用Trizol法提取其總RNA。利用分光光度計和1%瓊脂凝膠電泳檢測總RNA的濃度、質量和完整性,利用逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific),參照試劑盒說明書合成cDNA模板,產物置于-20℃保存備用?；谇捌趯嶒炇覐墓苁夏[腿蜂毒液器官轉錄組數據中獲得的SgA3基因序列(Zhuetal.,2016),利用Primer Premier 5軟件(Premier Biosoft International)設計PCR引物(正向引物5′-ATGATAAGATACG CGACATACGGT-3′和反向引物5′-TTATTTTACGT GATAGATTGGTTCGCCGATCC-3′)擴增SgA3基因的ORF序列。擴增PCR體系(25 μL):cDNA模板2 μL,正反向引物各1 μL,12.5 μL dNTP,8.5 μL ddH2O。PCR擴增條件為:94℃預變性3 min,94℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸1 min,設置循環35次;72℃終延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后,測序由鉑尚生物技術(上海)有限公司完成。

使用DNASTAR 7.1(Burland,2000)對測序得到的SgA3基因序列進行拼接和翻譯,分析基因編碼蛋白的預測分子量和等電點。采用BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.)對序列進行同源比對搜索,結構域使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行預測,信號肽利用SignalP 5.0(https://services. healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預測,采用ClustalX 1.83進行多序列比對分析(Chennaetal.,2003)。

1.3 SgA3基因的表達特征分析

分別收集不同發育階段(卵、早期幼蟲、晚期幼蟲、老熟幼蟲、白繭蛹、黃繭蛹、黑繭蛹、羽化1～25 d雌蜂)的管氏腫腿蜂以及羽化1～5 d的管氏腫腿蜂雄成蟲、雌成蟲不同組織(毒液器官、卵巢、殘體)于1.5 mL離心管中,液氮冷凍處理并充分研磨后加入Trizol(Invitrogen)試劑,-80℃保存備用。每個樣品設置3個生物學重復。參照1.2的方法,提取每個樣品的總RNA,采用逆轉錄試劑盒并以總RNA為模板合成相應的cDNA。依據1.2中獲得的SgA3基因ORF序列,設計基因特異性引物(正向引物5′-CCATCTTCAAGTCCAAGTTC-3′和反向引物3′-CAACGGTAGCCAATTCATC-5′)。以18SrRNA基因作為內參(正向引物5′-TGGGCCGGTACGTTTA CTTT-3′和反向引物5′-CACCTCTAACGTCGCA ATAC-3′),采用qPCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技術,分析在不同發育階段、雄蜂以及雌蜂不同組織中SgA3基因的表達特征。qPCR反應體系(20 μL)為:Bestar?qPCR mastermix(DBIR Bioscience)10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 8 μL。qPCR反應程序為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火40 s,循環45次。

1.4 SgA3基因的原核表達

參照韓開健等(2021)的方法,運用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)方法合成含有StuⅠ和HindⅢ酶切位點的SgA3基因(韓開健等,2021),利用限制性內切酶雙酶切后依靠同源堿基互補配對,鏈接到表達載體pSUMO-Mut(南京鐘鼎生物技術有限公司)。表達載體經菌落PCR及測序驗證構建成功后,構建重組表達質粒,轉入大腸桿菌Escherichiacoli表達菌株BL21(DE3)感受態細胞中進行原核表達。表達菌株經測序驗證正確后置于LB(Lysogeny broth)培養液,37℃ 220 rpm振搖培養至菌體OD600為0.6～0.8,加入終濃度為0.5 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)再次誘導培養。取1 mL培養物離心棄上清,用100 μL PBS(Phosphate-buffered saline)緩沖液重懸菌液后離心棄上清,菌體沉淀經PBS再次重懸,對重懸液進行超聲波破碎后,離心取上清液與沉淀。利用Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱純化重組表達蛋白,將其收集后在PBS(pH7.4)中透析過夜后,加入PBS重懸。利用12% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)檢測獲得的菌液上清、沉淀中以及純化后的蛋白,考馬斯亮藍R-250進行染色,過夜保存后利用脫色液脫色處理,對凝膠進行拍照觀察并分析目標蛋白表達情況。

1.5 數據統計與分析

所獲得的數據利用Excel進行整理。依照Q-GENE法計算基因的相對表達量(Mulleretal.,2002;Simon,2003)。采用SPSS軟件進行LSD多重比較分析基因相對表達量的差異顯著性(P<0.05),并使用Graphpad prism 8軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 SgA3基因的克隆及序列分析

克隆得到長為699 bp的SgA3基因ORF序列,編碼233個氨基酸,預測相對分子量為26.18 kDa,等電點8.42。信號肽預測結果顯示,SgA3氨基酸序列N端1～23位氨基酸為信號肽序列。結構域分析發現,SgA3氨基酸序列中具有1個CAP(Cysteine-rich secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 protein)結構域,屬于半胱氨酸分泌蛋白。多序列比對分析發現,SgA3與麗蠅蛹集金小蜂、粉蝶盤絨繭蜂、紅火蟻和常見黃胡蜂過敏原3的氨基酸序列一致性分別為50.44%、50%、48.89%和47.83%(圖1)。

圖1 SgA3與其他昆蟲過敏原3的多序列比對Fig. 1 Multiple alignment of SgA3 and allergen 3 of other insects注:下劃線區域為信號肽,方框為CAP結構域,深色陰影標記的是保守位點。Sg,管氏腫腿蜂;Nv,麗蠅蛹集金小蜂(XP_031786258);Cg,粉蝶盤絨繭蜂(XP_044593958);Si,紅火蟻(XP_011165202);Vv,常見黃胡蜂(CAB42887)。Note:Signal peptide was underlined. CAP domain was indicated in box. Dark shading indicated conserved sites. Sg, Sclernderma guani; Nv, Nasonia vitripenni (XP_031786258); Cg, Cotesia glomerata (XP_044593958); Si, Solenopsis invicta (XP_011165202); Vv, Vespula vulgaris (CAB42887).

2.2 SgA3基因的表達特征分析

在不同發育階段,SgA3基因的表達量有所不同(圖2)。從黑繭蛹期開始,SgA3基因呈現高表達,其表達量顯著高于卵期和幼蟲期。SgA3基因在黑繭蛹期到5日齡成蟲之間的表達量逐漸升高,在5日齡成蟲中達到最高,在其后的成蟲階段表達量逐漸降低。

圖2 SgA3基因在不同發育階段的相對表達量Fig.2 Relative expression profiles of SgA3 gene at different developmental stages注:E,卵;EL,早期幼蟲;LL,晚期幼蟲;ML,老熟幼蟲;WP,白繭蛹;YP,黃繭蛹;BP,黑繭蛹;A1～25,羽化1～25 d的雌成蟲。數據為平均值±標準差。柱上不同字母表示不同發育階段基因相對表達量存在顯著差異。Note:E, egg; EL, early larva; LL, late larva; ML, mature larva; WP, pupa in white cocoon; YP, pupa in yellow cocoon; BP, pupa in black cocoon; A1～25, female adult after emergence 1～25 days. Data in the figure were mean±SD. Different letters above the bars indicated significant difference gene expression levels among different developmental stages.

在雌成蟲不同組織中,SgA3基因在毒液器官中高表達,在卵巢中基本不表達,毒液器官中的表達量顯著高于殘體和卵巢中的表達量(圖3)。盡管SgA3在雄成蟲中有一定的表達量,但其表達量顯著低于雌成蟲毒液器官中的表達量。

圖3 SgA3基因在不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of SgA3 gene in different tissues注:F,雌成蟲;M,雄成蟲;V,毒液器官;O,卵巢;Ca,殘體(除去毒液器官和卵巢)。數據為平均值±標準差。柱上不同字母表示不同組織中的基因相對表達量存在顯著差異。Note:F, Female adult; M, Male adult; V, Venom apparatus; O, Ovary; Ca, Carcass (without venom apparatus and ovary). Data in the figure were mean±SD. Different letters above the bars indicated significant difference gene expression levels among different tissues.

2.3 SgA3基因的原核表達

將去除信號肽的SgA3基因ORF序列插入到pSUMO-Mut原核載體中,轉化大腸桿菌后,利用IPTG進行誘導表達并純化(圖4)。SDS-PAGE電泳結果顯示,利用大腸桿菌表達得到重組SgA3融合蛋白,并且存在于沉淀中,約36 kDa。將表達標簽切除后,得到分子量與理論分子量相符的SgA3重組蛋白,約26 kDa。電泳檢測結果顯示,純化得到的為切除表達標簽后的高純度SgA3重組蛋白。

圖4 SgA3基因原核表達SDS-PAGE及Western blot檢測Fig.4 SDS-PAGE and western blot analysis of prokaryotic expression of SgA3 gene注:M,標準蛋白;1,未誘導的表達產物;2,誘導后的表達產物;3,誘導表達的沉淀;4,誘導表達的上清;5,表達標簽切除后純化的蛋白(方框內)。Note:M, Protein marker; 1, Total protein of un-induced Escherichia coli; 2, Total protein of induced E. coli; 3, Precipitate of total protein after induction; 4, Supernatant of total protein after induction; 5, Purified protein after SUMO tag been excised (in the box).

3 結論與討論

氨基酸序列分析發現,克隆得到SgA3基因氨基酸序列中具有保守的CAP蛋白結構域,所以SgA3為該家族成員(Perkinetal.,2015;Laurinoetal.,2016)。而且,信號肽分析結果顯示,SgA3氨基酸序列中存在信號肽,表明其為分泌蛋白。多序列比對分析發現,SgA3與麗蠅蛹集金小蜂、粉蝶盤絨繭蜂、紅火蟻和常見黃胡蜂過敏原3的氨基酸之間具有較高的一致性,且均屬于CAP家族蛋白,該家族成員通常具有細胞外內分泌或旁分泌功能(Kingetal.,1987;Hoffman,2006)。有研究證實,過敏原3為紅火蟻和常見胡蜂V.vulgaris毒液中的高豐度蛋白,能使人類會引起嚴重的過敏反應(Hoffmanetal.,1988;Blanketal.,2010;Potiwat and Sitcharungsi,2015)。由于SgA3以及紅火蟻和常見黃胡蜂毒液過敏原3的氨基酸序列之間高度保守,推測SgA3也能引起人類的過敏反應,但需要進一步證實。

基因表達特征結果表明,SgA3基因從成熟黑色繭中的蛹期開始逐漸呈現高表達,于成蟲5日齡時表達量最高,隨后表達量逐漸降低。該表達特征與管氏腫腿蜂抗凝血酶III、絲氨酸蛋白酶同源物等相似,表明SgA3基因的表達與毒液器官的發育密切相關(Wuetal.,2020;韓開健等,2021;李麗芳等,2021)。在不同組織中,SgA3基因在毒液器官中高度表達,再次證實前期蛋白質譜分析發現的SgA3是管氏腫腿蜂毒液中的高豐度蛋白組分(Zhu,2016)。此外,SgA3基因在雄成蟲中的表達量顯著低于毒液器官中的表達量,這是由于SgA3基因為毒液蛋白編碼基因且雄性無毒液器官所致。

本研究成功利用pSUMO-Mut載體對SgA3基因進行了原核表達,得到重組蛋白。產物經SDS-PAGE電泳結果顯示,重組表達蛋白主要存在于沉淀中。這是由于大腸桿菌表達系統不能完成SgA3重組蛋白的翻譯后修飾所致,后期需要進一步采用合適的溶液來對重組蛋白進行復性,或者采用酵母、昆蟲細胞等表達系統來進行表達,獲得可溶性的重組表達蛋白,進而開展其生理功能研究(Seismannetal.,2010;Borodinaetal.,2011)。但是,將表達標簽切除后,可以純化獲得高純度的SgA3重組蛋白,其可以用于制備抗體來進一步研究SgA3基因的表達特征,并為該毒液蛋白后續生理功能探究奠定基礎。